楊興晶，劉妍如*，唐志書, ，宋忠興，周 篷，常百金，趙艷婷，劉長樂

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083

2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117

3.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700

沙棘HippophaeFructus為胡頹子科植物中華沙棘HippophaerhamnoidesL.的干燥成熟果實(shí)，本品系蒙古族、藏族習(xí)用藥材[1]，也是一種重要的藥食同源藥材[2]。其具有可健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀的功能[3]和調(diào)血脂、降血糖、抗癌等功效[4]。沙棘含有黃酮[5]、鞣質(zhì)、萜類、多糖、維生素等多種活性成分，其中黃酮類成分是沙棘的主要功效物質(zhì)[3]。

大果沙棘Hippophaerhamnoidesvat.sp L.原產(chǎn)自俄羅斯，是近年來中國從俄羅斯引進(jìn)的新品種和雜交選育的品種，表現(xiàn)出枝條無刺或少刺、果實(shí)大、果柄長、單株產(chǎn)量高等特性。其果實(shí)中含有黃酮、氨基酸、維生素等多種生物活性物質(zhì)[6]，具有廣泛的食用、美容和藥用開發(fā)價值[7]。

沙棘許多藥用功效都是通過黃酮類化合物發(fā)揮作用才實(shí)現(xiàn)的，其含有的黃酮糖苷、苷元等一些生物活性成分比較豐富，在將沙棘果實(shí)作為保健和藥用方面有著十分廣闊的前景[8]。大果沙棘作為俄羅斯引進(jìn)的選育良種的沙棘，其在國內(nèi)的研究多以種植、栽培和雜交為主[9-11]，而中華沙棘在藥用上使用較多，且已有研究表明引進(jìn)沙棘（大果沙棘）的黃酮類化合物含量較低[8,12]，安雄韜等[13]、付依依等[14]對不同品種大果沙棘果實(shí)與不同品種的沙棘總黃酮含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明總黃酮含量最高的均是中華沙棘，所以中華沙棘在藥用方面的使用頻率要大于大果沙棘。由于品種不同，藥用植物中化學(xué)成分含量不同，高韻等[15]用紅外光譜對不同種屬、不同產(chǎn)地的黃精進(jìn)行鑒別研究，李國衛(wèi)等[16]利用多元統(tǒng)計(jì)分析對不同柯子屬藥材進(jìn)行多指標(biāo)成分含量測定，得到不同種黃精屬、柯子屬藥材間所含化學(xué)成分及含量亦存在明顯差異，結(jié)果都可系統(tǒng)、全面地為藥材的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

植物代謝物組學(xué)研究不同物種、不同基因類型或不同生態(tài)類型的植物在不同生長時期或受某種刺激干擾前后的所有小分子代謝產(chǎn)物，對其進(jìn)行定性、定量分析，并找出代謝變化的規(guī)律[17]。本研究采收了不同產(chǎn)地中華沙棘和大果沙棘，借鑒植物代謝組學(xué)的思路，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)對中華沙棘、大果沙棘的差異性成分進(jìn)行分析，通過多元統(tǒng)計(jì)分析與定量分析找出其中差異顯著的化學(xué)成分及其變化規(guī)律，最后通過化學(xué)成分的含量差異對生物合成途徑的進(jìn)行分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1290 型高效液相色譜串聯(lián)AB Sciex 4500 Qtrap 三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司，美國AB Sciex 公司）；Waters Acquity UPLC H-Class 型超高效液相色譜串聯(lián) Triple TOFTM5600 三重四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國Waters 公司，美國AB Sciex 公司）；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（Sartorius 科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；TQ-200 型高速多功能粉碎機(jī)（上海市天祺盛世科技有限公司），Milli-Q 型水純化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

1.2 材料

對照品鼠李素（批號wkq21083007，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、二水槲皮素（批號wkq-21080908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）、木犀草苷（批號wkq18032905，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；對照品異鼠李素（批號MUST-21082713，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.27%）、木犀草素（批號MUST-21072311，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.52%）、水仙苷（批號MUST-20101407，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.99%）購自成都曼斯特生物科技有限公司；異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（批號HR2711W2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、山柰酚（批號HR1832W2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購自寶雞辰光生物科技有限公司；異槲皮苷（批號111809-201403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.9%）、金絲桃苷（批號111521-201809，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%）、槲皮苷（批號111538-202007，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.5%）、槲皮素（批號100081-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%）、蘆?。ㄅ?00080-201811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.7%）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號112007-202103）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品L-酪氨酸（批號0609-0109）、L-苯丙氨酸（批號624-200104）購自中國食品藥品檢定研究院；柚皮素（批號200824，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司。甲醇（分析級，成都市科隆化學(xué)品有限公司），乙腈（質(zhì)譜級，批號205179，賽默飛世爾科技有限公司公司），甲醇（色譜級，德國默克公司），甲酸（批號205775，賽默飛世爾科技有限公司公司），水為超純水（密理博Milli-Q Integral 5 超純水機(jī)制備）。

樣品為不同產(chǎn)地沙棘（表1），經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院白吉慶副教授鑒定為胡頹子科植物中華沙棘H.rhamnoidesL.和大果沙棘H.rhamnoidesvat.sp L.的干燥成熟果實(shí)。

表1 各批次沙棘信息Table 1 Hippophae Fructus information for each batch

2 方法

2.1 樣品的干燥

取各批次中華沙棘和大果沙棘果實(shí)進(jìn)行清洗，分別取各批次2 種果實(shí)適量，進(jìn)行標(biāo)記，裝入不銹鋼托盤中均勻攤開，所有樣品在60 ℃烘箱中干燥12 h，干燥后粉碎，過三號篩，裝袋保存。

2.2 總黃酮含量測定[1]

2.2.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品20 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加60%乙醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，搖勻。精密量取25 mL，置50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL 蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粗粉約2 g，精密稱定，加60%乙醇30 mL，加熱回流2 h，放冷，濾過，殘?jiān)俜謩e加60%乙醇25 mL，加熱回流2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，置100 mL 量瓶中，殘?jiān)?0%乙醇洗滌，洗液并入同一量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取25 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液l、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL 量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在500 nm 的波長處測定吸光度（A）值，以A值為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 總黃酮的測定 按“2.3.2”項(xiàng)下方法測定A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算沙棘中總黃酮的含量。

2.4 成分表征測定

2.3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取蘆丁、槲皮苷、異鼠李素、鼠李素、水仙苷、槲皮素、木犀草素、金絲桃苷、柚皮素、木犀草苷、山柰酚、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、二水槲皮素、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸對照品適量，制成質(zhì)量濃度分別為0.15、0.21、0.21、0.16、0.11、0.13、0.12、0.20、0.17、0.10、0.10、0.11、0.14、0.13、0.16、0.14 mg/mL 的對照品儲備液。儲備液于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取“2.1”項(xiàng)下14批產(chǎn)地的沙棘藥材粉末各1.5 g 于錐形瓶中，分別加入60%甲醇30 mL，85 ℃水浴回流1 h，放冷，濾過，取續(xù)濾液，過膜，備用。

2.3.3 UPLC 色譜條件 采用5600 型質(zhì)譜儀進(jìn)行成分表征，色譜柱為Acquity UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸-水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，6% B；1～8 min，6%～20% B；8～30 min，20%～95% B；30～32 min，95% B；32～33 min，95%～5% B；33～35 min，5% B；柱溫35 ℃，體積流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。

2.3.4 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式下，采用信息依賴采集（IDA）、動態(tài)背景扣除（DBS）和高靈敏度模式采集數(shù)據(jù)。離子掃描范圍m/z100～2 000，負(fù)離子模式下源噴射電壓為?4 500 V，裂解電壓（declustering potential，DP）為80 V，碰撞能量（collision energy，CE）為35 eV，負(fù)離子模式下，霧化氣（ion source gas 1，GS1）和輔助氣（ion source gas 2，GS2）為氮?dú)?，均?44.7 kPa，氣簾氣（curtain gas，CUR）為241.3 kPa，霧化溫度（temperature，TEM）550 ℃。

2.4 二水平析因（plackett burman，PB）-星點(diǎn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）法（PB-CCD）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 影響因子設(shè)計(jì) 采用比例特定的乙腈-水混合洗脫系統(tǒng)，以不同比例甲酸調(diào)節(jié)流動相系統(tǒng)pH 值。選用不同色譜柱類型、檢測波長、柱溫、線性梯度時間、體積流量、乙腈初始比例和進(jìn)樣體積作為考察變量，以2 峰分離度之和（∑Rs）、歸一化分離因子（r*）、色譜信息量（Ф）和色譜分層響應(yīng)效能（HCRF）作為響應(yīng)因子[18]，因素水平見表2。

表2 影響因子及響應(yīng)因子設(shè)計(jì)Table 2 Impact factor and response factor design

2.4.2 數(shù)據(jù)分析 以各因素?zé)o相互作用且對設(shè)計(jì)結(jié)果干擾少作為設(shè)計(jì)前提，采用Design-Expert Version 8.0.7 統(tǒng)計(jì)軟件，首先對檢測波長、柱溫、梯度時間、進(jìn)樣體積、體積流量、酸濃度、乙腈初始比例和色譜柱類型進(jìn)行PB 因子篩選；然后以CCD 響應(yīng)曲面法對重要因素進(jìn)行尋優(yōu)，以確定最優(yōu)的參數(shù)設(shè)置，見表3。

表3 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案 (n = 3)Table 3 Placket-Burman design experimental scheme (n = 3)

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 UPLC 色譜條件 色譜柱為Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸-水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脫程序：0～3 min，2%～9% B；3～20 min，9%～15% B；20～26 min，15%～16.5% B；26～30 min，16.5%～23% B；30～33 min，23%～24% B；33～42 min，24%～38% B；42～43 min，38%～95% B；43～45 min，95%～5% B。檢測波長370 nm，柱溫35 ℃，體積流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

2.5.2 指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證 按照《中國藥典》2020年版一部對中藥質(zhì)量控制方法的規(guī)定，對優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等方法學(xué)驗(yàn)證。以金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素為對照，鑒定指紋圖譜中共有成分。

2.6 沙棘差異性成分聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）及偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）

2.6.1 HCA 為了初步說明樣品與樣品間是否存在一定關(guān)系，本研究選用HCA 進(jìn)行建模分析。首先對中華、大果沙棘樣品進(jìn)行色譜分析，再將處理后的峰面積導(dǎo)入simca-p 14.1 版軟件，最后采用HCA方法對各批數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.6.2 PLS-DA 為了更直觀地評價模型對樣品的分類能力，對各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入simca-p 14.1 版軟件，采用PLS-DA 方法觀察樣品差異情況。本研究對中華、大果沙棘樣品進(jìn)行成分鑒定與色譜分析，將測定后的中華沙棘、大果沙棘相同的成分的峰面積進(jìn)行處理，將處理并分組后的數(shù)據(jù)采用PLS-DA 進(jìn)行分析。

2.7 差異代謝物定量分析

2.7.1 定量UPLC 色譜條件 采用4500 型質(zhì)譜儀進(jìn)行成分定量，色譜條件同“2.6.1”項(xiàng)指紋圖譜色譜條件。

2.7.2 質(zhì)譜條件 定量質(zhì)譜分析采用ESI 負(fù)離子模式進(jìn)行掃描，檢測模式為多反應(yīng)檢測（MRM）。離子化參數(shù)為離子噴霧電壓，負(fù)離子模式?4 500 V；霧化氣和輔助氣為氮?dú)?；離子源溫度550 ℃，霧化氣和輔助為413.7 kPa，氣簾氣壓力為241.3 kPa，離子掃描范圍m/z100～1 000，掃描速率：200 Da/s，化合物離子對，優(yōu)化后的采集參數(shù)：去簇電壓（declustering potential，DP）、碎裂能量（collision energy，CE）和碰撞池出口電壓（cell exit potential，CXP）等信息見表4。

表4 沙棘中11 種黃酮類、氨基酸化合物多反應(yīng)檢測參數(shù)Table 4 Multiple reaction parameters of 11 kinds of flavonoids and amino acids in Hippophae Fructu

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 總黃酮含量測定結(jié)果

按“2.3.3”項(xiàng)下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y＝12.491X＋0.003 8（r2＝0.999 3），線性范圍為0.008 0～0.048 0 mg/mL。按“2.3.3”項(xiàng)下方法對14 批沙棘樣品進(jìn)行總黃酮含量的測定，結(jié)果見表5。

表5 不同產(chǎn)地中華沙棘、大果沙棘總黃酮含量測定結(jié)果 (n = 6)Table 5 Determination results of total flavonoids of H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp from different producing areas (n = 6)

3.2 成分表征測定結(jié)果

通過Peakview 2.2 查看采集數(shù)據(jù)，以AB Sciexmaster view 1.1.0.0 中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（TCM library 1.0）作為中華沙棘和大果沙棘的成分匹配庫。通過比對精確質(zhì)量數(shù)、同位素峰度比以及碎片離子裂解規(guī)律等信息，初步鑒定出中華沙棘和大果沙棘中含量差異較大的有9 個黃酮類成分和2 個氨基酸成分并對其進(jìn)行分析，見表6，總離子流圖見圖1。

圖1 中華沙棘 (A) 和大果沙棘 (B) 化學(xué)成分表征的UPLC-MS/MS 總離子流圖Fig.1 UPLC-MS/MS total ion flow maps of characterization of chemical constituents of H.rhamnoides (A) and H.rhamnoides vat.sp (B)

表6 中華沙棘、大果沙棘中11 個重要共有成分Table 6 A total of 11 important common components in H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp

3.3 PB-CCD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

3.3.1 液相色譜優(yōu)化因子選擇 由于甲醇和分析物間氫鍵的相互作用，可能引入額外的共振結(jié)構(gòu)并可能引起拖尾峰，因此，選擇乙腈作為有機(jī)相。另外，色譜柱溫度也是影響極性化合物保留時間的重要參數(shù)，一般溫度升高，擴(kuò)散系數(shù)也升高，這樣會導(dǎo)致更窄的峰和更高的分離效率。為了增加色譜柱使用壽命，將柱溫優(yōu)化范圍設(shè)置為25～35 ℃。

3.3.2 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了在最少的試驗(yàn)次數(shù)下獲得最佳的參數(shù)設(shè)置，選擇因子設(shè)計(jì)中的PB 法作為篩選設(shè)計(jì)方法，以CCD 響應(yīng)曲面法對優(yōu)化后的因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以∑Rs、r*、Ф、HCRF評價樣品的分離效能，見公式（1）～（3）。結(jié)果見表7。

表7 PB 響應(yīng)因子結(jié)果Table 7 PB response factor results

R表示2 峰間分離度；n為理論塔板數(shù)；Rmin為最小分離度；tm?t1為最大與最小保留時間差；A為色譜峰面積?！芌s、r*是用于評價色譜分離質(zhì)量的參數(shù)；Ф值指色譜信息量值，是用于評價色譜交互信息的參數(shù)；HCRF為分層色譜響應(yīng)值，用于評價方法中分離峰個數(shù)、分離度和分析時間性能

PB 試驗(yàn)的ANOVA 結(jié)果顯示，Ф和HCRF項(xiàng)的P值分別為0.030 9 和0.039 2，均小于0.05，說明各變量與HCRF回歸方程的關(guān)系顯著。擬合系數(shù)（R-Squared）分別為0.970 9 和0.965 7，說明模型擬合度好。

根據(jù)各影響因子對各響應(yīng)因子的最大值運(yùn)算結(jié)果，將影響不顯著的影響因子進(jìn)行最大值預(yù)測并作為固定條件：檢測波長為370 nm，柱溫為35 ℃，體積流量為0.3 mL/min；甲酸濃度為0.1%進(jìn)樣量為5 μL，色譜柱類型為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

3.3.3 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在PB 設(shè)計(jì)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過對Ф和HCRF影響顯著的因子檢測波長、進(jìn)樣體積和流速進(jìn)行尋優(yōu)。試驗(yàn)采用通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)（Rotatable＝6），以Ф和HCRF作為響應(yīng)因子進(jìn)行3 水平CCD 試驗(yàn)（表8）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，找到Ф和HCRF最大值。

表8 CCD 響應(yīng)因子結(jié)果Table 8 CCD response factor results

從Ф和HCRF項(xiàng)的ANOVA 表中變量顯著性P值的大小可以確定對Ф和HCRF的影響大小，對Ф影響顯著的因素為進(jìn)樣體積（P＝0.004 8）、體積流量（P＝0.042 3）和色譜柱類型（P＝0.030 5）；對HCRF影響顯著的因素為進(jìn)樣體積（P＝0.007 6）、乙腈初始比例（P＝0.048 3）和色譜柱類型（P＝0.037 6）。從Ф和HCRF主效應(yīng)圖（圖2-a、c）可以看出，3 因素交互作用顯著，進(jìn)樣體積（因素A）越大，圖譜Ф和HCRF越高；體積流量（因素B）越大，圖譜Ф和HCRF越低。

圖2 分離效果影響因素主效應(yīng)及響應(yīng)曲面分析圖Fig.2 Main effect diagrams of influencing factors of separation effect and response surface analysis diagrams

根據(jù)該篩選的結(jié)果，在設(shè)計(jì)水平范圍內(nèi)對響應(yīng)因子做最大值計(jì)算。因此，根據(jù)評價結(jié)果，得到最后的優(yōu)化參數(shù)，用3 次重復(fù)試驗(yàn)來驗(yàn)證因子分析結(jié)果，得到初步的色譜分析條件為：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），檢測波長370 nm，柱溫35 ℃，梯度時間45 min，進(jìn)樣體積5 μL，體積流量0.3 mL/min，乙腈初始比例2%，甲酸濃度0.1%。

3.4 指紋圖譜結(jié)果

3.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地沙棘供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄370 nm 波長下色譜圖。對10 個共有峰以均值法進(jìn)行差異性評價，結(jié)果表明10 個共有峰相對保留時間RSD為0.006%～0.061%，皆小于1.5%。共有峰相對峰面積RSD 為0.232%～2.701%，皆小于3%。精密度考察結(jié)果符合指紋圖譜的要求。

3.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地沙棘供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、15、18、24 h 按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄370 nm 色譜圖。共有峰以均值法進(jìn)行評價，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間RSD 為0.015%～0.134%，皆小于1.5%。各共有峰相對峰面積RSD 為0.325%～2.789%，皆小于3%，證明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地沙棘供試品6 份，分別制備供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄370 nm 下色譜圖。對其共有峰分別進(jìn)行差異性評價，結(jié)果表明，各主要成分共有峰相對保留時間RSD 為0.007%～0.103%，皆小于1.5%。共有峰相對峰面積RSD為0.104%～2.877%，皆小于3%，重復(fù)性考察結(jié)果符合指紋圖譜的要求。

3.4.4 沙棘共有峰鑒定 取14 批沙棘及對照混標(biāo)，按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。通過與混合對照品圖譜比較，確定10 個共有峰，分別為金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素，各批次樣品疊加圖與對照圖譜見圖3。

圖3 各批次沙棘和混合對照品溶液指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of each batch of Hippophae Fructus and mixed control solution

3.5 沙棘差異性成分HCA 及PLS-DA 結(jié)果

3.5.1 聚類分析 得到樹狀圖結(jié)果見圖4-A。結(jié)果表明，沙棘樣品主要分為2 類，中華沙棘樣品歸為一類，大果沙棘樣品聚為一類。說明中華沙棘和大果沙棘的樣品在成分上存在一定的差異。

圖4 中華沙棘、大果沙棘PLS-DA、聚類與KEGG 結(jié)果Fig.4 PLS-DA, cluster analysis and KEGG results of H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp

3.5.2 PLS-DA 結(jié)果得到前2 個主成分的貢獻(xiàn)度為93.1%，包含差異信息最多，模型擬合度為90.0%，模型擬合度良好，故選取前2 個主成分進(jìn)行模型預(yù)測，反映出不同種屬間樣品的基本特征。以2 個主成分建立投影，得到散點(diǎn)圖（圖4-B）。由圖可以看出所有中華沙棘樣品分為一類，所有大果沙棘樣品分為另一類，這一結(jié)果與聚類分析（圖4-A）結(jié)果一致。說明中華沙棘、大果沙棘在成分上有明顯的差異。利用VIP（variable importance in projection）值（VIP＞1）與MetaboAnalyst 分析平臺（https://www.metaboanalyst.ca/）將處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異初生代謝物的篩選與KEGG 通路富集分析，通過VIP 值篩選到19 個差異代謝物，KEGG 通路富集分析得到14 條代謝途徑（圖4-D）。結(jié)果得到2 個重要的差異代謝物L(fēng)-苯丙氨酸與L-酪氨酸與3 個重要代謝途徑：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成代謝、苯丙氨酸代謝與酪氨酸代謝。

3.6 差異代謝物定量分析結(jié)果

根據(jù)PLS-DA 分析中得到的差異代謝物信息，對已鑒定得到的重要差異初生代謝物及其次生代謝物進(jìn)行定量方法學(xué)考察。

3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測限試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品儲備液，配制為不同體積的對照品儲備液，按照優(yōu)化的液質(zhì)條件進(jìn)行測定。將對照品儲備液按梯度體積稀釋，精密吸取11 個稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的混合對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中化合物質(zhì)量濃度橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各成分的回歸方程和線性范圍。中華沙棘、大果沙棘中11 個不同化合物的線性范圍為0.003 6～30.00 μg/mL，且相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明各對照品線性關(guān)系良好。各種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及方法定量限、檢測限見表9。

3.6.2 精密度試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地中華沙棘的供試品溶液，按“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得異鼠李素、山柰酚、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 個成分各色譜峰的峰面積，計(jì)算中華沙棘中11 種化合物峰面積的RSD 在1.12%～3.99%，表明儀器精密度良好。

3.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地中華沙棘的供試品溶液，按“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0、2、4、6、10、14、20、24 h 進(jìn)樣，測得異鼠李素、山柰酚、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 個成分各色譜峰面積，計(jì)算中華沙棘中11 種化合物峰面積的RSD 在1.42%～4.87%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地中華沙棘藥材粉末6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，測得異鼠李素、山柰酚、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 個成分各色譜峰面積，計(jì)算中華沙棘中11 種化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 在2.27%～4.82%，表明此方法重復(fù)性良好。

3.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一產(chǎn)地中華沙棘的供試品各約1.5 g，共6 份，置于150 mL錐形瓶中，分別精密加入與中華沙棘樣品含量等同量的混合對照品溶液（異鼠李素、山柰酚、槲皮素、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 個成分），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.8.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。各成分含量、加入量以及最后得到的平均加樣回收率和RSD 的結(jié)果，異鼠李素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚、槲皮素、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、柚皮素、水仙苷、鼠李素、二水槲皮素、木犀草素平均加樣回收率分別為95.32%、103.30%、95.46%、99.28%、95.26%、101.22%、104.61%、101.41%、98.86%、102.62%、96.48%；RSD 分別為3.42%、3.67%、1.37%、2.07%、0.87%、2.10%、0.72%、2.75%、1.31%、2.84%、3.12%。3.6.6 差異成分含量測定 為了更準(zhǔn)確地應(yīng)用定性數(shù)據(jù)，針對PLS-DA 中得到的差異代謝物信息，將已鑒定得到的差異初生代謝物及其次生代謝物進(jìn)行定量分析，以精確研究中華沙棘與大果沙棘成分的差異性，按“2.8.1”項(xiàng)下的色譜條件和“2.8.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件，采用MRM 模式進(jìn)行定量分析（表4），標(biāo)準(zhǔn)化合物、樣品、空白溶液MRM 提取離子流圖見圖5，結(jié)果見圖6。

圖5 空白 (A)、中華沙棘樣品 (B)、大果沙棘樣品 (C) 和11 種對照品 (D) 負(fù)離子模式MRM 提取離子圖Fig.5 Blank (A), H.rhamnoides (B), H.rhamnoides vat.sp (C), and 11 standards (D) MRM extracted ion chromatograms under negative ion mode

圖6 中華沙棘、大果沙棘中11 種黃酮類、氨基酸化合物含量測定結(jié)果Fig.6 Determination results of 11 flavonoids and amino acids in the H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp

4 討論

4.1 沙棘中黃酮類成分的生物合成途徑分析及驗(yàn)證

根據(jù)“3.2”項(xiàng)成分表征得到含量差異較大的9 個黃酮類成分和2 個氨基酸成分，分別為異鼠李素、山柰酚、槲皮素、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等。黃酮類成分的合成主要以L-苯丙氨酸和L-酪氨酸為前體物質(zhì)，通過不同的分支合成途徑合成黃酮類成分[25]，見圖7，通過對中華沙棘和大果沙棘的代謝產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)2 個沙棘中的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的含量有區(qū)別，大果沙棘中的2 種代謝物的含量大于中華沙棘，通過含量測定得到了大果沙棘中9 種黃酮類成分和2 種氨基酸的含量要大于中華沙棘，也進(jìn)一步驗(yàn)證了不同種屬的沙棘，其黃酮類成分的含量有明顯的不同。

圖7 黃酮類化合物合成途徑Fig.7 Synthetic pathway of flavonoids

4.2 中華沙棘、大果沙棘中總黃酮含量分析

總黃酮含量顯示，中華沙棘中總黃酮含量要大于大果沙棘中總黃酮含量。成分表征結(jié)果初步得到沙棘中26 個黃酮類成分，其中含量差異較大的黃酮類成分有9 個，其在大果沙棘中含量較高，其余已確定的黃酮類化合物含量均是中華沙棘大于大果沙棘。

分析原因一可能是總黃酮含量顯示在中華沙棘中較高，而實(shí)驗(yàn)中所測得在大果沙棘中含量較高、差異較大的9 個黃酮類成分，是為研究不同種類沙棘差異顯著的化學(xué)成分及其變化規(guī)律，其并不能代表大果沙棘中總黃酮含量，由于表征出的黃酮類成分較少，所以2 個種類之間更多的差異成分還有待深究；原因二可能與黃酮類成分的生物合成途徑有關(guān)，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，植物黃酮類生物合成的前期途徑是相同的，都是以丙二酸單酰CoA 與香豆酰CoA（coumaroyl-CoA）為直接前體[26]，其分別與糖代謝、脂質(zhì)代謝以及氨基酸代謝有關(guān)。本研究實(shí)驗(yàn)以氨基酸代謝為主要代謝途徑，由于KEGG 結(jié)果表明苯丙氨酸代謝途徑較為顯著，所以實(shí)驗(yàn)中所測得在大果沙棘中含量較高、差異較大的9 個黃酮類成分可能通過苯丙氨酸代謝途徑進(jìn)行合成。有研究表明，苯丙氨酸代謝途徑還涉及常被認(rèn)為是黃酮類化合物生物合成途徑限速酶之一的C4H[27]，所以可能導(dǎo)致大果沙棘中總黃酮含量較中華沙棘低，而實(shí)驗(yàn)中所測得的9 個黃酮類成分含量較高。

4.3 中華沙棘、大果沙棘在功效上的評價

由于沙棘許多藥用功效都是通過黃酮類化合物發(fā)揮作用來實(shí)現(xiàn)的，其含有的黃酮糖苷、苷元等一些生物活性成分比較豐富，國內(nèi)大果沙棘的研究多以種植和雜交為主，其常用于食品、化妝品和醫(yī)療保健品方面[7]；而中華沙棘多作為藥用，以兩者中總黃酮含量結(jié)果來看，中華沙棘在功效上可能強(qiáng)于大果沙棘。

綜上所述，不同品種沙棘的黃酮類成分在含量上是有差異的，首先其總黃酮含量在中華沙棘中含量較高，說明中華沙棘在藥用功效上可能強(qiáng)于大果沙棘；其次異鼠李素測定結(jié)果在大果沙棘中含量較高，說明其對臨床的質(zhì)控和應(yīng)用可能不太適用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可以通過植物代謝組學(xué)研究不同品種植物的小分子代謝產(chǎn)物，對其生物合成途徑進(jìn)行分析，并通過定性、定量分析找其初生及次生代謝產(chǎn)物的代謝變化的規(guī)律，從而對植物進(jìn)行更加合理的分類，以上研究方法和結(jié)果可以為不同品種沙棘藥性、藥效差異的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)，并對其成分分析、質(zhì)量評價的研究提供技術(shù)支持和科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突