徐鑫梓, 王 睿, 杜雅明, 劉 欣, 邵 衛(wèi), 陳國華, 王俊力△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢 430022 2湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院,武漢 430065

神經(jīng)炎癥是指由感染、創(chuàng)傷、毒素和自身免疫反應(yīng)等引起發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng),主要表現(xiàn)為小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化,細胞因子和趨化因子的釋放[1]。大量研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)過度的炎癥反應(yīng)是阿爾茨海默病、帕金森病、抑郁癥等多種神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)精神疾病神經(jīng)元損傷的共同病理基礎(chǔ)[2-3]。LPS通過與小膠質(zhì)細胞的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)結(jié)合,觸發(fā)一系列細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng),促使小膠質(zhì)細胞向M1促炎表型轉(zhuǎn)化[4]。其中,NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎性小體是由胞質(zhì)內(nèi)模式識別受體參與組成的多蛋白復(fù)合物,在免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。雖然有部分研究關(guān)注NLRP3炎性小體激活的負調(diào)控機制,但目前關(guān)于體外抑制NLRP3對LPS活化的BV2小膠質(zhì)細胞的直接影響及其表現(xiàn)報道較少。因此,本研究以LPS誘導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細胞BV2體外炎癥模型為研究對象,通過shRNA基因干擾技術(shù)敲減細胞中NLRP3表達,進一步探討NLRP3信號通路對LPS激活下的BV2細胞炎癥損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑

LPS(來源于大腸埃希菌)購于Sigma公司;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素18(interleukin-18,IL-18)、IL-1β ELISA試劑盒購于伊萊瑞特生物科技股份有限公司;一氧化氮(nitric oxide,NO)試劑盒購于南京建成科技有限公司;小鼠源性重組離子鈣結(jié)合銜接分子1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)抗體購于Abcam公司;兔抗Arginase-1(D4E3MTM)XP?Rabbit mAb購于Cell Signaling Technology公司;NLRP3單克隆抗體購于Affinity公司;兔抗iNOS單克隆抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 選用經(jīng)鑒定合格的小鼠小膠質(zhì)細胞BV2(武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號:CL-0493),使用含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2天換液1次,培養(yǎng)至對數(shù)生長期以備用。

1.2.2 NLRP3 shRNA載體構(gòu)建 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)提供的NLRP3的mRNA核苷酸序列(NM_001359638.1),設(shè)計3條siRNA干擾序列片段和1條陰性對照序列,均由上海吉瑪基因化學技術(shù)有限公司合成,靶向序列為NLRP3-mus-2764:5′-GGUUCUGAGCUCCAACCAUTT-3′;NLRP3-mus-2411:5′-GGUCUCUUCUCAAG-UCUAATT-3′;NLRP3-mus-727:5′-CCAACUGGUCAAGGAGCAUTT-3′;shRNA-NC:5′-UUC-UCCGAACGUGUCACGUTT-3′。通過qRT-PCR選擇干擾效率最高的序列構(gòu)建shRNA。質(zhì)粒pG2.2用BsaⅠ酶切,1%瓊脂糖凝膠回收大片段。用T4DNA連接酶將稀釋退火后的shRNA-NLRP3片段與線性化的pG2.2載體連接,取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,涂板挑取單菌落搖菌按試劑盒說明書小量提取質(zhì)粒,用SacⅠ做酶切鑒定、測序鑒定是否為陽性克隆,測序無誤后大規(guī)模提取shRNA-NLRP3質(zhì)粒。以陰性對照(negative control,NC)序列作為對照,構(gòu)建方法同上。

1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BV2細胞系構(gòu)建 轉(zhuǎn)染前,將5×105個細胞重懸于1.5 mL DMEM培養(yǎng)液中。用Opti-MEM稀釋Lipofectamine 2000脂質(zhì)體,將測序正確的pG2.2-mus-NLRP3質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染BV2細胞,37℃培養(yǎng)72 h后檢測轉(zhuǎn)染效率,篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BV2細胞進行后續(xù)研究。

1.2.4 LPS刺激致BV2細胞炎癥模型的制備 取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后BV2細胞,調(diào)整細胞密度為1×104個/mL,按每孔2 mL接種于6孔培養(yǎng)板,分為4組并進行相應(yīng)處理:空白對照組、對照組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照NC shRNA質(zhì)粒)、shNLRP3組(轉(zhuǎn)染NLRP3 shRNA質(zhì)粒)。除空白對照組外,其余組均使用1 μg/mL的LPS處理24 h。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α、IL-4、IL-18和IL-1β蛋白含量 取各組BV2細胞上清液,用ELISA試劑盒檢測各組BV2上清液中TNF-α、IL-4、IL-18和IL-1β蛋白含量。

1.2.6 免疫熒光染色檢測BV2細胞Arg-1/Iba1、iNOS/Iba1表達 取各組BV2細胞,用胰酶消化后制作爬片。24 h后取出爬片在培養(yǎng)板中用PBS浸洗3次,加入4%多聚甲醛固定15 min,加入0.5%的Triton X-100室溫通透20 min,正常山羊血清室溫封閉30 min,加入一抗Anti-Iba1抗體、Arginase-1(Arg-1)抗體、iNOS抗體(稀釋比均為1∶100),4℃孵育過夜。次日,PBS清洗3次后,分別加入Cy3標記的山羊抗小鼠IgG(1∶100)和FITC標記的羊抗兔IgG(1∶100),避光室溫孵育1 h,DAPI避光孵育5 min,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 Western blot檢測NLRP3表達 取各組BV2細胞,離心后去上清加入蛋白裂解液,置于冰上裂解30 min后在12000 r/min、4℃條件下離心5 min,取上清液,使用BCA法測定蛋白濃度。每孔加40 μg蛋白樣品,經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后,GAPDH條帶以200 mA、90 min轉(zhuǎn)至PVDF膜,NLRP3條帶以200 mA、120 min后300 mA、30 min轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下使用5%脫脂牛奶封閉2 h,用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗GAPDH(1∶1000)和NLRP3(1∶800)4℃孵育過夜。用TBST稀釋HRP標記羊抗兔二抗(1∶10000稀釋),室溫搖床孵育2 h,使用ECL化學發(fā)光法X光膠片壓片、掃描,用Image-pro plus分析膠片灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 shRNA質(zhì)粒表達載體構(gòu)建

與對照組相比,NC序列轉(zhuǎn)染組NLRP3 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),各干擾序列組(NLRP3-mus-2764組、NLRP3-mus-2411組、NLRP3-mus-727組)的NLRP3 mRNA表達顯著降低(均P<0.01,圖1A),其中NLRP3-mus-727組表達最低,沉默效果最好,因此本研究選用NLRP3-mus-727作為干擾序列構(gòu)建shRNA進行后續(xù)實驗。質(zhì)粒載體pG2.2原本含一個SacⅠ的酶切位點,設(shè)計干擾片段時人為地引入另一個SacⅠ的酶切位點。當質(zhì)粒被SacⅠ酶切出約600 bp的DNA條帶時,說明目的退火片段成功插入pG2.2載體(圖1B)。

A:qRT-PCR篩選NLRP3干擾序列,與對照組比較,**P<0.01;B:質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定,M:標準DNA,1:pG2.2-mus-NLRP3質(zhì)粒,2:pG2.2-NC質(zhì)粒

2.2 重組NLRP3 shRNA表達質(zhì)粒的DNA測序及Western blot檢測結(jié)果

插入shNLRP3和shNC片段的重組質(zhì)粒基因測序結(jié)果顯示,插入的堿基序列與設(shè)計shRNA片段完全一致。與對照組相比,經(jīng)LPS處理后的陰性對照組BV2細胞NLRP3蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義;與陰性對照組相比,shNLRP3組的BV2細胞NLRP3蛋白表達量明顯降低(P<0.01,圖2)。

1:空白對照組,2:對照組,3:陰性對照組,4:shNLRP3組;A:NLRP3蛋白表達條帶;B:NLRP3蛋白表達水平統(tǒng)計圖;C:shNLRP3與shNC重組質(zhì)粒基因測序圖;與空白對照組比較,**P<0.01;與陰性對照組比較,##P<0.01

2.3 敲減NLRP3基因?qū)π∧z質(zhì)細胞形態(tài)學的影響

如圖3A所示,空白對照組BV2細胞為靜息態(tài),呈圓形、短梭形,細胞數(shù)量較多,胞體小,細胞上有細長突起,呈毛刺樣,高度分支;LPS誘導(dǎo)下的對照組細胞數(shù)量相對減少,胞體增大,呈梭形或桿狀的“激活態(tài)”,突起回縮變短,呈“阿米巴”狀,如圖3B。陰性對照組BV2細胞形態(tài)與對照組類似(圖3C)。shNLRP3組細胞與空白對照組形態(tài)相似(圖3D)。

A:空白對照組;B:對照組;C:陰性對照組;D:shNLRP3組

2.4 敲減NLRP3基因?qū)π∧z質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的影響

如圖4所示,與空白對照組相比,對照組BV2細胞炎癥因子IL-18、IL-1β、TNF-α和NO的分泌量明顯增加(均P<0.01);與陰性對照組相比,shNLRP3組細胞炎癥因子和NO的分泌量明顯降低(均P<0.01);陰性對照組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),提示敲減NLRP3可抑制LPS誘導(dǎo)下的BV2炎癥反應(yīng),減少促炎性介質(zhì)分泌。

1:空白對照組;2:對照組;3:陰性對照組;4:shNLRP3組;與空白對照組比較,**P<0.01;與陰性對照組比較,##P<0.01

2.5 敲減NLRP3基因?qū)π∧z質(zhì)細胞活化標志蛋白的影響

如圖5免疫熒光檢測結(jié)果顯示,未誘導(dǎo)的空白對照組BV2細胞iNOS/Iba1相對表達量較低,Arg-1/Iba1相對表達量較高;與空白對照組相比,對照組與陰性對照組iNOS/Iba1相對表達量明顯升高,Arg-1表達下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01);與陰性對照組比較,shNLRP3組iNOS/Iba1相對表達量下降,Arg-1/Iba1上調(diào)(均P<0.01),提示敲減NLRP3可抑制小膠質(zhì)細胞活化,促使其向M2表型極化。

1:空白對照組;2:對照組;3:陰性對照組;4:shNLRP3組;與空白對照組比較,**P<0.01;與陰性對照組比較,##P<0.01

3 討論

神經(jīng)炎癥是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)在各種內(nèi)、外源性因素刺激下(如錯誤折疊的蛋白質(zhì)、毒素和病原體)所產(chǎn)生的一系列免疫反應(yīng),主要表現(xiàn)為腦組織炎性細胞浸潤、膠質(zhì)增生、神經(jīng)元喪失等[6]。一般認為,這種免疫反應(yīng)主要由神經(jīng)免疫細胞活化后產(chǎn)生的促炎因子所引發(fā),例如細胞因子和趨化因子。在癲癇、神經(jīng)退行性疾病、抑郁癥等多種神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病中,這些促炎因子可以通過抑制神經(jīng)元分化、誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡和壞死、增加興奮性神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生、破壞血腦屏障通透性等途徑導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,在疾病的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用[7]。因此,抑制神經(jīng)炎癥可能是多種神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病防治的重要策略之一。

小膠質(zhì)細胞被認為是駐留在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞,在生理情況下呈現(xiàn)高度分支的“靜息態(tài)”,發(fā)揮免疫監(jiān)視、清除細胞碎片、突觸修剪等作用;當受到病原體、損傷組織等各種預(yù)警分子信號刺激時,小膠質(zhì)細胞上的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)能夠迅速響應(yīng),在數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)換為胞體增大、突起縮短的“阿米巴”狀活化態(tài),然后通過胞飲、吞噬或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將致病物質(zhì)內(nèi)化并降解。在IL-2、IL-13刺激時,小膠質(zhì)細胞則轉(zhuǎn)換為替代激活的抗炎表型(M2型),偏向分泌具有神經(jīng)保護作用的Arg-1、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、神經(jīng)營養(yǎng)因子等物質(zhì)[8]。但值得注意的是,小膠質(zhì)細胞的表型極化在疾病狀態(tài)下是一個動態(tài)轉(zhuǎn)化的過程,M1/M2表型在時間、空間上呈現(xiàn)為相對重合的“譜系”狀態(tài)[9]。因此,小膠質(zhì)細胞的激活被認為是神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵指征,通過干預(yù)表型轉(zhuǎn)換來調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸方向,使炎癥結(jié)果向抗炎保護方向演變,是干預(yù)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的有效方案之一。本研究結(jié)果顯示,LPS能夠誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細胞激活,細胞呈現(xiàn)胞體增大的“阿米巴”狀活化態(tài),并向高表達iNOS的M1表型極化,釋放大量促炎因子,促進神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

NLRP3蛋白是NLRP3炎性小體的核心組成成分,廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),并在小膠質(zhì)細胞中大量表達。作為PRRs之一,NLRP3能夠識別外源性或內(nèi)源性病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs),活化下游轉(zhuǎn)錄核因子-κB,磷酸化并降解IκBα、NF-κB p65發(fā)生核移位,啟動靶基因轉(zhuǎn)錄,上調(diào)NLRP3、IL-1β和IL-18前體表達;然后在胞內(nèi)或胞外PAMPs和DAMPs的刺激下裝配NLRP3炎癥復(fù)合體,釋放成熟的炎性因子IL-1β和IL-18,并激活Gasdermin D導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞膜裂解,進一步釋放更多的炎性因子[10]。本研究證實,體外環(huán)境下應(yīng)用shRNA敲減NLRP3基因表達能夠抑制IL-1β、IL-18釋放,促進小膠質(zhì)細胞M1型向M2型表型轉(zhuǎn)化,上調(diào)Arg-1/Iba1表達、抑制iNOS/Iba1表達,同時減少TNF-α、NO等毒性物質(zhì)釋放,減輕中樞炎性損傷。

綜上所述,本研究采用LPS致BV2小膠質(zhì)細胞活化的炎癥模型,探討NLRP3基因干擾shRNA技術(shù)對小膠質(zhì)細胞激活的作用,結(jié)果顯示敲減NLRP3表達可以顯著抑制小膠質(zhì)細胞活化,增加小膠質(zhì)細胞M2型標志物(Arg-1)的表達,降低M1型標志物(iNOS)表達,下調(diào)炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α及NO分泌,從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用,但對具體作用機制仍需進一步探討。