趙榮龍 梁欣欣 吳玉萍 崔丹 張玲

摘 要：葉綠素a含量是評(píng)價(jià)水體富營(yíng)養(yǎng)化水平的重要依據(jù)，水體營(yíng)養(yǎng)化程度過(guò)高會(huì)影響水生生物的生存和繁殖，導(dǎo)致水體生態(tài)系統(tǒng)紊亂，生物多樣性受到破壞。葉綠素a幾乎是所有浮游植物類別都含有的葉綠素類型。所以，葉綠素a含量既是水體富營(yíng)養(yǎng)化的判斷標(biāo)準(zhǔn)，又是浮游植物現(xiàn)存量的重要推斷依據(jù)。水體富營(yíng)養(yǎng)化是我國(guó)當(dāng)前水環(huán)境面臨的主要問(wèn)題。為闡明分光光度法測(cè)定水體中葉綠素a含量結(jié)果的快速性和準(zhǔn)確性，本研究用研磨機(jī)代替手工研磨進(jìn)行樣品制備，用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定。結(jié)果顯示葉綠素a檢測(cè)值符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

關(guān)鍵詞：分光光度法，水體，葉綠素a

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.07.041

0 引 言

葉綠素a的含量是評(píng)價(jià)水體富營(yíng)養(yǎng)化水平的重要依據(jù)，通過(guò)葉綠素a的含量可以估算出水體中浮游植物生物量[1-2]。浮游植物存量過(guò)高會(huì)造成水體的透明度降低，陽(yáng)光難以穿透水面阻礙水體中植物進(jìn)行光合作用，植物本身的呼吸作用會(huì)導(dǎo)致水體中氧氣被消耗，所以造成水體局部缺氧，而水體表面的浮游植物通過(guò)光合作用又會(huì)釋放大量氧氣，這樣會(huì)形成水體中缺氧，水面氧氣過(guò)飽和的情況，水生動(dòng)物（如魚(yú)類）會(huì)因?yàn)槿毖醵劳?；浮游植物生物量過(guò)高還會(huì)造成底層浮游生物堆積，在厭氧條件下分解發(fā)酵產(chǎn)生有害氣體和毒素，傷害水生生物[3]；營(yíng)養(yǎng)化程度高的水體中含有大量的硝酸鹽和亞硝酸鹽，高含量硝酸鹽和亞硝酸鹽水體對(duì)人類和其他動(dòng)物飲用水安全有很大危害。所以，如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)水體中葉綠素a含量并對(duì)水體中葉綠素a含量進(jìn)行合理控制，這對(duì)保護(hù)水資源、改善水環(huán)境尤為重要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和材料

玻璃纖維濾膜（孔徑：0.45 μm）。

離心管（PTFE材質(zhì)15 mL）。

研磨珠（材質(zhì)：氧化鋯；規(guī)格：5 mm）。

Tiss-24多樣品組織研磨機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

DT5-1低速臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）。

D R 2 8 0 0 便攜式可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)哈希）。

針式濾器（直徑：25 mm；孔徑：0.45 μm）。

比色皿（1 cm）。

1.2 試劑

丙酮：GR（西隴科學(xué)）。

丙酮溶液（配比9+1：9 0 0 m L丙酮+10 0 m L純水）。

葉綠素a溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含量：10 0±3% μg /mL；產(chǎn)品編號(hào)：BW91697-01，北京普析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司）。

葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)中間液：ρ（葉綠素a）=1.00 μg/mL。

移取1.00 mL葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 mL容量瓶中，用丙酮稀釋至標(biāo)線，混勻。

1.3 樣品

1.3.1 樣品的采集

采集分析葉綠素a樣品的水樣可以使用500 mL的玻璃瓶作為采樣瓶，在距離水面0.5 m的地方進(jìn)行水樣采集，如果水深不足0.5 m時(shí)采集距離水面中部的水樣。如果有泥沙和其他雜物時(shí)應(yīng)將水樣靜止30min后取水面下5 ㎝的水樣作為分析樣品。水樣采集完畢宜盡快送實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 樣品的制備

用量筒準(zhǔn)確量取水樣100 mL，將水樣倒入事先準(zhǔn)備好帶濾膜的過(guò)濾裝置上進(jìn)行抽濾，注意抽濾時(shí)負(fù)壓不要過(guò)大以免抽破濾膜。待抽濾快結(jié)束時(shí)用水清洗抽濾器內(nèi)壁，抽濾結(jié)束后取出濾膜，撕去多余空白濾膜然后將有抽濾物的部分對(duì)折放入離心管中。在每個(gè)離心管中加入一顆研磨珠，將抽濾物和研磨珠壓至離心管底部，用分液器在每支離心管中定量加入丙酮溶液10 mL蓋上蓋子，將離心管移至多樣品組織研磨機(jī)上充分研磨5 min。取出離心管移至離心機(jī)以轉(zhuǎn)速3000 r/min的速度離心10 min，取出離心管用紙包好放入0～4℃的冰箱中避光浸泡提取2 h。以實(shí)驗(yàn)室用水代替樣品做空白實(shí)驗(yàn)。

1.4 分析

打開(kāi)分光光度計(jì)電源并預(yù)熱15 min，以丙酮溶液進(jìn)行儀器調(diào)零。用針式濾器將浸泡提取好的樣品過(guò)濾至比色皿中在波長(zhǎng)750 nm、664 nm、647 nm、630 nm處測(cè)量并記錄吸光度。波長(zhǎng)750 nm處吸光度測(cè)量值應(yīng)小于0.005，測(cè)定值不滿足要求時(shí)需檢查比色皿中樣品是否存在氣泡，如有必要進(jìn)行二次過(guò)濾后測(cè)定。

結(jié)果計(jì)算[4]，按照實(shí)驗(yàn)流程首先計(jì)算出定容后提取液中葉綠素a的質(zhì)量濃度為：

然后再計(jì)算出水樣中葉綠素a的質(zhì)量濃度為：

式中：

ρ1——水樣的葉綠素a質(zhì)量濃度，μg/L；

ρ2——提取液的葉綠素a質(zhì)量濃度，mg/L；

A 664——提取液在664 nm波長(zhǎng)測(cè)定的吸光度；

A 647——提取液在647 nm波長(zhǎng)測(cè)定的吸光度；

A 630——提取液在630 nm波長(zhǎng)測(cè)定的吸光度；

A 750——提取液在750 nm波長(zhǎng)測(cè)定的吸光度；

V1——提取液定容體積，mL；

δ——比色皿光程，cm；

V——水樣體積，L。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析結(jié)果

2.1.1 準(zhǔn)確度

為驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確度對(duì)滇池某采樣點(diǎn)（葉綠素a含量：79 ug/L）的水樣進(jìn)行6次加標(biāo)平行檢測(cè)，在每個(gè)樣品中加入1.00 ug/mL的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.50 mL。計(jì)算該樣品的加標(biāo)回收率，結(jié)果顯示加標(biāo)回收率為78.00%～106.0%，見(jiàn)表1。

2.1.2 精密度

為驗(yàn)證本方法的精密度分別對(duì)滇池某采樣點(diǎn)A（葉綠素a含量：27 ug/L）和樣點(diǎn)B（葉綠素a含量：46 ug/L）的水樣各進(jìn)行10次平行檢測(cè)，計(jì)算該樣品分析結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果顯示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.0%～6.0%之間，見(jiàn)表2。

2.2 方法注意事項(xiàng)

（1）丙酮溶液的配制要嚴(yán)格按照90 mL丙酮+10 mL純水的比例進(jìn)行配制，否則在測(cè)試過(guò)程中可能會(huì)造成吸收峰的漂移，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（2）葉綠素a見(jiàn)光易分解，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中浸泡提取要注意避光操作。

（3）抽濾的過(guò)程中要避免因?yàn)槌闉V壓力過(guò)大而造成葉綠素a的損失，因?yàn)檫^(guò)大的抽濾壓力會(huì)造成樣品細(xì)胞被破壞或穿透濾膜。

（4）為保證浮游植物能夠被充分研磨，研磨時(shí)間至少應(yīng)保證5 min以上，研磨充分的樣品比較容易提取和分離。

3 結(jié) 語(yǔ)

提高工作效率，降低工作負(fù)荷和勞動(dòng)強(qiáng)度，保護(hù)工作人員身心健康是現(xiàn)代企業(yè)管理的重要組成部分。用研磨機(jī)代替手工研磨進(jìn)行樣品制備，不但能夠有效地降低分析人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，還能減少工作人員在研磨過(guò)程中造成葉綠素a的損失，提高分析準(zhǔn)確度。丙酮對(duì)人體的傷害極大，人工操作過(guò)程中丙酮易揮發(fā)，對(duì)研磨過(guò)程進(jìn)行密閉處理是不現(xiàn)實(shí)的。所以不論從分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、人工操作的安全性還是從人機(jī)功效方面的考慮，采用機(jī)器研磨的方式代替手工研磨都勢(shì)在必行。

參考文獻(xiàn)

[1]黃曉麗，羅婭敏，趙志友，等.葉綠素a分光光度法的研究[J].科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新，2021（24）：41-42

[2]張婧.水中葉綠素a測(cè)定方法的比較研究[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2022，12（19）：130-134

[3]鄒敏，蹇川，李文俊.葉綠素a分光光度法測(cè)定探討[J].皮革制作與環(huán)?？萍?，2021，2（2）：18-20.

[4]生態(tài)環(huán)境部.水質(zhì) 葉綠素a的測(cè)定 分光光度法：HJ 897—2017[S].

作者簡(jiǎn)介

趙榮龍，本科，工程師，研究方向?yàn)榄h(huán)境分析與保護(hù)。

（責(zé)任編輯：張瑞洋）