姜超，張久盤(pán)，宋雅萍，宋小雨，吳昊，魏大為?

1 寧夏大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/寧夏反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2 寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川 750021

0 引言

【研究意義】隨著人們消費(fèi)水平以及對(duì)優(yōu)質(zhì)肉類(lèi)消費(fèi)需求的提高，牛肉消費(fèi)量逐漸增加，但我國(guó)牛肉供給量不足，導(dǎo)致牛肉的供需不平衡，需依靠大量進(jìn)口牛肉來(lái)維持牛肉市場(chǎng)穩(wěn)定。胴體重是衡量產(chǎn)肉動(dòng)物產(chǎn)肉性能的重要指標(biāo)，骨骼肌是胴體的主要組成部分[1]，與動(dòng)物產(chǎn)肉密切相關(guān)，骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育依賴(lài)于肌細(xì)胞的增殖和分化，而該過(guò)程受到基因的嚴(yán)格調(diào)控。因此，篩選與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因并驗(yàn)證其功能是提高牛肉產(chǎn)量的重要遺傳改良舉措?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】家畜骨骼肌組織從發(fā)生到成熟是成肌細(xì)胞增殖分化，然后不斷融合形成成熟肌纖維的結(jié)果[2]。成肌細(xì)胞起源于間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）[3]，MSCs 激活后，肌源性分化形成成肌祖細(xì)胞，祖細(xì)胞分化形成成肌細(xì)胞。成肌細(xì)胞在生肌因子作用下分化形成肌細(xì)胞，肌細(xì)胞彼此間融合形成肌管。此外，祖細(xì)胞還分化形成肌衛(wèi)星細(xì)胞，其具有增殖與分化能力，并在正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，而在肌損傷時(shí)被激活，以完成骨骼肌的再生與修復(fù)[4]。骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育受到多種調(diào)控因子及信號(hào)通路的共同調(diào)控，其中配對(duì)盒Pax3/Pax7 和生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族起到重要作用[5-6]。MRFs 家族由MYF5、MYOD、MYF6 和MYOG 構(gòu)成，是成肌分化過(guò)程的核心調(diào)控因子，在成肌細(xì)胞分化各階段中起到重要調(diào)控作用[7-8]；Pax3 和Pax7 是成肌祖細(xì)胞分化的重要依靠，Pax3/Pax7 通過(guò)激活MYOD來(lái)促使肌衛(wèi)星細(xì)胞分化，而抑制Pax3/Pax7 會(huì)降低MYF5、MYOD和Desmin基因的表達(dá)，使細(xì)胞肌源性分化能力喪失，并且Pax7 缺失可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9-10]。因此，常把MRFs 作為研究骨骼肌細(xì)胞分化的重要標(biāo)志基因[11]，而其他調(diào)控因子可以通過(guò)調(diào)控MRFs的表達(dá)來(lái)影響骨骼肌細(xì)胞的分化過(guò)程。FoxO1作為Forkhead box O（FoxO）轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，可以精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激、細(xì)胞分化及細(xì)胞代謝等過(guò)程中靶基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)[12-13]。有研究表明，F(xiàn)oxO1是骨骼肌分化早期的負(fù)調(diào)控因子，其可以通過(guò)影響mTOR 通路、Notch 通路、肌生長(zhǎng)抑制素等多種信號(hào)通路來(lái)抑制成肌細(xì)胞的早期分化。過(guò)表達(dá)FoxO1的轉(zhuǎn)基因小鼠會(huì)發(fā)生肌肉萎縮，并且在相同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)到30 月齡，其體重始終低于正常小鼠。在發(fā)生肌損傷時(shí)，過(guò)表達(dá)FoxO1轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌損傷程度更高，肌肉再生速度變慢，從而抑制肌肉再生[14]，并且在C2C12 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FoxO1會(huì)上調(diào)細(xì)胞周期抑制因子p57 和Gadd45α，從而抑制細(xì)胞增殖。此外，某些microRNA 和分子化學(xué)物質(zhì)可以直接或間接地調(diào)控FoxO1的表達(dá)，進(jìn)而影響骨骼肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)[15-16]，例如miR-183/96/182可以直接靶向抑制FoxO1，也可以促進(jìn)牛成肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因MYOD、MYOG和MYF5的表達(dá)，說(shuō)明FoxO1在骨骼肌細(xì)胞分化過(guò)程中存在信號(hào)調(diào)控作用[17]。因此，無(wú)論是在個(gè)體水平還是細(xì)胞水平上，F(xiàn)oxO1在骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育上均發(fā)揮著重要作用。FoxO1 轉(zhuǎn)錄因子功能主要是通過(guò)翻譯后修飾（posttranslational modifications，PTM）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，經(jīng)過(guò)磷酸化、乙?；⒓谆蚍核鼗揎椇?，F(xiàn)oxO1的亞細(xì)胞分布和DNA 結(jié)合親和力發(fā)生改變，這將引起FoxO1活性變化，影響其與下游靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域的直接結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管有許多研究已經(jīng)證實(shí)FoxO1在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，但都集中于人和小鼠上，而在肉牛上的研究較少。本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)FoxO1在牛不同組織中的表達(dá)，利用免疫熒光技術(shù)定位細(xì)胞中FoxO1 蛋白，利用EdU和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)FoxO1對(duì)骨骼肌細(xì)胞增殖能力的影響，利用qPCR 檢測(cè)過(guò)表達(dá)FoxO1對(duì)增殖、凋亡及分化相關(guān)基因表達(dá)的影響。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】這些結(jié)果將初步闡明FoxO1在牛骨骼肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制，為肉牛遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2022 年5 月至2023 年5 月在寧夏大學(xué)寧夏反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 組織樣品采集

隨機(jī)選取3 只健康的成年（30 月齡，650 kg 左右）固原黃牛公牛，屠宰后采集其心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌、后腿肌、皮下脂肪和睪丸組織（于2022年5 月在固原富民農(nóng)業(yè)科技有限公司采集），將各種組織用PBS 緩沖液清洗后轉(zhuǎn)入無(wú)酶凍存管中，置于液氮中保存，用于組織表達(dá)譜構(gòu)建。

1.3 牛原代骨骼肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

本研究采用酶消化法分離牛原代骨骼肌細(xì)胞，組織樣品來(lái)自3 頭新生固原黃牛犢牛（1 周齡）的背最長(zhǎng)肌組織。在處死犢牛后，使用無(wú)菌手術(shù)器械分離其背最長(zhǎng)肌組織，用75%酒精和含1%青霉素/鏈霉素的PBS 溶液先后沖洗，再移入無(wú)菌細(xì)胞室中。用無(wú)菌手術(shù)器械分割背最長(zhǎng)肌組織，并剔除結(jié)締組織和血管，在含1%青霉素和鏈霉素的PBS 中清洗3 次，再剪切為肉糜，放入離心管中，并加入適量II 型膠原酶，在37℃、180 r/min 條件下消化1.5 h，再加入等體積的細(xì)胞完全培養(yǎng)基（15% FBS+1%雙抗+84% DMEM）終止消化。用100 目和200 目的不銹鋼篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，將濾液以1 000 r/min 離心10 min，棄上清液，得到細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀用DMEM 培養(yǎng)基重懸，并以1 000 r/min 離心10 min，獲得洗滌后細(xì)胞。將細(xì)胞重懸后接種到培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或更換為分化培養(yǎng)基（含2% HS）進(jìn)行誘導(dǎo)分化。細(xì)胞鑒定通過(guò)觀察誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的表型和檢測(cè)其分化標(biāo)志基因表達(dá)的方式進(jìn)行。

1.4 亞細(xì)胞定位

將牛骨骼肌細(xì)胞接種于12 孔板中，首先用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS 清洗3 次；加入0.5% TritonX-100 對(duì)細(xì)胞通透 10 min，隨后加入5% BSA 的封閉液孵育30 min 后，加入一抗（1∶200稀釋?zhuān)┰?℃條件下孵育過(guò)夜。PBS 清洗細(xì)胞3 次后加入二抗（1∶200 稀釋?zhuān)?，室溫條件下孵育1 h。用終濃度為1 μg·mL-1的DAPI 孵育細(xì)胞15 min，PBS 清洗3 次，加入抗熒光衰減封片劑。在倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況，并進(jìn)行拍照。

1.5 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

用TRIzol 法提取牛組織樣品或骨骼肌細(xì)胞的RNA。利用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Takara，日本）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋旱谝徊?2 ℃，2 min；第二步37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。將cDNA 放置于-20 ℃保存。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）

以cDNA 為模板，利用2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（with Tli RNaseH）（北京，聚合美）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。反應(yīng)體系（15 μL）：2X M5 Hiper SYBR Premix EsTaq 7.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 5.9 μL。PCR 反應(yīng)在CFX96 Real-Time PCR Detection System 儀器上進(jìn)行，反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。定量引物利用Primer Premier 6 軟件設(shè)計(jì)，由通用生物技術(shù)有限公司（安徽）進(jìn)行合成，引物序列如表1 所示。

表1 定量引物Table 1 Primers for real-time quantitative PCR (qPCR)

1.7 腺病毒介導(dǎo)的FoxO1 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與包裝

根據(jù)GenBank 中牛FoxO1基因序列（登錄號(hào)：XM_025000053.1），設(shè)計(jì)帶有HindIII 和KpnI 雙酶切位點(diǎn)的引物（表2），以牛肌肉組織cDNA 為模板，進(jìn)行FoxO1基因CDS 區(qū)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物連接同樣酶切位點(diǎn)的pAd-Track 載體，將獲得的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒（命名為pAd-Track-FoxO1）使用PmeI 酶切完全線性化后轉(zhuǎn)化到含有骨架 pAdEasy-1 骨架載體的BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組。重組質(zhì)粒pAd-FoxO1經(jīng)PacI 限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)染至HEK-293A 細(xì)胞中進(jìn)行腺病毒的包裝和擴(kuò)繁。本研究將FoxO1重組過(guò)表達(dá)腺病毒命名為OE-FoxO1；陰性對(duì)照病毒為實(shí)驗(yàn)室保存，命名為OE-NC。腺病毒介導(dǎo)的FoxO1過(guò)表達(dá)載體的表達(dá)效率用qPCR 鑒定。

表2 擴(kuò)增引物信息Table 2 Primer information

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

將牛骨骼肌細(xì)胞接種到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待成肌細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為60%時(shí)，分別用OE-FoxO1和OE-NC 處理，48 h 后收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞懸液以1 000×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL 預(yù)冷PBS重懸，并再次離心后加入1 mL 預(yù)冷的70%冰乙醇，吹打混勻，4 ℃固定30 min 以上，離心獲取沉淀，再用PBS 清洗離心。用Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit（上海，碧云天）試劑盒處理細(xì)胞，37 ℃避光溫浴30 min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞計(jì)數(shù)通量為20 000 個(gè)。

1.9 EdU 染色

將牛骨骼肌細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度為60%時(shí)，用OE-FoxO1和OE-NC 分別感染牛骨骼肌細(xì)胞。48 h 后，利用BeyoClick EdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（上海，碧云天）進(jìn)行EdU 染色。先將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含有10 μmol·L-1EdU 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)2 h。棄培養(yǎng)基，加入固定液，室溫固定細(xì)胞15 min；棄固定液，洗滌液清洗3 次，加入通透液，室溫孵育10 min；棄通透液，洗滌液清洗3 次，加入配置好的Click 反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min；棄Click 反應(yīng)液，洗滌液清洗3 次，加入1×Hoechst 33342 溶液，室溫避光孵育10 min，孵育完用洗滌液清洗后，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照。

1.10 數(shù)據(jù)分析

EdU 染色結(jié)果由Image J 軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞周期結(jié)果由FlowJo_v10.6.2 軟件進(jìn)行分析。使用GraphPad Prism 8.0（San Diego, California, USA）進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）分析（或t檢驗(yàn)分析）顯著性并繪圖，**表示極顯著差異（P＜0.01），*表示顯著差異（P＜0.05），ns 表示差異不顯著（P＞0.05）。

2 結(jié)果

2.1 牛FoxO1 的組織表達(dá)譜分析

組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO1在成年牛的背最長(zhǎng)肌和后腿肌組織中的表達(dá)量較低，而在背脂中表達(dá)量最高（圖1-A），并且在背最長(zhǎng)肌組織中，犢牛的FoxO1表達(dá)量顯著高于成年牛的（圖1-B）。這一結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)oxO1在牛不同組織中均有表達(dá)，且在肌肉組織中表達(dá)量較低，尤其是成年后FoxO1在肌肉中的表達(dá)量下降，因此探究其在骨骼肌組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的基因功能顯得尤為重要。

圖1 FoxO1 組織表達(dá)譜Fig. 1 Tissue expression profile of FoxO1

2.2 牛骨骼肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

利用酶消化法成功分離得到牛骨骼肌細(xì)胞（圖2-A），當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%以上，進(jìn)行傳代培養(yǎng)（圖2-B），此時(shí)牛骨骼細(xì)胞形態(tài)良好，生長(zhǎng)活力較高。在誘導(dǎo)分化4 d 時(shí)發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細(xì)胞形成大量肌管（圖2-C），且細(xì)胞融合度較高。進(jìn)一步檢測(cè)分化標(biāo)志基因發(fā)現(xiàn)，分化早期表達(dá)基因MYOD和MYF5表達(dá)量顯著下調(diào)（圖3-A），分化中后期表達(dá)基因MYF6和MYHC表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），MYOG雖未達(dá)到顯著水平，但其表達(dá)量呈上升趨勢(shì)（圖3-B，P>0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明此次分離的牛骨骼肌細(xì)胞純度高，且有很強(qiáng)的分化潛能，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 牛骨骼肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化Fig. 2 Isolation, culture and induced differentiation of bovine skeletal muscle cells

圖3 骨骼肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)水平檢測(cè)Fig. 3 Detection of expression level of differentiation marker genes in skeletal muscle cells

2.3 FoxO1 亞細(xì)胞定位

利用FoxO1 抗體快速并準(zhǔn)確標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)FoxO1蛋白，再與熒光二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）CY3-conjugated 相結(jié)合，得到FoxO1 免疫熒光圖（圖4-A），再通過(guò)DAPI 染色標(biāo)記細(xì)胞核（圖4-B），確定FoxO1 蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)均存在，且細(xì)胞核內(nèi)熒光強(qiáng)度高于細(xì)胞質(zhì)（圖4-C）。這一結(jié)果說(shuō)明FoxO1在牛骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均高表達(dá)，發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

圖4 FoxO1 亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of FoxO1

2.4 FoxO1 過(guò)表達(dá)腺病毒的包裝

進(jìn)一步包裝FoxO1過(guò)表達(dá)腺病毒，探究其對(duì)牛骨骼肌細(xì)胞增殖分化的作用。構(gòu)建重組pAd-FoxO1質(zhì)粒，并經(jīng)PacI 酶線性化酶切鑒定，純化回收正確的質(zhì)粒，利用LipofiterTM將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)染入293A 細(xì)胞后，每天通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光情況。轉(zhuǎn)染后第1天，293A 細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)綠色熒光蛋白，第7 天開(kāi)始出現(xiàn)彗星狀聚集，第9 天綠色熒光蛋白鋪滿(mǎn)皿底并出現(xiàn)空斑，待細(xì)胞脫落度達(dá)50%時(shí)，收集第一代病毒（圖5）。再用第一代病毒反復(fù)感染293A 細(xì)胞，得到效果穩(wěn)定第4 代腺病毒，用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 FoxO1 過(guò)表達(dá)病毒P1 代包裝過(guò)程Fig. 5 Packaging process of P1 generation of FoxO1 overexpression virus

2.5 過(guò)表達(dá)FoxO1 抑制牛骨骼肌細(xì)胞G1/S 期的轉(zhuǎn)化

EdU 染色可以準(zhǔn)確快速標(biāo)記S 期細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。EdU 染色結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)FoxO1明顯降低了EdU 標(biāo)記細(xì)胞數(shù)（圖6-A），然后通過(guò)ImageJ 分別統(tǒng)計(jì)EdU 和Hoechst 33342 所標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)FoxO1顯著降低牛骨骼肌細(xì)胞的增殖能力（圖6-B）。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)FoxO1對(duì)牛骨骼肌細(xì)胞增殖周期的影響（圖7-A），并結(jié)合各時(shí)期細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)FoxO1顯著提高G1 期細(xì)胞量，而S 期和G2 期細(xì)胞量顯著降低（圖7-B），這說(shuō)明過(guò)表達(dá)FoxO1抑制了細(xì)胞G1/S 期的轉(zhuǎn)化，且影響G2期細(xì)胞的生成。

圖6 EdU 檢測(cè)過(guò)表達(dá)FoxO1 對(duì)牛骨骼肌細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響Fig. 6 EdU detected the effect of FoxO1 overexpression on the relative proliferation rate of bovine skeletal muscle cells

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)FoxO1 對(duì)牛骨骼肌細(xì)胞周期分布的影響Fig. 7 Effect of FoxO1 overexpression on cell cycle distribution of bovine skeletal muscle cells detected by flow cytometry

2.6 過(guò)表達(dá)FoxO1 抑制增殖相關(guān)基因的表達(dá)和促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

利用qPCR 檢測(cè)FoxO1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1表達(dá)效率上調(diào)了159.8 倍（圖8-A），說(shuō)明所構(gòu)建的過(guò)表達(dá)腺病毒可以極顯著上調(diào)FoxO1的表達(dá)。為進(jìn)一步研究過(guò)表達(dá)FoxO1對(duì)細(xì)胞增殖的影響，檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNA2、CCNB1、CCND1、CCNE2的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P＜0.01），說(shuō)明過(guò)表達(dá)FoxO1會(huì)抑制增殖相關(guān)基因的表達(dá)（圖8-B）。此外，還檢測(cè)了過(guò)表達(dá)FoxO1對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響，其中促凋亡基因BAD和BAX表達(dá)量顯著上調(diào)，抑凋亡基因BCL2表達(dá)顯著下調(diào)（圖8-B，P＜0.05）。

圖8 qPCR 檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平Fig. 8 The expression level of related genes was detected by qPCR

2.7 過(guò)表達(dá)FoxO1 抑制牛骨骼肌細(xì)胞肌管的形成

從細(xì)胞表型來(lái)看，肌管形成數(shù)量越多和肌細(xì)胞融合度越高意味著骨骼肌細(xì)胞的分化性能越強(qiáng)，而骨骼肌細(xì)胞的分化性能將影響骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究中，觀察誘導(dǎo)分化后的牛骨骼肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)FoxO1明顯抑制了骨骼肌細(xì)胞肌管的形成，導(dǎo)致肌管數(shù)量減少（圖9-A 和B），并且相較于對(duì)照組，其細(xì)胞融合度下降，肌管形態(tài)更加瘦縮（圖9-C 和D）。該結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)FoxO1將會(huì)抑制骨骼肌的發(fā)育。

圖9 對(duì)照組和試驗(yàn)組牛骨骼肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)Fig. 9 Cell morphology of bovine skeletal muscle cells after induced differentiation in control group and experimental group

2.8 過(guò)表達(dá)FoxO1 抑制牛骨骼肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)

過(guò)表達(dá)FoxO1抑制了牛骨骼肌細(xì)胞肌管的形成，所以本研究進(jìn)一步對(duì)骨骼肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。首先，檢測(cè)誘導(dǎo)分化4 d 后過(guò)表達(dá)處理組FoxO1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其顯著上調(diào)（圖10-A，P＜0.01）。然后，檢測(cè)分化標(biāo)志基因MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)FoxO1導(dǎo)致其顯著下調(diào)（圖10-B，P＜0.05）。這說(shuō)明FoxO1能通過(guò)調(diào)控分化標(biāo)志基因的表達(dá)來(lái)影響骨骼肌細(xì)胞的分化過(guò)程。

圖10 過(guò)表達(dá)FoxO1 對(duì)牛骨骼肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因的影響Fig. 10 Effects of FoxO1 overexpression on differentiation marker genes of bovine skeletal muscle cells

3 討論

3.1 FoxO1 表達(dá)模式

FoxO1在機(jī)體多種組織中廣泛表達(dá)。在mRNA 水平上檢測(cè)成年人不同組織中FoxO1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1在骨骼肌中表達(dá)量最高，在心臟、肝臟、脾臟、肺和睪丸中也具有較高的表達(dá)水平，但在腎臟中表達(dá)量極低。此外，在豬的不同組織中研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1在仔豬的心臟、網(wǎng)膜脂肪組織、骨骼肌、肝臟和脾臟中表達(dá)水平較高，在腎臟、肺和腹膜脂肪組織中表達(dá)水平中等，在十二指腸和皮下脂肪組織中含量較低[19]，還有研究表明，在肝臟和脂肪組織中，成年豬的FoxO1表達(dá)水平顯著低于仔豬，而在肌肉組織中則沒(méi)有顯著差異，但仍低于仔豬[20]。在本研究中，檢測(cè)成年牛不同組織中FoxO1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，背脂中表達(dá)水平極高，肝、腎、肺、腎周脂及脾中表達(dá)水平較高，睪丸和心臟中表達(dá)偏低，而在背最長(zhǎng)肌和后腿肌中表達(dá)水平極低，說(shuō)明在不同物種間FoxO1在不同組織中的表達(dá)存在一定差異，并且FoxO1在內(nèi)臟組織中的表達(dá)可能較為穩(wěn)定，對(duì)維持機(jī)體代謝穩(wěn)定具有重要作用。此外，比較成年牛與犢牛的背最長(zhǎng)肌組織中FoxO1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，犢牛FoxO1表達(dá)水平顯著高于成年牛，說(shuō)明FoxO1可能在犢牛骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要調(diào)控作用，而在骨骼肌發(fā)育成熟的成年牛中作用較小，從而推斷FoxO1會(huì)差異性調(diào)控不同時(shí)期骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育。

為探究FoxO1 在牛骨骼肌細(xì)胞中的表達(dá)模式，通過(guò)亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)FoxO1 在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，意味著FoxO1 可能在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，而細(xì)胞核內(nèi)的熒光強(qiáng)度高于細(xì)胞質(zhì)，則說(shuō)明FoxO1 主要在牛骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)功能，從而調(diào)控其增殖、分化以及凋亡等細(xì)胞生命活動(dòng)。其他研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)FoxO1 與FHL2相互作用，可促進(jìn)FoxO1 的去乙酰化過(guò)程并抑制其轉(zhuǎn)錄活性，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用；乙酰轉(zhuǎn)移酶相關(guān)因子PCAF能夠與磷酸化的FoxO1 相結(jié)合，誘使FoxO1 轉(zhuǎn)錄因子乙?；⑵湎拗圃诩?xì)胞核內(nèi)，調(diào)控FoxO1的表達(dá)[21]；在C2C12 細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞無(wú)論處于增殖狀態(tài)還是分化狀態(tài)，F(xiàn)oxO1 都首先定位在其細(xì)胞核中，而細(xì)胞質(zhì)中FoxO1 轉(zhuǎn)錄因子的積累是其入核過(guò)程阻斷所導(dǎo)致的，并且這種阻斷有助于C2C12 細(xì)胞的分化[22]。因此，轉(zhuǎn)錄因子FoxO1在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間存在活性差異，并對(duì)其在細(xì)胞生命過(guò)程中的調(diào)控作用具有重要影響，而且這種易位與FoxO1 翻譯后修飾密切相關(guān)[23-24]。因此，通過(guò)對(duì)FoxO1 進(jìn)行核質(zhì)定位，能夠用于判斷其是否發(fā)揮其調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的作用。

3.2 FoxO1 調(diào)控骨骼肌細(xì)胞增殖、凋亡與分化過(guò)程

FoxO1 轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和代謝過(guò)程[25]，對(duì)于細(xì)胞的生存與功能實(shí)現(xiàn)具有重要作用。細(xì)胞周期（包括G1、S、G2 和M 期）各階段受到細(xì)胞周期蛋白（cyclins，CCN）和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（cyclin-dependent Kinases，CDK）的聯(lián)合調(diào)控[26]。CCN 主要有CCNA、CCNB、CCND 和CCNE 4 種類(lèi)型，CDK 包括CDK1、CDK2、CDK4 和CDK6。CDK1 與CCNA、CCNB 形成復(fù)合物可促進(jìn)G2/M 期轉(zhuǎn)化及M 期進(jìn)展，而FoxO1 可與CDK1 結(jié)合形成復(fù)合物并抑制細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)變；CDK2與CCNE、CCNA形成復(fù)合物從而促進(jìn)G1/S 期轉(zhuǎn)化和S 期進(jìn)展，且CDK2 能夠特異性磷酸化FoxO1，從而抑制FoxO1 的促細(xì)胞凋亡功能[27]。在牛顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MicroRNA-183-96-182 通過(guò)抑制FoxO1的mRNA 和蛋白水平來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖，且G1 期細(xì)胞比例下降，S期細(xì)胞比例增加，這與利用小干擾RNA 敲低FoxO1的結(jié)果相一致[28]。在本研究中，利用OE-FoxO1感染牛骨骼肌細(xì)胞后成功地提高了FoxO1mRNA 的表達(dá)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牛骨骼肌細(xì)胞增殖率降低，且細(xì)胞停滯在G1期，S 期細(xì)胞比例顯著減少，qPCR 檢測(cè)CDK 和CCN的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)均顯著下調(diào)，這與前人的研究結(jié)果相一致，說(shuō)明在牛骨骼肌細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1 基因表達(dá)水平提高將會(huì)抑制其細(xì)胞增殖。對(duì)于細(xì)胞的存活與凋亡，BAD、BAX 和BCL2 具有重要調(diào)控作用。BAD和BAX 與促凋亡活性相關(guān)，BCL2 則起到保護(hù)細(xì)胞、抑制其凋亡的作用，CIFARELLI 在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FoxO1后發(fā)現(xiàn)，BCL2 的蛋白水平顯著降低，BAD 和BAX 的蛋白水平顯著上調(diào)[29]。在本試驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)過(guò)表達(dá)FoxO1的骨骼肌細(xì)胞中BAD、BAX和BCL2的mRNA 表達(dá)水平得到了相似的結(jié)果，說(shuō)明牛骨骼肌細(xì)胞中FoxO1過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)其細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

MRFs 是調(diào)控干細(xì)胞成肌分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)節(jié)肌源性基因和非肌源性基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)肌生成過(guò)程[8]。在動(dòng)物出生后，肌肉基本發(fā)育成熟，肌生成依賴(lài)于肌衛(wèi)星細(xì)胞來(lái)維持組織穩(wěn)態(tài)，當(dāng)肌損傷發(fā)生時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活，MRFs 表達(dá)上調(diào)，使肌衛(wèi)星細(xì)胞迅速增殖并分化為成肌細(xì)胞。在調(diào)控成肌分化過(guò)程中，MYOD和MYF5在細(xì)胞未分化階段或分化早期便高度表達(dá)，參與細(xì)胞成肌分化的決定，而MYOG和MYF6則在細(xì)胞分化中期或晚期表達(dá)，是分化后期所必需的基因[30]。肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MYHC）是肌球蛋白的重要組成部分，在細(xì)胞分化終末期合成，是成肌分化的重要標(biāo)記物[31]。為鑒定所分離細(xì)胞為牛骨骼肌細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞形成大量肌管，通過(guò)檢測(cè)分化標(biāo)志基因，發(fā)現(xiàn)分化早期標(biāo)志基因MYOD和MYF5表達(dá)量下調(diào)，而終后期表達(dá)基因MYF6和MYHC上調(diào)，證明所分離細(xì)胞具有良好的成肌分化性能。在牛骨骼肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FoxO1后，對(duì)其進(jìn)行成肌誘導(dǎo)分化，其肌管的形成量減少，并且MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC表達(dá)量均顯著下調(diào)，推測(cè)FoxO1可能是通過(guò)抑制分化早期基因的表達(dá)，進(jìn)而阻斷骨骼肌細(xì)胞分化過(guò)程的進(jìn)行，達(dá)到抑制其分化的目的。

4 結(jié)論

FoxO1在牛的不同組織中均發(fā)揮著調(diào)控作用，且在背最長(zhǎng)肌組織生長(zhǎng)發(fā)育不同階段差異性表達(dá)；FoxO1 可能主要在牛骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；過(guò)表達(dá)FoxO1可能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因和肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制牛骨骼肌細(xì)胞的增殖與分化，并且可通過(guò)上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)和下調(diào)抑凋亡基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。