許夢粵，丁澤宇，李錦鵬，王 燦，王銘陽，劉 琴，曾長立，王紅波,3,*

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全研究中心，湖北 武漢 430056；2.湖北省漢江流域特色生物資源保護開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056；3.湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056）

大豆是一種優(yōu)質(zhì)的食品原料，含有多糖、異黃酮、多肽、磷脂和皂苷等生物活性成分[1]。納豆是由大豆經(jīng)浸泡、蒸煮和接種納豆芽孢桿菌發(fā)酵等工序制備的發(fā)酵食品[1]。大豆和納豆的主要營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)差異顯著。納豆芽孢桿菌分泌的多種酶能水解大豆中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)，產(chǎn)生氨基酸、有機酸、脂肪酸和酵素等小分子物質(zhì)，更易被人體吸收[2]。微生物發(fā)酵不僅可以改變大豆食品的風(fēng)味，還可以提高大豆食品的營養(yǎng)價值[3-4]。納豆中含有納豆激酶、多糖和亞油酸等活性物質(zhì)，具有溶血栓、抗氧化、保護肝臟和預(yù)防心腦血管疾病等功能[5]。

豆類多糖是從豆類中提取的一類由10 個及以上單糖或單糖衍生物通過糖苷鍵縮合形成的天然高分子化合物，具有抗氧化、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)和保護腸胃等生物活性[6]。多糖化學(xué)組成、分子質(zhì)量和糖苷鍵的連接方式等結(jié)構(gòu)特征是決定其生物活性的主要因素[7]。多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)表征、結(jié)構(gòu)改性和生物活性是豆類多糖研究關(guān)注的焦點。Liu Duo等[8]研究發(fā)現(xiàn)，黑豆皮多糖由甘露糖、半乳糖和葡萄糖3 種單糖組成，具有一定的抗疲勞活性。辛玥等[9]發(fā)現(xiàn)，豇豆種皮多糖是一種果膠類的酸性多糖，具有較強的抗氧化活性。Bai Zhouya等[10]發(fā)現(xiàn)，紅蕓豆和小黑豆粗多糖對II型糖尿病小鼠均有緩解作用，且對其肝功能有保護作用。

納豆多糖是納豆中重要的生物活性成分。但現(xiàn)有的研究主要聚焦于納豆中的納豆激酶和多肽，對于納豆多糖的研究報道較少。楊文麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，納豆多糖是由巖藻糖、木糖醇、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的雜多糖。Matsumoto等[12]發(fā)現(xiàn)，納豆多糖能通過抑制腸道細胞攝取葡萄糖抑制餐后高血糖。本研究采用水提醇沉法分別從大豆和納豆中提取制備粗多糖，比較分析2 種粗多糖的結(jié)構(gòu)特征、溶解性質(zhì)以及體外抗氧化、降血糖和降血脂生物活性差異，初步闡明納豆芽孢桿菌發(fā)酵對大豆多糖的影響規(guī)律。本研究旨在為納豆多糖的結(jié)構(gòu)分析和生物活性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘東農(nóng)252’大豆產(chǎn)于黑龍江省哈爾濱市。

2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪（2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine，TPTZ）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）北京索來寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）上海麥克林生化試劑有限公司；右旋糖酐、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one，PMP）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶 廣州碩譜生物科技有限公司；阿卡波糖、甘氨脫氧膽酸鈉、?；敲撗跄懰徕c 上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、牛血清蛋白、可溶性淀粉等試劑 國藥控股化學(xué)試劑有限公司；納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）CICC 10263 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設(shè)備

iS50R傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國Nicolet公司；U3000高效液相色譜儀、1510全波長酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；1515高效液相色譜儀 美國Waters公司；Nova NanoSEM450場發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；Freezone 6 Plus冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆多糖和納豆多糖的制備

1.3.1.1 種子液的制備

將納豆芽孢桿菌接種至LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)18 h，即為種子液。

1.3.1.2 大豆固態(tài)發(fā)酵

參考劉彥敏等[2]的方法，將大豆粉碎過篩，于121 ℃滅菌20 min，冷卻后按1∶1（m/V）加入無菌水和5%種子液，攪拌均勻，置于37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)3 d。發(fā)酵結(jié)束后將樣品置于真空冷凍干燥機，冷凍干燥18 h，置于-20 ℃冰箱貯藏備用。

1.3.1.3 粗多糖提取

參考Zhu Yingying等[13]的方法。將大豆和納豆粉碎，過60 目篩，稱質(zhì)量，按1∶10（m/V）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，室溫下振蕩6 h以除去脂肪和色素等雜質(zhì)，以4 300×g離心10 min，收集沉淀，70 ℃烘箱烘干。加入蒸餾水（1∶20，m/V），95 ℃水浴提取6 h，冷卻后以4 300×g離心10 min，收集清液。加入等體積3 g/100 mL TCA溶液以除去蛋白質(zhì)，4 ℃靜置過夜，以7 700×g離心10 min，收集上清液。然后加入2 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，以7 700×g離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥獲得粗多糖，稱其質(zhì)量。按式（1）計算粗多糖得率。

1.3.2 大豆多糖和納豆多糖的結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 化學(xué)組成測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[14]測定樣品中總糖含量，得線性回歸方程：y＝3.277 1x+0.076 8（R2＝0.996 6）。以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用間羥基聯(lián)苯比色法[15]測定樣品中糖醛酸含量，得線性回歸方程：y＝3.514 3x+0.047 7（R2＝0.994 1）。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Bradford法[16]測定樣品中蛋白質(zhì)含量，得線性回歸方程：y＝1.315 7x+0.186 7（R2＝0.993 0）。

1.3.2.2 FTIR光譜表征

稱取1～2 mg粗多糖樣品于研缽中，加入200 mg溴化鉀粉末研磨均勻、壓片，使用FTIR儀進行掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1[17]。

1.3.2.3 單糖組成測定

參考胡彥波等[18]的方法，利用高效液相色譜儀測定多糖樣品的單糖組成。色譜條件：流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 6.8）（17∶83，V/V），等度洗脫，流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長250 nm；進樣量10 μL。

1.3.2.4 分子質(zhì)量分布測定

參考趙佳瑩等[19]的方法，采用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測定多糖樣品分子質(zhì)量分布。以不同右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量（Mp為峰位分子質(zhì)量，Mw為重均分子質(zhì)量，Mn為數(shù)均分子質(zhì)量）的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)色譜峰的保留時間t為橫坐標(biāo)，得lgMp-t、lgMw-t、lgMn-t校正曲線：lgMw＝-0.177 2t+11.090 9（R2＝0.993 6）；lgMp＝-0.168 8t+10.687 1（R2＝0.992 6）；lgMn＝-0.168 5t+10.593 7（R2＝0.994 5）。色譜條件：流動相0.05 mol/L NaCl溶液，檢測器為示差檢測器，柱溫40 ℃，流速0.65 mL/min，進樣量30 μL。

1.3.2.5 多糖表面結(jié)構(gòu)觀察

取適量多糖樣品于導(dǎo)電碳膠帶上，噴金處理后，置于掃描電子顯微鏡中觀察拍照。設(shè)定工作電壓10.0 kV，觀察多糖表面結(jié)構(gòu)，于200、1 000、2 000 倍放大拍照[20]。

1.3.3 多糖溶水能力、持水能力和脂肪結(jié)合能力測定

參考Jeddou[21]、Chu Jiaxi[22]等的方法。稱取50 mg多糖樣品，加入1 mL蒸餾水，旋渦混合，25 ℃振蕩20 h。12 000×g離心10 min，收集清液，加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，以12 000 ×g離心10 min，收集沉淀，凍干后稱質(zhì)量，即為上清液中總碳水化合物質(zhì)量，按式（2）計算溶水能力。收集第1次離心后的沉淀，70 ℃干燥6 h，稱質(zhì)量，按式（3）計算持水能力。稱取50 mg多糖樣品于空離心管中，稱空離心管質(zhì)量，加入1 mL植物油，每5 min混合30 s，重復(fù)6 次，1 600×g離心20 min，棄上清液，離心管在濾紙上排液30 min，稱離心管質(zhì)量，按式（4）計算脂肪結(jié)合能力。

1.3.4 大豆多糖和納豆多糖體外抗氧化活性測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除活性

參考辛玥等[9]的方法。取0.2 mL多糖樣品溶液（0.125、0.25、0.5、1 mg/mL），加入0.2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（溶于50%乙醇溶液），混合均勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度。按式（5）計算DPPH自由基清除率，以VC為陽性對照。

式中：A0為0.2 mL H2O+0.2 mL DPPH溶液的吸光度；A1為0.2 mL樣品溶液+0.2 mL 50%乙醇溶液的吸光度；A2為0.2 mL樣品溶液+0.2 mL DPPH溶液的吸光度。

1.3.4.2 ABTS陽離子自由基清除活性

參考Teng Cong等[23]的方法。將7.4 mol/L ABTS陽離子溶液和3.8 mmol/L硫酸鉀溶液等體積混合，避光反應(yīng)12 h，即為母液。在734 nm波長下，用pH 7.4 PBS將母液吸光度調(diào)整到0.70±0.02，得到工作液。取25 μL多糖樣品溶液（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL），加入250 μL ABTS陽離子工作液混勻，避光靜置15 min，734 nm波長處測定吸光度，按式（6）計算ABTS陽離子自由基清除率，以VC為陽性對照。

式中：A3為25 μL H2O+250 μL ABTS陽離子工作液的吸光度；A4為25 μL樣品溶液+250 μL PBS的吸光度；A5為25 μL樣品溶液+250 μL ABTS陽離子工作液的吸光度。

1.3.4.3 鐵離子還原能力（ferricion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）

參考Liu Xuexia等[24]的方法。以FeSO4溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y＝0.689 8x+0.060 0（R2＝0.992 1）。將300 mmol/L醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L氯化鐵溶液混合（體積比10∶1∶1），即為FRAP工作液。取0.1 mL多糖樣品溶液（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL），加入0.9 mL FRAP工作液，37 ℃水浴5 min，595 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算FRAP。

1.3.5α-淀粉酶抑制活性測定

參考Gu Shuangshuang等[25]的方法。取0.4 mL多糖樣品溶液（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL），加入0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%淀粉溶液，置于37 ℃水浴中溫育5 min。加入0.2 mLα-淀粉酶溶液（0.5 mg/mL），37 ℃下反應(yīng)10 min，加入0.4 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴加熱5 min，冰水冷卻。540 nm波長處測定吸光度，按式（7）計算α-淀粉酶抑制率，以阿卡波糖為陽性對照。

式中：A6為0.4 mL PBS+0.2 mL 1%淀粉溶液+0.2 mLα-淀粉酶溶液+0.4 mL DNS的吸光度；A7為0.4 mL樣品溶液+0.2 mL 1%淀粉溶液+0.2 mL PBS+0.4 mL DNS的吸光度；A8為0.4 mL樣品溶液+0.2 mL 1%淀粉溶液+0.2 mLα-淀粉酶溶液+0.4 mL DNS的吸光度。

1.3.6 大豆多糖和納豆多糖體外降脂實驗

參考Qin Hana等[26]的方法。取2 mL膽酸鹽系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（含甘氨膽酸鈉0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L，?；悄懰徕c0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L），加入6 mL 60% H2SO4溶液，70 ℃恒溫水浴40 min，冰水浴5 min，387 nm波長處測定吸光度，得?；悄懰徕c線性回歸方程為y＝0.126 9x+0.061 5（R2＝0.995 4），甘氨膽酸鈉線性回歸方程為y＝0.161 1x+0.050 0（R2＝0.999 2）。取0.2 mL多糖樣品溶液（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL），加入0.2 mL胃蛋白酶（10 mg/mL）和0.6 mL HCl溶液（0.01 mol/L），37 ℃恒溫振蕩，模擬胃環(huán)境消化1 h。用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.3，加入0.8 mL胰蛋白酶（10 mg/mL），模擬腸道環(huán)境消化1 h。加入0.8 mL膽酸鹽（含甘氨膽酸鈉0.4 mmol/L、?；悄懰徕c0.5 mmol/L）消化1 h，以6 500×g離心10 min，收集清液，測定膽酸鹽含量。分別按式（8）、（9）計算甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c的結(jié)合率。

式中：c1為甘氨膽酸鈉加入量/μmol；c2為甘氨膽酸鈉剩余量/μmol；c3為?；悄懰徕c加入量/μmol；c4為?；悄懰徕c剩余量/μmol。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS（version 25.0）軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表明具有顯著差異。使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖得率與化學(xué)組分分析

由表1可知，大豆多糖和納豆多糖的得率分別為（1.83±0.57）%、（2.49±0.54）%。發(fā)酵過程中納豆芽孢桿菌產(chǎn)生的系列酶分解植物細胞壁，加速多糖釋放[22]，納豆多糖的得率高于大豆多糖，更有利于功能多糖的人體吸收。納豆多糖的總糖含量是大豆多糖的1.42 倍，二者之間差異顯著（P＜0.05）。納豆多糖中糖醛酸含量顯著高于大豆多糖（P＜0.05）。Zhang Lili等[27]研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌能分泌蛋白酶水解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)含量降低。因此，納豆多糖中蛋白質(zhì)含量顯著降低（P＜0.05），多糖純度提高。胡彥波等[18]研究發(fā)現(xiàn)，含少量蛋白質(zhì)的粗多糖樣品對后續(xù)抗氧化活性的研究無明顯影響。因此，大豆和納豆的粗多糖樣品無需進行后續(xù)脫蛋白處理。

表1 大豆多糖和納豆多糖得率與化學(xué)成分Table 1 Yields and chemical compositions of soybean and natto polysaccharides %

2.2 大豆多糖和納豆多糖的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 FTIR光譜結(jié)果

由圖1可知，大豆多糖和納豆多糖具有相似的多糖特征吸收峰，但吸收帶強度不同，表明納豆芽孢桿菌發(fā)酵過程中未破壞大豆多糖結(jié)構(gòu)。但發(fā)酵過程涉及酯化、水解、氧化和還原等多種反應(yīng)，均可能影響大豆多糖的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致大豆多糖和納豆多糖的結(jié)構(gòu)特征存在差異[28]。其中，3 500～3 200 cm-1附近的吸收峰為—OH的伸縮振動，3 000～2 800 cm-1附近的吸收峰為C—H基團的不對稱伸縮振動[29]。1 160～1 000 cm-1的吸收峰對應(yīng)C—O—C和C—O—H鍵的拉伸振動，表明多糖中存在吡喃糖環(huán)[30]。830 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰，表明大豆多糖和納豆多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中均存在α-型糖苷鍵[23]。1 665、1 450 cm-1附近的吸收峰分別對應(yīng)對稱和非對稱C＝O拉伸振動，表明多糖中可能含有較多糖醛酸[31]。1 740 cm-1附近的吸收峰是糖醛酸的特征吸收，用于表征多糖的酯化程度[18,24]。大豆多糖在1 740 cm-1附近無吸收峰，而納豆多糖在1 746 cm-1處有特征峰，說明納豆多糖的糖醛酸可能部分被酯化修飾。Li Xiaoli等[32]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硫酸酯化后的牡丹種子多糖的糖醛酸含量為（25.62±0.64）%，是牡丹種子多糖的5.04 倍，硫酸酯化后多糖的水溶性和生物活性等均顯著增強。采用濃硫酸法和氯磺酸-吡啶法修飾的天然多糖易降解[33]，且氯磺酸等試劑有劇毒，可能產(chǎn)生毒副作用[34-35]。微生物發(fā)酵酯化修飾的多糖食品安全性較高。

圖1 大豆多糖和納豆多糖的FTIR圖譜Fig.1 FTIR spectra of soybean and natto polysaccharides

2.2.2 單糖組成

由圖2和表2可知，大豆多糖和納豆多糖的單糖組成相似，且均為酸性雜多糖。大豆多糖主要單糖組成為甘露糖（mannose，Man）（22.72%）、葡萄糖（glucose，Glc）（17.26%）、半乳糖（galactose，Gal）（22.68%），納豆多糖主要單糖組成為Glc（35.52%）和Gal（27.49%）。納豆多糖中Man、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、巖藻糖（Fucose，F(xiàn)uc）物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)下降，而鹽酸氨基葡萄糖（D-glucosamine hydrochloride，GlcN）、Glc、Gal、木糖（xylose，Xyl）物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)增加。納豆芽孢桿菌的生物合成代謝會改變多糖中單糖的濃度和比例[36]。楊文麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，納豆多糖的單糖組成及物質(zhì)的量比為Fuc∶木糖醇∶Man∶Glc∶GalA＝1.04∶1.53∶1.57∶1.19∶4.68。單糖組成可以反映活性多糖部分結(jié)構(gòu)信息[19]。大豆多糖和納豆多糖的R1值較小，表明其線性區(qū)域含量較低，即側(cè)鏈的分支程度較高。大豆多糖和納豆多糖的R2值較高，表明RG-I含量較高。納豆多糖的R3值（4.36）高于大豆多糖（2.65），表明納豆多糖的RG-I中側(cè)鏈占比高于大豆多糖。Mao Guizhu等[37]研究發(fā)現(xiàn)，高RG-I含量和小分子質(zhì)量的柑橘多糖更有利于腸道微生物生態(tài)平衡。Zhang Shikai等[38]研究發(fā)現(xiàn)，富含RG-I的歐李多糖具有良好的乳化性能和抗氧化能力。

圖2 大豆多糖和納豆多糖的單糖組成高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of monosaccharide compositions of soybean and natto polysaccharides

表2 大豆多糖和納豆多糖的單糖組成及物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)Table 2 Monosaccharide compositions of soybean and natto polysaccharides %

2.2.3 分子質(zhì)量分布

由圖3可知，納豆多糖mw為33.532 ku，高于大豆多糖（5.256 ku），表明微生物發(fā)酵增加了大豆多糖的mw。發(fā)酵過程中納豆芽孢桿菌分泌的酶可以對多糖小分子基團修飾和重組，從而改變多糖分子質(zhì)量[39]。多糖分子中含有大量羥基，羥基的伸縮振動以及分子間作用力相互聚集，特別是酸性多糖容易形成不同程度的聚集體，使得多糖分子質(zhì)量增加[40]。Liang Jingjing等[41]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌21828發(fā)酵過程中香菇多糖分子質(zhì)量由11.6 ku增加到18.7 ku，且發(fā)酵香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)活性提高。Gu Jinyan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，相同來源的茨菇多糖，分子質(zhì)量大的表現(xiàn)出較強的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性。由表3可知，大豆多糖和納豆多糖的分散系數(shù)（mw/mn）為1.2～1.5，均接近1，表明二者均一性較好。

圖3 大豆多糖和納豆多糖的HPGPC圖Fig.3 HPGPC chromatograms of soybean and natto polysaccharides

表3 大豆多糖和納豆多糖的分子質(zhì)量Table 3 Molecular masses of soybean and natto polysaccharides

2.2.4 大豆多糖和納豆多糖的微觀結(jié)構(gòu)

由圖4可知，大豆多糖表面粗糙，有少許分支和孔洞。納豆多糖表面呈網(wǎng)狀和纖維狀，光滑致密。大豆多糖與納豆多糖的顯微形態(tài)差異明顯。多糖是具有復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的大分子聚集體，其微觀形態(tài)與聚集狀態(tài)有關(guān)[28]。Wang Lei等[42]發(fā)現(xiàn)，刺梨果多糖的分子排列不緊密，表明多糖聚集體之間的相互作用力較弱。Pei Fangyi等[43]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程改變了藍金銀花多糖原有的互連或聚集，導(dǎo)致大分子結(jié)構(gòu)的降解和重構(gòu)，呈現(xiàn)出光滑和致密表面。

圖4 大豆多糖和納豆多糖的掃描電子顯微圖Fig.4 Scanning electron micrographs of soybean and natto polysaccharides

2.3 大豆多糖和納豆多糖溶水能力、持水能力和脂肪結(jié)合能力

由圖5可知，大豆多糖的溶水能力為（31.81±4.48）%，顯著低于納豆多糖的（64.77±0.41）%（P＜0.05）。納豆多糖糖醛酸含量的增加以及糖醛酸部分酯化能使溶水能力增強[32]。納豆芽孢桿菌發(fā)酵多糖的連接被破壞，暴露出更多的氫鍵和偶極形式，這有助于溶水能力的提高[22]。多糖的水溶性越好，其應(yīng)用范圍越廣。

圖5 大豆多糖和納豆多糖的溶水能力、持水能力和脂肪結(jié)合能力Fig.5 Water solubility,water-holding capacity and fat-binding capacity of soybean and natto polysaccharides

大豆多糖的脂肪結(jié)合能力為（102.82±9.08）%，顯著高于納豆多糖的（34.40±1.01）%（P＜0.05）。大豆多糖的持水能力為（75.04±7.89）%，和納豆多糖（（70.67±5.03）%）之間沒有顯著差異。脂肪結(jié)合能力與多糖的化學(xué)成分、纖維分子對油的親和力、與纖維結(jié)構(gòu)的孔隙度密切相關(guān)[21,44]。納豆多糖的顯微結(jié)構(gòu)緊實光滑，不利于與油結(jié)合，使得脂肪結(jié)合能力下降。與納豆多糖相比，大豆多糖具有良好的脂肪結(jié)合能力，其在食品增味劑和保味劑中具有良好的應(yīng)用價值。

2.4 大豆多糖和納豆多糖體外抗氧化活性

如圖6所示，大豆多糖和納豆多糖的DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和FRAP在一定的濃度范圍內(nèi)都表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度增加到1 mg/mL時，大豆多糖和納豆多糖的DPPH自由基清除率分別為（84.14±0.20）%和（92.27±0.43）%。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度增加到4 mg/mL時，大豆多糖和納豆多糖的ABTS陽離子自由基清除率分別為（55.91±1.88）%和（60.23±1.00）%。納豆多糖對DPPH和ABTS陽離子自由基清除能力的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（0.049±0.015）、（2.640±0.072）mg/mL，表現(xiàn)出更佳的抗氧化活性。如圖6C所示，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，納豆多糖的FRAP（（165.14±0.91）μmol/L）高于大豆多糖（（157.94±0.67）μmol/L）。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度增加到4 mg/mL時，大豆多糖和納豆多糖的FRAP分別達到（172.48±1.81）、（202.6±2.03）μmol/L，納豆多糖對鐵離子的還原能力高于大豆多糖。

圖6 大豆多糖和納豆多糖的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of soybean and natto polysaccharides

與大豆多糖相比，納豆多糖的DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力和FRAP更強。多糖的抗氧化活性與糖醛酸含量、單糖組成和分子質(zhì)量等結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)[6]。糖醛酸含量越高，多糖的供電子或供氫能力越強，抗氧化活性越高[28]。Gu Jinyan等[20]發(fā)現(xiàn)采用熱水浸提法提取的茨菇多糖，其糖醛酸含量（8.62%）高于亞臨界水提法提取的多糖（2.75%），且熱水浸提制備的茨菇多糖抗氧化活性更強。本研究中納豆多糖的糖醛酸含量顯著高于大豆多糖，這可能是其抗氧化活性較高的重要原因。微生物發(fā)酵是一種溫和的生物修飾法，可以改變天然多糖的結(jié)構(gòu)，提高多糖的抗氧化活性[45]。Chen Qiuyan等[46]研究發(fā)現(xiàn)，采用釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵麥麩改變了麥麩的單糖組成和分子質(zhì)量，增強了麥麩多糖的DPPH自由基清除能力和對2,2′-偶氮雙鹽酸(2-甲基丙酰脒)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的保護作用。

2.5 大豆多糖和納豆多糖體外降血糖活性

α-淀粉酶是參與糖代謝的關(guān)鍵消化酶之一，能將二糖轉(zhuǎn)化為單糖，導(dǎo)致餐后血糖水平急劇升高[10]。控制腸道內(nèi)葡萄糖的釋放是治療II型糖尿病的有效途徑[25]。多糖抑制α-淀粉酶活性的能力可以表征其體外降血糖活性。由圖7可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，大豆多糖和納豆多糖的α-淀粉酶抑制率分別為（43.77±2.44）%和（55.66±2.98）%。納豆多糖抑制α-淀粉酶活性的IC50為（3.297±0.395）mg/mL，體外降血糖活性顯著高于大豆多糖（P＜0.05），但二者對α-淀粉酶的抑制能力均低于阿卡波糖。單糖組成、糖醛酸含量和空間構(gòu)象等因素會影響多糖的降血糖活性[47]。Zhang Zhenbiao等[48]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖比例高且分子質(zhì)量大的茶葉多糖對α-淀粉酶的結(jié)合親和力更強、降血糖活性更高。劉丹奇等[49]研究紅茶多糖、枸杞多糖和桑葉多糖時發(fā)現(xiàn)，阿拉伯糖和木糖的物質(zhì)的量占比與降血糖活性呈正相關(guān)。Wu Mengqi等[50]研究發(fā)現(xiàn)，從薔薇多糖中分離的WSRP-2b的糖醛酸含量（（74.73±3.43）%）高于WSRP-2a（（61.46±2.29）%），WSRP-2b對α-淀粉酶具有更強的抑制能力。納豆多糖的木糖比例高、糖醛酸含量高且分子質(zhì)量大，可能是其具有良好降血糖活性的主要原因。

2.6 大豆多糖和納豆多糖體外降血脂活性

膽固醇降解會產(chǎn)生膽酸鹽，多糖能在腸道內(nèi)與膽酸鹽結(jié)合，減少膽酸鹽重吸收，并且多糖能介入膽酸鹽的腸肝循環(huán)，使膽酸鹽排出體外[51]。多糖通過降低膽固醇和膽酸鹽含量達到降血脂的目的。如圖8所示，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，大豆多糖和納豆多糖對甘氨膽酸鈉的結(jié)合率分別為（56.06±2.41）%和（63.77±2.43）%，對?；悄懰徕c的結(jié)合率分別為（53.38±0.93）%和（59.29±0.93）%。納豆多糖對甘氨膽酸鈉結(jié)合能力和?；悄懰徕c結(jié)合能力的IC50分別為（2.292±0.175）、（1.249±0.062）mg/mL，顯著高于大豆多糖（P＜0.05)。Pei Fangyi等[43]研究發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量大的多糖，膽汁酸結(jié)合能力高，降血脂能力強。Li Qiaoyun等[52]研究發(fā)現(xiàn)，高糖醛酸含量和大分子質(zhì)量的沙棘多糖具有更強的膽汁酸結(jié)合能力。納豆多糖的分子質(zhì)量和糖醛酸含量均高于大豆多糖，可能是納豆多糖膽酸鹽結(jié)合能力增強的重要原因。

圖8 大豆多糖和納豆多糖的膽酸鹽結(jié)合能力Fig.8 Cholate-binding capacity of soybean and natto polysaccharides

3 結(jié)論

大豆多糖和納豆多糖均為含有α-吡喃糖環(huán)的酸性雜多糖，其得率分別為（1.8 3±0.5 7）%和（2.49±0.54）%。納豆多糖的糖醛酸含量為大豆多糖的1.18 倍。大豆多糖和納豆多糖的單糖組成種類相似但比例不同，其分子質(zhì)量分別為5.256、33.532 ku。大豆多糖的表面較為粗糙，納豆多糖表面光滑致密。納豆多糖的溶水能力是大豆多糖的2.04 倍，而大豆多糖的脂肪結(jié)合能力為納豆多糖的2.99 倍。納豆多糖對DPPH和ABTS陽離子自由基的清除能力、FRAP、α-淀粉酶的抑制能力和膽酸鹽的結(jié)合能力優(yōu)于大豆多糖。納豆多糖表現(xiàn)出更優(yōu)的抗氧化、體外降血糖和體外降血脂生物活性。但納豆芽孢桿菌發(fā)酵改變大豆多糖結(jié)構(gòu)的機制尚不明確，多糖結(jié)構(gòu)的官能團變化尚不清楚。在后續(xù)研究中需要進一步分離純化納豆多糖，對其結(jié)構(gòu)進行表征，探索結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系。