高喧翔，梅馨瀾，朱澤丹，陳鴻杰，樊繼開，楊素華，劉玲玲，班兆軍

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院；浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室；浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023）

蛋白質(zhì)自組裝纖維已經(jīng)吸引了各研究領(lǐng)域的關(guān)注，如納米技術(shù)、食品、電子、醫(yī)藥和軟物質(zhì)科學(xué)［1］。蛋白纖維的形成一般是在酸性環(huán)境下進(jìn)行熱處理而引起的。在加熱過程中，蛋白質(zhì)會展開、水解，然后自我組裝成纖維狀聚集體［2］，如乳清蛋白［3］、溶菌酶［4］、β－乳球蛋白［5］等均可在一定條件下，形成直徑約為2 ～8 nm，長度為20 ～30 μm的蛋白纖維。

在食品科學(xué)領(lǐng)域，蛋白纖維化主要作為改善蛋白功能性質(zhì)的一種方法［6］。蛋白質(zhì)經(jīng)纖維化改變后，表面會呈現(xiàn)出多種反應(yīng)性官能團(tuán)，這使得它們被賦予新的功能特性。蛋白纖維會導(dǎo)致表觀黏度的顯著增加，形成黏性黏彈性界面，從而帶來高泡沫和乳液穩(wěn)定性［7］。在極低濃度下，纖維蛋白可以產(chǎn)生冷凝凝膠，這被歸因于空間填充網(wǎng)絡(luò)的形成［8］。除此之外，蛋白纖維還具有增強聚合物膜，作為輸送載體以及在制造生物傳感器和生物吸附劑（主要作為支架）的應(yīng)用［9］。然而，蛋白質(zhì)纖維化進(jìn)程是極其復(fù)雜的，受諸多因素影響，如體系溫度、鹽離子、不良溶劑等，人們對蛋白纖維的調(diào)控手段及穩(wěn)定機理還知之甚少。

酸誘導(dǎo)劑會影響自組裝纖維化進(jìn)程，不同強度的酸溶劑電解能力不同，由此誘導(dǎo)的蛋白纖維中氫鍵濃度也不同。因此，為了更清楚地認(rèn)識蛋白質(zhì)纖維化組裝規(guī)律，本研究選擇用醋酸和鹽酸對SPI進(jìn)行纖維化處理，然后探究不同SPI 自組裝纖維的結(jié)構(gòu)、乳化特性、凝膠特性及成膜性質(zhì)，以實現(xiàn)蛋白纖維的可控化制備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)堿溶酸沉法實驗室自制大豆分離蛋白，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（94.30 ±1.54）%；冰醋酸、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HCJ－4G磁力攪拌水浴鍋，Zetasizer Nano 納米粒度儀，Mastersizer 3000 粒度分布儀，Multimode SPM原子力顯微鏡，Chirascan 圓二色譜儀，日立F －4500熒光分光光度計，TA－XT2i質(zhì)構(gòu)儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 SPI纖維化溶液制備與性質(zhì)表征

用一定濃度的HCl溶液和醋酸溶液將SPI 粉末溶解，調(diào)節(jié)pH至2.0，配制成質(zhì)量濃度為60 mg／mL溶液；放入水浴鍋加熱5 h，期間每隔15 min進(jìn)行1 次驗調(diào)，得到由鹽酸誘導(dǎo)形成的SPI 纖維（H －SPI）和由醋酸誘導(dǎo)形成的SPI纖維（C－SPI）；另取SPI粉末溶于PBS溶液（pH ＝7.0，5 mmol／L）配制成質(zhì)量濃度為60 mg／mL的蛋白溶液，放入水浴鍋加熱5 h，作為對照樣品（N－SPI）。

二級結(jié)構(gòu)測定：使用圓二色譜儀在190 ～260 nm之間進(jìn)行掃描，測量質(zhì)量濃度為0.2 mg／mL，掃描速度20 nm／min，帶寬1 nm。二級結(jié)構(gòu)含量的分析和計算根據(jù)在線網(wǎng)站http：／ ／ dichroweb. cryst. bbk. ac. uk獲得。

粒度測定：采用馬爾文粒度分析儀測定LYZ 的平均粒徑和粒度分布。將A －LYZ 溶液用醋酸溶液（pH ＝2.0）稀釋至0.5 mg／mL。O － LYZ 溶液用0.01mol／L的PBS緩沖溶液（pH ＝7.0）進(jìn)行稀釋。

微觀形態(tài)：LYZ 經(jīng)過纖維化前后的顆粒形貌通過原子力顯微鏡（AFM）觀察得到。A －LYZ 溶液用醋酸溶液（pH ＝2.0）稀釋至25 μg／mL，O－LYZ溶液用去離子水稀釋。取20 μL稀釋后的溶液滴加在新鮮剝離的云母片表面，等待自然風(fēng)干。在輕敲模式下進(jìn)行測量，AFM觀測到的圖像用NanoScope Analysis 1.9 軟件進(jìn)行圖像處理和分析。

硫黃素（ThT）熒光分析：實驗方法參考朱連昌［7］。使用10 mmol／L、pH ＝7.0 的磷酸鹽緩沖溶配置質(zhì)量濃度為0.016 mg／mL 的ThT 工作液。取5 mL工作液與30 μL樣品混合均勻，測定混合液熒光強度。測定條件設(shè)為激發(fā)波長460 nm，發(fā)射波長490 nm，狹縫間隙5 nm，電壓700 mV，掃描范圍為470 ～600 nm。

1.3.2 凝膠的制備與性質(zhì)測定

將制備N－SPI、H －SPI、C －SPI 溶液中的蛋白質(zhì)量濃度提高至100 mg／mL，并將樣品于4 ℃靜置24 h，得到N－SPI、H－SPI、C－SPI凝膠。

采用質(zhì)構(gòu)儀測定蛋白凝膠的凝膠硬度。在室溫下，選取P5 探頭（直徑5.0 mm），輸入測前速度為2.0 mm／s，測中速度為1.0 mm／s，測后速度為3.0 mm／s，觸變力為3.0 g，壓縮的變形量為50%。

1.3.3 乳液的制備及性質(zhì)測定

向N－SPI、H －SPI、C －SPI 溶液中緩慢地加入不同油相比的食用油（油體積分?jǐn)?shù)φ ＝0.2、0.4、0.6），用均質(zhì)機在10 000 r／min轉(zhuǎn)速下均質(zhì)3 min，得到N－SPI、H－SPI、C－SPI乳液。

乳液的微觀形態(tài)采用光學(xué)顯微鏡觀察。乳液的粒徑利用Mastersizer 3000 粒度分布儀測定。分散劑為去離子水，乳液的相對折射率為1.470，分散劑折射率為1.330。

脂肪上浮率（CI）：取10 mL新制乳液于小瓶中，在室溫下放置，并記錄不同時間下層清液的高度（HS）和總高度（HT）。

1.3.4 膜的制備及性質(zhì)測定

分別取10 mL N －SPI、H －SPI、C －SPI溶液，各加入0.2 g甘油，攪拌均勻后采用流延法于聚四氟乙烯平皿中制備薄膜，室溫下干燥后揭膜，置于RH＝40%干燥器保存待用。膜的厚度選取薄膜的5 個點進(jìn)行測量，計算平均值，精確至0.001 mm。

機械性能：薄膜機械性能主要測定抗拉強度（TS）和斷裂伸長率（E）。將薄膜裁剪成2 cm×6 cm的規(guī)格，用夾具固定進(jìn)行測量，初始夾距30 mm，拉伸速度50 mm／min［10］。

水蒸氣透過率：水蒸氣透過率（WVP）和水溶性（WS）的測定見文獻(xiàn)［11］。干燥器內(nèi)放入BaCl2飽和溶液使其濕度保持在90%。選擇敞口玻璃容器放入烘干至恒重的CaCl2并將裁剪的薄膜覆蓋在玻璃容器表面，用礦脂密封后置于干燥器中，每隔一段時間稱量玻璃容器的質(zhì)量，并按式（2）計算薄膜的WVP。

式中：WVP為濕系數(shù)／g·mm／（m·d·Pa）；Δm為t時間內(nèi)質(zhì)量增量／g；X為膜的厚度／mm；A為透濕杯的有效測定面積／m2；t為時間間隔／h。

水溶性：將薄膜裁剪成2 cm ×2 cm 的規(guī)格，在105 ℃下干燥至恒重m1。加入50 mL去離子水在室溫下溶解24 h，將水倒掉，干燥至恒重為m2，根據(jù)質(zhì)量變化計算薄膜的水溶性。

式中：m1為第1 次干燥至恒重時薄膜的質(zhì)量／g；m2為第2 次干燥至恒重時薄膜的質(zhì)量／g。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Origin 2020b軟件、Excel軟件和SPSS對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白纖維化

SPI纖維化反應(yīng)前后的粒度分布和平均粒徑如圖1 所示。原始SPI（N－SPI）的粒徑成單峰分布，平均粒徑約為（24 ±1.5）nm，與之前的報道相符［12］。經(jīng)鹽酸誘導(dǎo)的蛋白溶液（H －SPI）體積分布較N －SPI粒徑顯著增大，且呈雙峰分布，峰值分別在（35 ±5.3）、（719.3 ±37.9）nm 處。說明鹽酸誘導(dǎo)的SPI在85 ℃熱處理過程中發(fā)生聚集而形成較大顆粒。相較于H－SPI，經(jīng)醋酸誘導(dǎo)的蛋白溶液（C －SPI）粒徑進(jìn)一步增大，平均粒徑增大至（1 431. 6 ±56. 5）nm，這是由于蛋白質(zhì)單體在疏水作用和靜電斥力作用下發(fā)生纖維化轉(zhuǎn)變的結(jié)果［13］。

圖1 3 種蛋白溶液的粒徑分布圖和平均粒徑

SPI經(jīng)纖維化處理后的微觀形態(tài)如圖2 所示。N－SPI為20 ～240 nm 的球形顆粒，分散性良好，與粒徑分布結(jié)果一致。H－SPI外觀呈長而細(xì)，無分支，部分彎曲狀態(tài)，長度為450 ～920 nm。在Xiang等［14］的研究中也發(fā)現(xiàn)了大豆分離蛋白進(jìn)行纖維化處理后出現(xiàn)了蠕蟲樣的原纖維以扭曲的形式存在。C －SPI呈蠕蟲樣的卷曲狀，長度約為700 ～1 500 nm。鹽酸和醋酸誘導(dǎo)出不同淀粉樣纖維的原因可能與兩者氫離子濃度不同相關(guān)，同一pH 下，醋酸溶液電離出的氫離子濃度更高，蛋白纖維中氫鍵濃度也更高，其誘導(dǎo)形成的蛋白纖維更加綿長。

圖2 原子力顯微鏡2D和3D成像圖

蛋白質(zhì)纖維化往往伴隨分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，特別是β －折疊結(jié)構(gòu)的形成［15］。ThT能平行插入β －折疊結(jié)構(gòu)并與其結(jié)合，導(dǎo)致蛋白最大熒光強度顯著增大，可利用該原理檢測蛋白質(zhì)纖維化反應(yīng)動力學(xué)，并以此判斷蛋白纖維形成［16］。如圖3a 所示，N － SPI具有較低的ThT 熒光強度（～1 932）。隨著纖維化時間的延長，H －SPI 的ThT 最大熒光強度由1 932增加至3 853，C－SPI增加至4 711，至5 h 以后保持平穩(wěn)，這說明經(jīng)纖維化處理，大豆蛋白β －折疊結(jié)構(gòu)總量大大增加且纖維化的最優(yōu)時間為5 h。之后，進(jìn)一步利用CD 判斷SPI 經(jīng)纖維化處理前后二級結(jié)構(gòu)的變化情況，如圖3b所示，N－SPI在208 nm處具有明顯的負(fù)平均殘基橢圓率，表明原始SPI以α －螺旋為主。SPI經(jīng)鹽酸纖維化處理后，波長從208 nm 移到203 nm，同時最大負(fù)平均殘基橢圓率增加。而SPI經(jīng)醋酸處理后的最大負(fù)平均殘基橢圓率進(jìn)一步增大，表明形成了更多的β －折疊結(jié)構(gòu)。由BeStSel 軟件計算可知，H－SPI和C－SPI的β －折疊質(zhì)量分?jǐn)?shù)由34.50%分別提高到40.80%和42.40%。

圖3 蛋白在熱處理過程中的Th T最大熒光強度和蛋白溶液的遠(yuǎn)紫外光譜

2.2 凝膠特性

蛋白纖維化最明顯的特征就是β －折疊結(jié)構(gòu)明顯增多，而富含β－折疊結(jié)構(gòu)的材料通常具有獨特的高比表面積和機械強度，從而表現(xiàn)出較好的膠凝和成膜能力［17］。如圖4 所示，N －SPI、H －SPI、C －SPI的凝膠硬度分別為181.94、234.64、399.31 g。相比之下，顆粒型蛋白凝膠的硬度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于纖維型蛋白凝膠，而由醋酸調(diào)配的纖維型蛋白凝膠的硬度更是高于由鹽酸調(diào)配的纖維型蛋白凝膠。凝膠的持水能力則體現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子與水分子間的氫鍵相互作用，通常兩者作用力越強，蛋白的持水能力越強［18］。由圖4 可知C－SPI型凝膠蛋白分子與水的結(jié)合能力最強，這說明醋酸誘導(dǎo)的蛋白纖維化表面擁有更多的氫鍵位點。

圖4 3 種蛋白凝膠的凝膠硬度和持水能力

2.3 成膜性質(zhì)

3 種蛋白的成膜能力則是通過測定其膜的機械性能和屏障性能表示。TS 和E 分別反映了薄膜的變形抗力和韌性［19］。如表1 所示，纖維化處理對N－SPI薄膜的TS和E影響較為顯著，尤其是C－SPI的E值，比N－SPI提高7.1 倍。主要的原因是在酸熱處理過程中，蛋白質(zhì)的β－折疊結(jié)構(gòu)及氫鍵濃度的增加，由此形成堅固致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而得到具有一定機械強度和柔韌性兼具的薄膜［20］。蛋白薄膜的WVP和WS則反應(yīng)了蛋白薄膜的屏障性能，如表1所示。與N－SPI 薄膜相比，纖維化薄膜的WVP 和WS均有明顯的下降，說明纖維化后薄膜擁有更強的阻水性能，這在一定程度上反映了纖維化薄膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密性，纖維化薄膜更能有效地隔絕水分［21］。

表1 薄膜的機械性能、水蒸氣透過率和水溶性

2.4 乳化性質(zhì)

纖維化是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開再折疊的過程，該過程結(jié)束后，蛋白質(zhì)的柔順性會發(fā)生巨大改變［22］。據(jù)報道，蛋白質(zhì)的柔順性與其乳化性密切相關(guān)［23］。以C－SPI和H －SPI與N －SPI為乳化穩(wěn)定劑，制備水包油乳液，并對比研究三者的乳化性質(zhì)。在c和φ相同的條件下，蛋白的乳化活性可以由乳液平均粒徑反映。由圖5 所示，而相同的濃度和油相比的條件下，顆粒型蛋白乳液平均粒徑遠(yuǎn)大于纖維型蛋白乳液平均粒徑，其中由醋酸調(diào)配的纖維型蛋白乳液的平均粒徑要低于由鹽酸調(diào)配的纖維型蛋白乳液。當(dāng)油相比增大時，乳液的粒徑不斷增大。這是因為油滴濃度的增大，穩(wěn)定乳化界面的乳化劑越少，導(dǎo)致油滴間產(chǎn)生相互作用的概率增大，在疏水相互作用下形成粒徑更大的油滴［24］。圖6 為該場合下，不同油相比的3 種蛋白乳液稀釋后的顯微鏡照片，C －SPI乳液的粒徑隨著油滴濃度的增大，粒徑增大幅度較小，這可能與C－SPI的結(jié)構(gòu)柔順性有關(guān)。蛋白柔順性越高，吸附在油水界面的穩(wěn)定性越高，那么其穩(wěn)定乳液界面的能力就越強。

圖5 3 種蛋白乳液在不同油相比中的平均粒徑（c ＝1 mg／100 mL）

乳液油滴之間互相絮凝、結(jié)合產(chǎn)生新的更大的油滴聚合體，因為油和水密度的不同，會迅速形成分層，也就是脂肪上浮現(xiàn)象［25］。圖7 是質(zhì)量濃度為1 mg／100 mL的N－SPI、H－SPI、C －SPI型乳液在室溫下靜置14 d過程中脂肪上浮的情況。3 種乳液均在3 d內(nèi)達(dá)到最大脂肪上浮率，且其脂肪上浮率隨φ的增大而減小，纖維化乳液的脂肪上浮率略小于顆粒型乳液，而C －SPI 乳液的穩(wěn)定性略優(yōu)于H －SPI乳液。造成以上差異的原因可能是纖維化蛋白富含β－折疊結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出更高的表面疏水性，更易在油水界面形三維網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)速度大于脂肪上浮的速度時，就會一定程度上抑制脂肪上浮，由此可見，SPI纖維化程度越高，乳液的脂肪上浮穩(wěn)定性越高［7］。

圖7 3 種蛋白乳液在不同油相比下的脂肪上浮情況

3 結(jié)論

以SPI 和由鹽酸和醋酸誘導(dǎo)的SPI 纖維為研究對象，對比研究其結(jié)構(gòu)特征、乳化特性、凝膠特性及成膜性質(zhì)的差異。AFM、CD等實驗分析表明在酸熱處理下淀粉樣原纖維的形成，并且由醋酸誘導(dǎo)的纖維化蛋白β－折疊結(jié)構(gòu)比例最高。纖維化處理不僅提高了SPI的凝膠硬度與持水性，并顯著改善了SPI薄膜的機械性能和阻隔性能，尤其是C －SPI型薄膜對SPI 薄膜柔韌性的改變顯著。在質(zhì)量濃度為1 mg／100 mL條件下，蛋白纖維穩(wěn)定的乳液具有更優(yōu)的乳化活性和脂肪上浮穩(wěn)定性，且穩(wěn)定程度與纖維化程度呈正相關(guān)。因此，可通過選擇合適的酸誘導(dǎo)劑種類，調(diào)控蛋白的纖維化程度，實現(xiàn)蛋白纖維材料功能特性的優(yōu)化，為基于蛋白纖維的新型納米材料的研發(fā)提供參考。