魏 娜，張飛龍

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測研究所，拉薩 850032）

曲霉屬真菌分布廣泛，是常見的食品、糧食、環(huán)境污染菌，能在適宜的條件下代謝產(chǎn)生對動物和人類具有致病性的次級代謝產(chǎn)物［1－3］。例如由黃曲霉菌（Aspergillus flavus）和寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）等產(chǎn)生的次生代謝物黃曲霉毒素（AFB1），具有劇毒和強致癌性，國際癌癥研究機構將其列為一級致癌物［4，5］；赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）產(chǎn)生的赭曲霉毒素（OTA）具有較強的腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性，能夠致癌、致畸、致突變，國際癌癥研究機構和世界衛(wèi)生組織將其列為2B 類致癌物［6，7］；雜色曲霉（Aspergillus uersicolor）和構巢曲霉（Aspergillus nidulans）產(chǎn)生的雜色曲霉毒素（ST）基本結構與黃曲霉毒素十分相似，毒性也僅次于黃曲霉毒素，國際癌癥研究機構將其歸類為2B 類致癌物。為防止真菌毒素對人體的危害，GB 2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》規(guī)定小麥、大麥、其他谷物及其制品中黃曲霉毒素B1（AFB1）、OTA均不得超過5 μg／kg，花生中AFB1不得超過20 μg／kg。歐盟食品安全局（EFSA）于2013 年6 月7日發(fā)布了食品和飼料中的雜色曲霉毒素對公眾的健康風險意見［8－10］。

真菌污染是制約糧油產(chǎn)業(yè)發(fā)展和出口貿(mào)易的主要危害因子。目前，國內(nèi)已有許多學者報道我國糧油作物受黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、雜色曲霉毒素等多種曲霉菌毒素污染［11－17］。目前國內(nèi)外對曲霉屬產(chǎn)毒菌分布、產(chǎn)毒能力也做了大量研究。Cotty［18］發(fā)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品容易被黃曲霉菌侵染產(chǎn)生黃曲霉毒素，產(chǎn)AFB的量和類型是由基質(zhì)、環(huán)境和菌株共同決定的。Cotty等［19］發(fā)現(xiàn)黃曲霉菌數(shù)量隨著地區(qū)溫度升高而增加，隨著緯度升高反而減少，且其產(chǎn)毒能力具有明顯的地域差異特征。Daou 等［20］研究表明，真菌產(chǎn)毒力也受氣候條件影響。西藏高原具有獨特的高原生態(tài)類型，對研究曲霉毒菌及其毒素污染發(fā)生消長變化規(guī)律與預警防控等具有重要意義，但有關研究鮮有報道。因此，實驗連續(xù)5 年開展西藏地區(qū)不同類型作物曲霉菌毒素污染評估，通過對西藏糧油樣品中曲霉菌分離、鑒定以及黃曲霉菌株產(chǎn)毒力差異分析研究，探明西藏曲霉菌污染發(fā)生與污染分布特征，為西藏糧油作物曲霉毒素污染多維預警與精準防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞和小麥樣品采集：連續(xù)5 年分別從西藏拉薩市、山南市、日喀則市、林芝市、昌都市、阿里地區(qū)采集麥類作物樣品共計1 131 份，其中2017 年750份，2018 年149 份，2019 年191 份，2020 年150 份，2021 年151 份。

花生樣品采集：連續(xù)5 年從西藏林芝市采集花生樣品共計144 份，其中2017 年24 份，2018 年48份，2019 年24 份，2020 年24 份，2021 年24 份。

1.2 方法

1.2.1 籽粒樣品真菌毒素檢測方法

青稞、小麥、花生籽粒晾干磨碎后，稱取5 g樣品（精確到0.02 g），加入10 mL 水充分浸潤后，再加入10 mL 的V甲酸∶V乙腈（1∶9）溶液，室溫下?lián)u床1 h。加入QuEChERS鹽包，5 000 g轉(zhuǎn)速下離心5 min。玻璃纖維紙過濾后吸取1 mL 樣品濾液直接加入SPE 小柱，待流干后加入0.5 mL乙腈洗脫，吹干，收集全部流出液。乙腈水溶液（體積比1∶1）定容到1 mL，過0.22 μm有機濾膜后，采用高效液相色譜法測定真菌毒素含量。色譜條件為：色譜柱為Eclipse XDB － C18（5 μm，4.6 mm ×150 mm）；柱溫為35 ℃；流動相為V甲醇∶V水（40∶60）；流速為0.7 mL／min；采用柱后光化學衍生法：光化學衍生器254 nm；以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm，進樣量10 μL。

1.2.2 曲霉菌的分離、純化與鑒定

取10 g樣品，加入90 mL滅菌水，在室溫用渦旋振蕩器振蕩30 min，制成0.1 g／mL樣品菌懸液；再取0.1 g／mL樣品菌懸液加入9 mL無菌水試管中，制備出0.01 g／mL 稀釋度的懸浮液。每個稀釋度取50 μL菌液，涂布在PDA培養(yǎng)基上［14］，霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)5 d，每個稀釋度重復2 次。經(jīng)形態(tài)學初步觀察后進行分離純化，直至得到單個菌落進行ITS（Internal Transcribed Spacer）分子生物學鑒定。引物序列為ITS1：5’－ TCCGTAGGTGAACCTGCGG － 3’，ITS4：5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’。

1.2.3 產(chǎn)毒菌株培養(yǎng)與測毒

將鑒定獲得的黃曲霉菌株在察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在真菌培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d 后，用含0.1%（體積分數(shù)）的吐溫無菌水將孢子從培養(yǎng)基上沖洗下來，制備黃曲霉菌孢子液備用。將制備好的黃曲霉分生孢子液在光學顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子液的濃度定為1.5 ×107個／mL。加30 mL沙氏液體培養(yǎng)基于100 mL 錐形瓶中，加入1 mL 孢子液，在搖床內(nèi)以200 r／min速率28 ℃培養(yǎng)7 d后過濾收集菌絲，裝入5 mL 凍存管放置凍干機2 d。凍干后準確稱取50 mg菌絲，加入甲醇－乙腈－水溶液（體積比2∶2∶1），放入研磨儀中研磨后，50 ℃超聲10 min，離心取上清液，上清液加入甲醇－二氯甲烷－乙酸乙酯溶液（體積比1∶1∶1），再次50 ℃超聲10 min后，離心取上清液，過0.22 μm有機濾膜后，采用高效液相色譜法測定真菌毒素含量。色譜條件同1.2.1。

1.2.4 超標率判定

參照GB 2761—2017，青稞和小麥中AFB1、OTA限量值為5. 0 μg／kg?；ㄉ蠥FB1限量值為20 μg／kg。GB 2761—2017 未規(guī)定毒素限量值的，本實驗不做判定。

2 結果與分析

2.1 西藏主要農(nóng)作物曲霉屬真菌污染研究

選取204 份樣品（135 份青稞，57 份小麥，12 份花生樣品），以PDA為分離培養(yǎng)基，通過形態(tài)學和分子生物學鑒定，共分離出15 種411 株曲霉菌，其中32 份青稞樣品受到曲霉菌污染，樣品的感染率為23.70%；9 份小麥樣品受曲霉屬真菌污染，樣品感染率為15.79%；8 份花生樣品受曲霉屬真菌污染，樣品感染率為66.67%。411 株曲霉菌中，6 株菌株未能鑒定到種，其他菌株分別為：A. amstelodami、A. aryzae、A. awamori、A. chevalieri、A. costaricaensis、A. cristatus、A. flavus、A. fumigatus、A. minisclerotigenes、A. nidulans、 A. niger、 A. rugulosus、 A. tubingensis、A. unguis、A. ustus。表1 可見，青稞共中分離到11 種曲霉菌，主要是菌種為A. flavus、A. niger、A. tubingensis；小麥中分離到8 種曲霉菌，其主要菌種為：A. amstelodami、A. niger、A. tubingensis；花生種分離到曲霉菌的僅有A. aryzae、 A. flavus、A. minisclerotigenes 3 種曲霉菌。A. flavus 是青稞、小麥、花生共有的污染菌。青稞、小麥中優(yōu)勢種均為A.niger，分離頻度分別為65.33%、31.25%?；ㄉ鷥?yōu)勢種為A. flavus，就花生不同部位而言，分離到的82%黃曲霉菌來自花生殼，18%來自花生仁。

表1 西藏不同農(nóng)作物曲霉菌種類及百分比

2.2 西藏不同農(nóng)作物真菌毒素污染研究

由表2 可見，2017—2021 連續(xù)5 年對西藏糧油作物（青稞、小麥、花生）中6 種主要真菌毒素污染進行監(jiān)測，結果表明西藏青稞、小麥、花生真菌毒素污染相對較輕。

表2 西藏不同作物不同年限真菌毒素污染率／%

污染西藏麥類作物的真菌毒素主要為雜色曲霉毒素，其次為赭曲霉毒素，二者連續(xù)5 年均有檢出，雜色曲霉毒素檢出率范圍為1.31% ～10.74%，赭曲霉毒素檢出率范圍為0.56% ～4.70%，超標率范圍為0.00% ～3.36%。麥類作物種4 種黃曲霉毒素污染較輕，僅2017、2018、2020 年有檢出，且僅有1 種黃曲霉毒素檢出，檢出率最高為2.68%，超標率最高為2.01%，AFB1檢出量最高為29.67 μg／kg，AFB2檢出量最高為23. 10 μg／kg，AFG2檢出量最高為43. 16 μg／kg。

花生樣品僅有黃曲霉毒素污染，2017 年24 份花生樣品中僅有1 份樣品黃曲霉毒素有檢出，AFB1含量為38.67 μg／kg，AFB2含量為8.77 μg／kg，黃曲霉毒素總含量為47.44 μg／kg，AFB1檢出率和超標率均為4.17%；AFG1、AFG2均未檢出；2018 年48 份樣品中僅有1 份樣品黃曲霉毒素有檢出，AFB1含量為58.44 μg／kg，AFB2含量為8.69 μg／kg，黃曲霉毒素總含量為67.13 μg／kg，AFB1、AFB2檢出率和超標率均2.08%。2019—2021 年24 份樣品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2均未檢出。

2.3 不同黃曲霉菌株產(chǎn)毒力差異研究

對分離得到的60 余株黃曲霉菌株進行產(chǎn)毒力檢測，結果表明，西藏高原不同黃曲霉菌株產(chǎn)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、黃曲霉總量（AFT）含量范圍分別為0.0 ～35 050.5 μg／kg、0.0 ～4 232.9 μg／kg、0.0 ～19.2 μg／L、0.0 ～7.7 μg／kg、0.0 ～39 310.3 μg／kg；平均含量分別為3 534.2、447.7、2.2、1.2 μg／kg。其中青稞中黃曲霉菌株產(chǎn)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均含量分別為1 531.56、85.38、0.00、0.03 μg／kg；小麥中黃曲霉菌株產(chǎn)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均含量分別為6 409.76、426.14、0.00、0.02 μg／kg；花生中黃曲霉菌株產(chǎn)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均含量分別為665.92、953.55、4.90、4.49 μg／kg。西藏高原黃曲霉菌株產(chǎn)AFB1和AFB2毒素能力較強，產(chǎn)AFG1和AFG2毒素能力較弱，表3 相關分析表明，西藏菌株產(chǎn)AFB1含量與AFB2顯著正相關，相關系數(shù)為0.508；產(chǎn)AFG1含量與AFG2顯著正相關，相關系數(shù)為0.822；B族毒素與G族毒素整體呈負相關。

表3 不同類型黃曲霉毒素含量相關性

從麥類作物分離的所有黃曲霉菌株均能產(chǎn)黃曲霉毒素。其中產(chǎn)AFB1黃曲霉菌株數(shù)量最多，占總菌株數(shù)量98.11%，其次為AFB2菌株，占所有菌株數(shù)占總菌株數(shù)量的66.04%，產(chǎn)AFG1、AFG2菌株數(shù)量最少，分別為33.96%、20.75%。圖1 可見，產(chǎn)毒菌株按照檢測到的毒素種類分為6 種：只產(chǎn)AFB1，只產(chǎn)AFG1，只有AFB1和AFB2，只產(chǎn)AFB1和AFG1，產(chǎn)AFB1、AFB2、AFG1，產(chǎn)AFB1、AFB2、AFG2，產(chǎn)AFB1、AFG1、AFG2，有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。產(chǎn)毒菌株以產(chǎn)AFB1、AFB2為主，占所有菌株47.17%；其次是只產(chǎn)AFB1、AFG2菌株，占比16.98%；只產(chǎn)AFB1菌株占所有菌株的11.32%；4 種毒素都產(chǎn)的菌株占比為9.43%；其他4 種類型產(chǎn)毒菌株占比為1. 89% ～3.77%。

圖1 黃曲霉菌株產(chǎn)毒類型

從花生分離出的所有黃曲霉菌株均能產(chǎn)黃曲霉毒素。其中產(chǎn)AFB1黃曲霉菌株數(shù)量最多，占總菌株數(shù)量94.44%，其次為產(chǎn)AFG2菌株和AFB2菌株，分別占所有菌株數(shù)占總菌株數(shù)量的77.78%、72.22%，產(chǎn)AFB2菌株數(shù)量最少，為61.11%。圖1 可見，產(chǎn)毒菌株按照檢測到的毒素種類分為6 種：只有AFB1，只有AFB1和AFG2，只有AFB2、AFG2，有AFB1、AFB2、AFG1，有AFB1、AFB2、AFG2，有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。產(chǎn)毒菌株以產(chǎn)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2為主，占所有菌株55.56%；其次是只產(chǎn)AFB1菌株，占比16.67%；只產(chǎn)AFB1和AFG2黃曲霉菌株占所有菌株的11.11%，其他3 種類型產(chǎn)毒菌株各占5.56%。

為進一步研究黃曲霉毒素的產(chǎn)毒能力的大小，本研究根據(jù)菌株產(chǎn)黃曲霉毒素含量，將其產(chǎn)毒能力劃分為4 個等級：高產(chǎn)毒菌（＞1 000 μg／kg）、中產(chǎn)毒菌（100 ～1 000 μg／kg）、低產(chǎn)毒菌（0 ～100 μg／kg）和不產(chǎn)毒菌（ND）。

如表4 所示，麥類作物低產(chǎn)AFT 菌株占32.07%，中產(chǎn)AFT 菌株占33.95%，高產(chǎn)AFT 菌株僅占22.64%。花生低產(chǎn)AFT菌株占44.45%，高產(chǎn)AFT菌株占44.44%，中產(chǎn)AFT 菌株僅占11.12%。雖然麥類作物高產(chǎn)毒菌株比例低于花生，但產(chǎn)毒量5 000 μg／kg的麥類作物占比16. 80%，花生為0.00%。

表4 西藏黃曲霉菌株產(chǎn)毒力分布

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)污染西藏麥類作物的真菌毒素主要為雜色曲霉毒素，其次為赭曲霉毒素，但本研究中并未分離到產(chǎn)雜色曲霉的常見菌株雜色曲霉和構巢曲霉及產(chǎn)赭曲霉毒素的赭曲霉菌株，分離出大量黑曲霉（A.niger），黑曲霉曾作為食品級安全的“微生物細胞工廠”，被美國食品藥品監(jiān)督管理局認定為一般安全可靠無毒的微生物［21－23］，但現(xiàn)在越來越多研究表明黑曲霉能夠產(chǎn)出對人體有毒害作用的赭曲霉毒素［24－30］，西藏糧油作物中赭曲霉毒素污染是否來源A.niger菌株，值得進一步研究。

西藏高原花生產(chǎn)地位于西藏林芝市察隅縣，屬亞熱帶河谷氣候。冬暖夏熱，常年濕潤多雨，年平均降雨量為1 000 mm，年平均相對濕度69%，溫濕度比較適宜于黃曲霉生長，本研究中也分離到較多的黃曲霉菌，多數(shù)來自花生殼，花生殼比花生仁更易感染黃曲霉菌，這可能是因為莢殼是抵御黃曲霉菌侵染的第一道防線［31］。這些黃曲霉菌適宜溫濕度黑暗培養(yǎng)環(huán)境下，100%黃曲霉菌株都產(chǎn)AFT，且菌株產(chǎn)毒能力相當高，但西藏高原花生樣品中黃曲霉毒素污染率較低，僅為0.00% ～4.17%。探究高產(chǎn)毒真菌在西藏高原相對適宜溫濕度條件下污染率較低的原因，在溫濕度因子研究基礎上，進一步增加紫外輻射、光照時間、氧氣含量、晝夜溫差等高原氣候因子研究產(chǎn)毒真菌產(chǎn)毒機制對于推進真菌毒素高效防控具有重要意義。

據(jù)報道，黃曲霉只能產(chǎn)生B 族黃曲霉毒素，而不能產(chǎn)生G族黃曲霉毒素［32］，但也有研究表明黃曲霉能產(chǎn)生B族和G族毒素［33－35］。朱婷婷等［34］研究結果顯示，黃曲霉菌主要以產(chǎn)B 族毒素為主，具有產(chǎn)毒能力的菌株一定會產(chǎn)生危害性極大的AFB1毒素；周飄［35］研究也表明能產(chǎn)G 族毒素的黃曲霉菌株一定能產(chǎn)B族毒素。本研究結果表明西藏高原花生中黃曲霉菌株同樣是產(chǎn)B 族毒素能力較強，平均含量比G族毒素含量高100 多倍，但本研究分離到產(chǎn)G 毒素卻不產(chǎn)B 毒素這一特殊菌株，在前期研究中也發(fā)現(xiàn)僅有AFG2毒素污染，沒有其他種類黃曲霉毒素污染的現(xiàn)象［16］，高原環(huán)境下產(chǎn)毒真菌毒素發(fā)生及代謝途徑是否與平原環(huán)境不一致，高海拔地區(qū)產(chǎn)毒真菌代謝合成途徑及產(chǎn)物以及產(chǎn)毒菌株基因組學等有待進一步研究。此外，菌株檢測到產(chǎn)生不同種類毒素究竟是菌株自身產(chǎn)毒能力的差異還是代謝轉(zhuǎn)化的結果需進一步研究確證。

本研究在檢測黃曲霉菌株產(chǎn)毒力時，先采用濾液－孢外產(chǎn)毒法，結果顯示26.4%黃曲霉菌株不產(chǎn)毒，為進一步核實又采用菌絲－孢內(nèi)產(chǎn)毒進行檢測，所有菌株都能產(chǎn)毒。可見不同檢測方法對菌株產(chǎn)毒力影響很大，不同的培養(yǎng)基由于碳源、氮源及滲透壓的不同對菌株的產(chǎn)毒力也有影響［36，37］，目前國內(nèi)僅有NY／T 2311—2013 規(guī)范了黃曲霉毒素孢外檢測方法，亟需研究制定孢內(nèi)法測定菌株產(chǎn)毒能力的檢測標準，并規(guī)范不產(chǎn)毒菌株的定義。

4 結論

對西藏不同類型作物中曲霉屬菌污染情況研究表明，204 份樣品中，共分離出15 種曲霉菌，青稞樣品中曲霉菌污染率為23.70%；小麥樣品污染率為15.79%；花生污染率為66.67%。西藏高原不同作物污染優(yōu)勢菌群并不相同。麥類作物青稞、小麥中曲霉屬優(yōu)勢種均為A. niger，分離頻度高達65.33%，花生優(yōu)勢種為A. flavus。污染西藏麥類作物的真菌毒素主要為雜色曲霉毒素，其次為赭曲霉毒素。分離的所有黃曲霉菌株均能產(chǎn)黃曲霉毒素，其中產(chǎn)AFB1黃曲霉菌株數(shù)量最多。