王雙慧，馬世源，李子健,2，宋 川，代漢聰，邵 燕，黃 丹,2，羅惠波,2,*

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000；3.四川省瀘州市瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

濃香型白酒是傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵蒸餾酒，在其獨特的釀造系統(tǒng)中，非生物變化結(jié)合生物因素驅(qū)動微生物組裝、演替和自我馴化，最終形成穩(wěn)定的、具有釀造功能的特殊微生物群落[1]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是白酒釀造重要的功能菌，具有產(chǎn)醇、產(chǎn)酯等多種功能[2]，缺乏釀酒酵母會導致微生物群落的紊亂，擾動生態(tài)系統(tǒng)[3]，最終影響微生物的自然演替。

在長期的白酒釀造過程中，酒醅微生物經(jīng)歷了高度動態(tài)的演替變化，包括物種擴散、物種相互作用、物種相對豐度變化和新物種的進化等[4]，形成內(nèi)外部的動態(tài)平衡。然而，環(huán)境條件發(fā)生變化會破壞原有的微生態(tài)平衡，導致微生物群落生態(tài)位結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]。通過生物擾動實現(xiàn)環(huán)境條件的改變是目前常用的方法，并在描述微生物群落演替及其相互作用方面取得了顯著進展[6]。例如，He Guiqiang等[7]發(fā)現(xiàn)，添加芽孢桿菌能夠提高濃香型白酒微生物系統(tǒng)種間相互作用的多樣性和復雜性，Mu Yu等[8]發(fā)現(xiàn)微生物的聚集格局和生態(tài)位寬度密切相關(guān)。然而，微生物群落演替發(fā)生變化的機制尚不清楚。研究表明，確定性過程（如生物選擇和非生物選擇）以及隨機性過程（如擴散和漂變）都決定著微生物群落的聚集[9]，對微生物組裝過程的分析將有助于對微生物群落演替變化的認識。例如，馬靜等[10]發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落組裝以確定性過程為主導，同質(zhì)性選擇貢獻最大。而決定微生物群落組裝的主要驅(qū)動力為生態(tài)位寬度[11]，生態(tài)位寬度是指一個種群（或其他生物單位）在一個群落中所利用的各種不同資源的總和，是影響群落中物種分類相對重要性的關(guān)鍵特征[12]。因此，對于微生物生態(tài)位寬度的研究將有助于理解群落演替規(guī)律。以往的研究多是關(guān)于濃香型白酒中不同的功能微生物對白酒風味等的影響，然而關(guān)于釀酒酵母如何影響微生物群落生態(tài)位結(jié)構(gòu)而導致群落演替發(fā)生變化的研究較少。

本研究以酒醅微生物群落為研究對象，在實驗室構(gòu)建添加釀酒酵母濃香型白酒釀造的多菌共酵體系，采用擴增子測序技術(shù)探究對照組和實驗組的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，利用生物信息統(tǒng)計學分析探究釀酒酵母對微生物群落生態(tài)位的影響，從而了解釀酒酵母如何影響微生物群落演替，以期提高對濃香型白酒釀造微生物群落生態(tài)系統(tǒng)的認識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母從濃香型白酒酒醅中篩選得到。入窖酒醅、黃水 四川省某酒廠。

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 成都市科隆化學品有限公司；異丙醇 北京索萊寶科技有限公司；所用試劑均為分析純；E.Z.N.A.Soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LYNX 6000高速冷凍離心機、UV-1200紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；PR224ZH電子天平上海奧豪斯儀器有限公司；DZKW-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵實驗

取酒廠的入窖糟醅，分裝至滅菌后的磨口瓶中，裝瓶量為0.5 kg，加入3%的黃水。將實驗組（experiment group，EG）加入質(zhì)量分數(shù)1%糟醅、濃度107CFU/mL的釀酒酵母菌液，空白組（control group，CG）用水補足，分別混合均勻。CG組15 瓶，EG組15 瓶，密封后放入培養(yǎng)箱中發(fā)酵。參考生產(chǎn)中酒醅溫度變化進行培養(yǎng)，30～33 ℃發(fā)酵3 d，33～35 ℃發(fā)酵5 d，35～38 ℃發(fā)酵15 d，38 ℃發(fā)酵至第40天。取發(fā)酵0、8、16、23、40 d的樣品進行檢測和后續(xù)分析，樣品保存于-80 ℃。

1.3.2 酒醅DNA的提取和測序

稱取7 g樣品于50 mL離心管中（每個樣品稱取3 份），加入28 mL磷酸鹽緩沖液洗滌后渦旋振蕩5 min，室溫下100 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的50 mL離心管中，重復洗滌1 次。將轉(zhuǎn)移的上清液于室溫下10 000 r/min離心5 min，棄上清液保留沉淀。將沉淀根據(jù)E.Z.N.A.Soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的DNA。以酒醅總基因組DNA為模板，分別以引物對338F（5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCA-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對細菌16S rRNA基因序列中的V3～V4可變區(qū)進行擴增[13]，引物對ITS5F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、ITS1R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對真菌ITS1區(qū)進行擴增。由上海美吉生物科技有限公司在Illumina MiSeq 2500平臺上進行雙端測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)計算，Wilcoxon test對微生物進行顯著性分析，零模型分析群落組裝機制，使用Cytoscape 3.7.1軟件進行網(wǎng)絡(luò)圖繪制，其他數(shù)據(jù)可視化均使用R語言（V4.2.2）軟件和Origin 2021軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母對酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 釀酒酵母對酒醅微生物多樣性的影響

通過多樣性指數(shù)和主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）了解釀酒酵母對微生物群落α多樣性和β多樣性的影響。由圖1A、B可知，在發(fā)酵過程中，真菌多樣性指數(shù)變化較小，總體呈逐漸增加后平穩(wěn)趨勢，細菌多樣性變化較大，在發(fā)酵第8天顯著降低，后期逐漸升高趨于平穩(wěn)。EG的細菌和真菌多樣性均低于CG，釀酒酵母降低微生物群落的多樣性。由圖1C、D可知，PCoA顯示EG和CG發(fā)酵醅的真菌和細菌群落均有明顯分離，差異顯著（P＜0.05），其中真菌的差異極顯著（P＜0.01），說明釀酒酵母對微生物群落結(jié)構(gòu)組成造成差異，特別是對真菌群落多樣性的影響大于細菌群落。微生物多樣性和組成在發(fā)酵過程中發(fā)生很大變化，表明在濃香型白酒發(fā)酵過程中釀酒酵母的相對含量會對群落多樣性造成影響。

圖1 酒醅發(fā)酵過程中CG和EG的微生物群落多樣性Fig.1 Microbial community diversity in CG and EG during the fermentation of fermented grains

2.1.2 釀酒酵母對酒醅微生物群落相對組成的影響

由圖2A可知，從微生物群落組成來看，占比最高的優(yōu)勢真菌物種為子囊菌門（Ascomycota），其次為擔子菌門（Basidiomycota），CG和EG的Ascomycota相對豐度無明顯差異，但Basidiomycota在EG中的相對豐度較CG稍低。由圖2B可知，優(yōu)勢細菌物種為乳酸桿菌（Lactobacillus）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）和醋酸桿菌（Acetobacter）。其中，EGLactobacillus相對豐度大于CG，在發(fā)酵第8天時相對豐度超過99%，但Paenibacillus在CG中的相對豐度大于EG。由圖2C、D可知，發(fā)酵過程中，EG和CG共有真菌197 種、細菌243 種，CG的細菌和真菌物種數(shù)量均高于EG，表明釀酒酵母降低濃香型白酒發(fā)酵過程物種多樣性。

圖2 酒醅發(fā)酵過程中CG和EG的微生物群落組成Fig.2 Microbial community composition in CG and EG during the fermentation of fermented grains

釀酒酵母對微生物群落物種組成造成影響，基于組間差異檢驗方法（Wilcoxon秩和檢驗）獲得組間具有顯著差異的物種信息。CG和EG的差異真菌共15 種，極顯著差異真菌有10 種，包括伊薩酵母屬（Issatchenkia）、曲霉屬（Aspergillus）、酵母屬（Saccharomyces）和孢圓酵母屬（Torulaspora）等，其中除釀酒酵母外其他極顯著差異真菌的相對豐度均為CG高于EG（圖3A）。由圖3B可知，CG和EG中極顯著差異細菌共5 種，包括Acetobacter、湖沉積桿菌屬（Limnobacter）、嗜氨菌（Ammoniphilus）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）和unclassified_f__Micrococcaceae，差異細菌的相對豐度均為EG高于CG。結(jié)果表明，釀酒酵母會降低濃香型白酒發(fā)酵過程中一些物種的相對豐度，使其成為CG和EG的顯著差異微生物。釀酒酵母添加后產(chǎn)乙醇和產(chǎn)酸菌等發(fā)生顯著差異，這可能會導致酒醅群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對發(fā)酵過程中群落生態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響。

圖3 酒醅發(fā)酵過程中CG和EG的微生物群落物種差異分析Fig.3 Analysis of differential microbial community species between CG and EG during the fermentation of fermented grains

2.2 釀酒酵母對酒醅微生物生態(tài)位的影響

2.2.1 釀酒酵母對酒醅微生物群落生態(tài)位寬度的影響

生態(tài)位寬度是細菌和真菌群落聚集的主要驅(qū)動力[11]，釀酒酵母對濃香型白酒發(fā)酵過程中的微生物群落生態(tài)位寬度具有影響。由圖4可知，CG的真菌和細菌生態(tài)位寬度均高于EG，說明釀酒酵母會降低微生物群落的生態(tài)位寬度，釀酒酵母對發(fā)酵過程中真菌和細菌生態(tài)位寬度具有不同程度的影響。其中真菌的生態(tài)位寬度高于細菌，并且釀酒酵母明顯降低了真菌的生態(tài)位寬度。真菌生態(tài)位寬度的變化大于細菌，說明釀酒酵母對真菌群落的影響大于細菌。生態(tài)位寬度具有顯著差異表明其對環(huán)境變化具有更高的適應性和抵抗力[8]，并且細菌生態(tài)位寬度比真菌窄，說明真菌可以更廣泛地利用有效資源[14]。

圖4 釀酒酵母對微生物群落生態(tài)位寬度變化的影響Fig.4 Effect of Saccharomyces cerevisiae on the change in niche breadth of microbial community

造成生態(tài)位寬度降低的原因可能為環(huán)境中的可利用資源變豐富，微生物有選擇性地利用資源[15]。EG和CG的群落生態(tài)位發(fā)生變化，EG微生物生態(tài)位寬度降低，說明釀酒酵母對群落構(gòu)建的影響表現(xiàn)在使群落物種間的物種分布相對集中且數(shù)量減少，競爭能力變?nèi)?，物種對環(huán)境變化的敏感度降低[16]，環(huán)境耐受性的變化使物種生態(tài)位發(fā)生變化[17]。這些結(jié)果表明，濃香型白酒發(fā)酵過程中，微生物受釀酒酵母的影響，生態(tài)位寬度發(fā)生變化，對環(huán)境的敏感程度也發(fā)生變化，釀酒酵母的添加擾動微生物的群落構(gòu)建。

2.2.2 釀酒酵母對酒醅微生物不同生態(tài)位寬度類群的影響

微生物物種可根據(jù)其適應不同生態(tài)位的能力劃分為不同的生態(tài)類群[18]。為進一步研究生態(tài)位寬度的變化，分別研究釀酒酵母對不同生態(tài)位寬度類群微生物的影響。將生態(tài)位寬度大于3的物種劃分為泛化種，生態(tài)位寬度小于1.5的物種劃分為特化種，其他劃分為普通種[19]。

由圖5A可知，釀酒酵母影響不同生態(tài)位寬度的微生物相對豐度，真菌的泛化種相對豐度由94.4%降低至84.1%，而特化種相對豐度由0.8%增加至3.1%。由圖5B可知，細菌的泛化種相對豐度由95.6%降低至82.7%，而特化種相對豐度由1.4%增加至2.7%。由圖5C可知，不同類別物種的相對豐度變化也直觀地表明EG的普通種含量增加，泛化種的含量減少。群落生態(tài)位寬度會直接影響物種豐富度[20]，微生物多樣性的變化可能與生態(tài)位的變化有關(guān)[21]。

圖5 釀酒酵母對微生物群落生態(tài)位的影響Fig.5 Effect of Saccharomyces cerevisiae on the niche of microbial community

2.2.3 釀酒酵母對酒醅不同生態(tài)位寬度類群微生物群落網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響

特定生態(tài)位內(nèi)微生物會形成復雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)[22]，為多方面研究釀酒酵母與群落中的泛化種、普通種和特化種之間的關(guān)系，構(gòu)建微生物網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)分析是量化微生物相互作用的穩(wěn)健、有效方法[23]，基于Spearman相關(guān)性系數(shù)的網(wǎng)絡(luò)包括泛化種、普通種和特化種（P＜0.05，|r|＞0.6）。

由圖6A可知，CG的生態(tài)位寬度網(wǎng)絡(luò)共分為4 個模塊、52 個節(jié)點、106 條邊，模塊化系數(shù)為0.566。由圖6B可知，不同生態(tài)位寬度的物種分布在各模塊，其中模塊2和模塊4中全是泛化種，特化種僅在模塊1中出現(xiàn)，普通種在模塊1和模塊3中出現(xiàn)。由圖6C可知，EG網(wǎng)絡(luò)中的主要模塊數(shù)量增加，共分為6 個主要模塊、56 個節(jié)點、167 條邊，模塊化系數(shù)為0.497。由圖6D可知，泛化種除在模塊6中不存在外，在其他模塊中均存在，且相對豐度最高，特化種在模塊1、模塊3和模塊6中出現(xiàn)且在模塊6中的相對豐度最高，普通種在6 個模塊中均存在且在模塊3中的相對豐度最高。

圖6 不同生態(tài)位寬度微生物網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Microbial community networks with different niche widths

CG網(wǎng)絡(luò)主要模塊中以泛化種為主，而EG網(wǎng)絡(luò)主要模塊中特化種的相對豐度明顯增加。表明在EG網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，特化種可能在維持生態(tài)群落的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮作用[24]。這些結(jié)果說明，釀酒酵母增強了特化種在微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的功能，降低了網(wǎng)絡(luò)的模塊化程度，使得內(nèi)部競爭降低，加劇了網(wǎng)絡(luò)的不穩(wěn)定性[25]，但網(wǎng)絡(luò)的復雜性增強。不同生態(tài)位寬度的物種在不同模塊中的分布具有差異，這種差異主要由發(fā)酵醅中釀酒酵母的變化解釋。

2.3 釀酒酵母對酒醅微生物群落組裝的影響

微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)變化受組裝機制的影響，因此利用組裝機制探究釀酒酵母如何影響微生物群落變化。并且微生物的空間周轉(zhuǎn)和群落聚集受不同生態(tài)機制調(diào)控，因此有必要分析隨機過程和確定性過程對微生物群落組裝機制的相對貢獻[26]。通過零模型分析，綜合評價釀酒酵母對發(fā)酵過程中微生物群落組裝的影響，利用平均最近分類單元指數(shù)（β-nearest taxon index，βNTI）量化釀酒酵母對酒醅群落聚集格局的影響[27]。如圖7A所示，隨機過程（|βNTI|＜2）和確定性過程（|βNTI|＞2）共同決定了微生物群落的聚集，但主要是隨機過程主導。

圖7 酒醅發(fā)酵過程中CG和EG的微生物群落組裝Fig.7 Microbial community assembly in CG and EG during the fermentation of fermented grains

為進一步確定不同生態(tài)過程對群落組裝的貢獻，利用Raup-Crick指數(shù)（RCbary值）確定不同生態(tài)過程的相對重要性[28]。由圖7B、C可知，釀酒酵母對群落生態(tài)過程具有影響，生態(tài)漂移對群落演替的貢獻從58.83%降低為46.15%，均勻質(zhì)擴散從20.59%降低至10.26%，擴散限制從8.82%增加到20.51%，同質(zhì)選擇從0.00%增加至5.13%，異質(zhì)選擇從11.76%增加至17.95%。釀酒酵母提升了擴散限制、同質(zhì)選擇、異質(zhì)選擇3 種生態(tài)過程對群落構(gòu)建的貢獻，但降低了生態(tài)漂移和均勻質(zhì)擴散對群落構(gòu)建的重要性，表明釀酒酵母促使微生物的群落演替更具確定性[29]。

確定性過程和隨機過程可以共同調(diào)節(jié)微生物群落的聚集，對群落組裝的相對貢獻隨環(huán)境條件的變化而變化[30]。而釀酒酵母相對含量的變化使得異質(zhì)選擇從無到有，這可能導致群落之間的結(jié)構(gòu)更加相似[31]。結(jié)果表明，釀酒酵母能夠改變?nèi)郝涞纳姝h(huán)境，從而造成群落組裝機制的差異。同時，這種生態(tài)位變化、異質(zhì)性選擇等可能會影響微生物之間的相互作用，造成網(wǎng)絡(luò)模塊的差異[32]。由此可知，釀酒酵母對微生物群落多樣性、物種組成等的影響可能是由于群落組裝機制的變化。

3 結(jié)論

釀酒酵母顯著改變濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)，擾動濃香型白酒發(fā)酵過程中的群落演替。釀酒酵母相對豐度的變化使微生物群落組成發(fā)生變化，不但降低微生物群落的多樣性，而且降低微生物生態(tài)位寬度。但在微生物網(wǎng)絡(luò)中，釀酒酵母能夠增加特化種在主要模塊中的相對豐度，增強網(wǎng)絡(luò)的復雜性。造成微生物群落演替發(fā)生上述變化歸因于群落組裝的變化。微生物組裝主要由隨機過程主導，但釀酒酵母通過改變漂移和擴散的重要性使組裝過程更具確定性。本研究結(jié)果揭示了釀酒酵母對濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落演替的影響，但具體的影響機制還有待進一步探索。