宋雅榮，常單娜，周國朋，高嵩涓，段廷玉?，曹衛(wèi)東?

1 蘭州大學(xué)草種創(chuàng)新與草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州 730020；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/北方干旱半干旱耕地高效利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；3 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036；4 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095

0 引言

【研究意義】磷是植物生長必需的營養(yǎng)元素，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要通過持續(xù)增加磷肥的施入量，以保持作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[1]。磷礦屬于不可再生的礦產(chǎn)資源，我國已探明的磷礦主要以中低品位礦為主（全磷P2O5＜28%，90%），高品位磷礦少（全磷P2O5＞30%，10%）[2]。磷礦粉主要成分是氟磷酸鈣，常伴有碳酸鹽的物質(zhì)，主要以磷酸三鈣（非水溶性）的形態(tài)存在[3-4]。在生產(chǎn)上，高品位磷礦主要用于制作磷肥，按照目前磷肥生產(chǎn)速度，大約 23 年后，我國高品位磷礦資源將會(huì)逐漸枯竭[5-6]。將低品位磷礦資源直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，可顯著降低能耗，并延長高品位磷礦使用年限[7]。但低品位磷礦粉中的有效磷含量低，磷生物利用率低。因此，最大程度活化磷礦粉中的難溶性磷，是提高其農(nóng)業(yè)應(yīng)用效率的核心?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】磷礦粉的活化方法主要包括物理、化學(xué)和生物活化。物理活化可以直接機(jī)械破碎改變磷礦粉的粒徑及晶格結(jié)構(gòu)，粒徑越小，比表面積越大，與土壤的接觸面積越多，越有利于磷礦粉中難溶性磷的溶解與釋放，常適用于南方酸性土壤及根際過程較強(qiáng)的豆科植物[8]。王晨等[9]發(fā)現(xiàn)機(jī)械活化磷礦粉，磷礦粉的晶格尺寸減小，許多官能團(tuán)發(fā)生置換反應(yīng)，使磷礦粉的可溶性磷含量提高61.6%?；瘜W(xué)活化主要通過使用酸分解磷礦粉，或者與合成酸活化劑等反應(yīng)，顯著增強(qiáng)難溶性磷酸鹽溶解，但存在一定的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[10]。生物活化主要包括根系活化、解磷微生物以及二者的相互作用等，綠色環(huán)保，有助于推動(dòng)我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[11]。解磷細(xì)菌解磷機(jī)制較復(fù)雜，主要通過產(chǎn)生胞外無機(jī)酸、有機(jī)酸和磷酸酶介導(dǎo)的礦化作用引起難溶性磷酸鹽的溶解[12]，提高磷的有效性從而提高作物產(chǎn)量[13]。因菌株特性及培養(yǎng)環(huán)境條件等因素，解磷微生物分泌的有機(jī)酸、磷酸酶存在差異[14]。目前報(bào)道的解磷微生物主要是細(xì)菌，種類繁多，有芽孢桿菌屬（Bacillus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等[15]。解磷細(xì)菌能夠活化紅壤或磷礦粉中的難溶性磷，提高有效磷含量[16-17]。林啟美等[18]以磷礦粉為唯一磷源培養(yǎng)解磷細(xì)菌，5 d 后培養(yǎng)液磷增加量最高可達(dá)10.91 mg·L-1。王苗[19]的研究表明，單獨(dú)添加機(jī)械活化磷礦粉土壤速效磷隨培養(yǎng)時(shí)間的延長緩慢波動(dòng)增加，同時(shí)添加機(jī)械活化磷礦粉和接種解磷菌，土壤速效磷在培養(yǎng)過程中持續(xù)保持較高幅度的增加，但兩者之間是否存在協(xié)同作用并不清楚。一方面，磷礦粉經(jīng)過機(jī)械活化后粒徑變小，比表面積變大，與土壤及解磷菌接觸的機(jī)會(huì)增加，有利于解磷菌活化其中的難溶性磷。另一方面，經(jīng)過機(jī)械活化后晶體表面的缺陷越多，更多不穩(wěn)定的磷在活化過程中被釋放出來，剩余殘?jiān)鼞B(tài)磷難以被解磷菌活化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于物理機(jī)械活化及解磷細(xì)菌對磷礦粉的溶磷作用已有相關(guān)研究，但鮮見解磷細(xì)菌對不同粒徑磷礦粉的活化效果及機(jī)制的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過土壤培養(yǎng)試驗(yàn)，分析測定不同形態(tài)磷、有機(jī)酸、磷酸酶、phoD等指標(biāo)，探討解磷細(xì)菌對不同粒徑磷礦粉在紅壤上施用效果的影響，分析解磷細(xì)菌活化低品位磷礦粉（不同粒徑）中難溶性磷的效應(yīng)與機(jī)制，為紅壤稻田高效利用低品位磷礦粉提供技術(shù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試磷礦粉屬于低品位磷礦粉，全磷（P2O5）含量18.0%，磷礦粉粒徑分別為0.18、0.10 和0.05 mm，其有效磷（P2O5）含量分別為2.1%、3.1%、4.5%，pH分別為9.41、9.55、9.58。供試菌株由北方民族大學(xué)楊國平老師提供，分別為乙酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）和皮特不動(dòng)桿菌（Acinetobacterpittii），平板溶磷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩株菌均具有良好的解磷能力。供試土壤采自湖南省赫山區(qū)稻田，土壤pH 6.4，有機(jī)質(zhì)38.6 g·kg-1，全磷0.40 g·kg-1，全氮1.7 g·kg-1，有效磷6.8 mg·kg-1，速效鉀122.0 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)為雙因素試驗(yàn)，因素一為磷礦粉粒徑，因素二為解磷細(xì)菌。磷礦粉粒徑分別為0.18 mm（L1）、0.10 mm（L2）、0.05 mm（L3），解磷細(xì)菌分別為A.calcoaceticus（P1）和A.pittii（P2），同時(shí)設(shè)置不接種對照（P0），共9 個(gè)處理，各處理32 次重復(fù)（用于8 次破壞性取樣），共288 個(gè)培養(yǎng)瓶。將磷礦粉與土壤（風(fēng)干土）按1:100 重量比準(zhǔn)確稱取到培養(yǎng)瓶中，攪拌混合均勻[20]，菌液按6.0%的接種率（菌液∶土重=v（mL）∶w（g））接種[21]，接種處理添加含有解磷菌的溶菌肉湯（LB）培養(yǎng)基，對照不接菌處理添加等量無菌的LB 培養(yǎng)基。用透氣的封口膜密封，所有培養(yǎng)瓶均在25 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期稱重補(bǔ)充LB 培養(yǎng)基至最大持水量的65.0%。

1.3 解磷細(xì)菌的培養(yǎng)

將4 ℃保存的菌種，接種到營養(yǎng)瓊脂（NA）平板上。2 d 后將長好的解磷細(xì)菌接種于150 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)24 h（血球板計(jì)數(shù)，菌液濃度108cfu/mL）。

NA 培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。LB 培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測定

分別在培養(yǎng)1、3、5、10、15、30、45、60 d 動(dòng)態(tài)取樣，取30 g 鮮土于-20 ℃冰箱保存，用于測定微生物量磷、磷酸酶、有機(jī)酸（OA）及堿性磷酸酶功能基因phoD定量分析。剩余土樣風(fēng)干過篩用于測定土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)與磷分級(jí)。

磷礦粉中有效磷采用檸檬酸提取-釩鉬黃比色法測定，磷礦粉中全磷采用1∶1 HNO3提取-釩鉬黃比色法測定，有效磷采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測定，pH 采用水土比2.5∶1、電位法測定，微生物量磷采用氯仿熏蒸-NaHCO3浸提法[22]測定。磷分級(jí)參照Tiessen 磷分級(jí)法[23]測定（取培養(yǎng)1、30、60 d）。磷酸酶活性采用分光光度法測定[24]。有機(jī)酸測定儀器為高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters Acquity UPLC，AB SCIEX 5500 Qtrap-MS），吸取樣液過0.22 μm 水相濾膜進(jìn)樣，利用MultiQuant 軟件進(jìn)行積分，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行含量計(jì)算[25]。

1.5 土壤總DNA 提取和熒光定量PCR 測定

土壤樣品DNA 采用FastDNA?Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）試劑盒提取。NanoDrop?ND-2000微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）檢測DNA 濃度和質(zhì)量。使用QuantStudio? 6 Flex Real-Time PCR 儀（ThermoFisher，USA）測定phoD基因豐度。phoD基因正向引物和反向引物分別為（phoD-F733：5′-TGGGAYGATCAYGARGT-3′和phoD-R1083：5′-CTGSGCSAKSACRTTCCA-3′）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的反應(yīng)體系為10 μL，包括5 μL Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix，0.2 μL 上、下游引物，1 μL DNA 模板，補(bǔ)充ddH2O 至10 μL。循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)40次[26]。將含有目的基因的質(zhì)粒連續(xù)10 倍稀釋度作為qPCR 標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2＞0.99），擴(kuò)增效率達(dá)到90.0%—110.0%。通過擴(kuò)增曲線及熔解曲線分析驗(yàn)證qPCR 擴(kuò)增的質(zhì)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法

采用Microsoft Excel2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用IBM SPSS Statistics23.0 軟件進(jìn)行方差分析與因子降維分析，使用IBM SPSS Amos26.0 構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型和Origin2021 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 土壤有效磷的變化

圖1 顯示，各處理土壤有效磷含量在培養(yǎng)前期迅速增加，于第5 天到達(dá)最高水平后至培養(yǎng)結(jié)束（60 d）期間維持波動(dòng)高位。培養(yǎng)期間，3 個(gè)粒徑（0.18、0.10和0.05 mm）接種P1 菌株的土壤有效磷含量為9.8—17.4 mg·kg-1，平均分別為13.8、14.2、14.7 mg·kg-1，接種P2 菌株的土壤有效磷含量為8.3—18.0 mg·kg-1，平均分別為13.4、13.5 和14.2 mg·kg-1，均高于不接種對照（P0）處理（為6.7—11.7 mg·kg-1，平均分別為9.7、10.3 和9.6 mg·kg-1），分別提高42.3%、37.9%、53.1%和38.1%、31.1%、47.9%（P＜0.05）。不同粒徑相比，接種解磷細(xì)菌后粒徑0.05 mm 磷礦粉處理的有效磷含量增幅最大，但兩株解磷細(xì)菌之間的解磷效果差異不顯著（圖1-a、1-b、1-c）。培養(yǎng)第10天時(shí)，粒徑0.05 mm 磷礦粉的土壤有效磷含量均顯著高于粒徑0.18、0.10 mm 磷礦粉的，分別提高19.2%、11.0%（P1）和11.3%、9.0%（P2）（P＜0.05）（圖1-d、1-e、1-f）。

圖1 接種解磷細(xì)菌培養(yǎng)過程中土壤有效磷含量動(dòng)態(tài)變化（a-L1；b-L2；c-L3；d-P0；e-P1；f-P2）Fig. 1 Dynamic changes of soil available phosphorus content during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1;b-L2; c-L3; d-P0; e-P1; f-P2)

2.2 土壤微生物量磷的變化

圖2 顯示，各處理微生物量磷在培養(yǎng)前期迅速增加，于第3 天到達(dá)最高水平后逐漸降低，在培養(yǎng)末期趨于平穩(wěn)（45—60 d）。在3—45 d，3 個(gè)粒徑（0.18、0.10、0.05 mm）磷礦粉接種P1 菌株后土壤微生物量磷含量為8.7—26.6 mg·kg-1，平均含量分別為19.6、20.0、21.4 mg·kg-1，接種P2 菌株的土壤微生物量磷含量為8.5—28.3 mg·kg-1，平均分別為18.7、19.0 和21.2 mg·kg-1，均高于P0 處理（為7.8—15.9 mg·kg-1，平均含量分別為10.6、11.8 和12.7 mg·kg-1），分別提高84.9%、69.5%、68.5%和76.4%、61.0%、66.9%（P＜0.05）。培養(yǎng)第10 天時(shí)，粒徑0.05 mm 磷礦粉處理的土壤微生物量磷含量顯著高于粒徑0.18 mm 磷礦粉處理，P0、P1 和P2 處理分別高31.7%、18.7%、24.6%（P＜0.05）（圖2-d、2-e、2-f）。

圖2 接種解磷菌后培養(yǎng)過程中土壤微生物量磷含量的動(dòng)態(tài)變化（a-L1；b-L2；c-L3；d-P0；e-P1；f-P2）Fig. 2 Dynamic changes of soil microbial biomass phosphorus content during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1; b-L2; c-L3; d-P0; e-P1; f-P2)

2.3 土壤磷庫的變化

培養(yǎng)第1、30、60 天的磷形態(tài)變化如表1 所示。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，與P0 相比，P1 與P2 處理的樹脂磷（Resin-Pi）逐漸增加。對于不接種解磷細(xì)菌（P0）粒徑0.05 和0.10 mm 磷礦粉的Resin-Pi 含量顯著高于粒徑0.18 mm 磷礦粉的處理，分別為9.3、11.3 和11.8 mg·kg-1；P1 處理3 個(gè)粒徑（0.18、0.10、0.05 mm）磷礦粉的Resin-Pi 平均含量分別為16.6、16.1、16.5 mg·kg-1，P2 處理下各粒徑磷礦粉的Resin-Pi 平均含量分別為13.9、16.4、16.1 mg·kg-1，較P0 處理分別提高78.5%、42.5%、39.8%和49.5%、45.1%、36.4%（P＜0.05）。接種解磷細(xì)菌后，粒徑0.18 mm 磷礦粉Resin- Pi 平均含量增幅最明顯。3 個(gè)粒徑（0.18、0.10、0.05 mm）下P1 菌株的碳酸氫鈉提取無機(jī)磷（NaHCO3-Pi）平均含量分別為15.6、16.2、16.5 mg·kg-1，P2 菌株的NaHCO3-Pi 平均含量分別為14.9、15.1、15.5 mg·kg-1，均高于P0 處理（分別為13.1、13.2 和13.2 mg·kg-1），分別提高19.1%、22.7%、25.0%和13.7%、14.4%、17.4%（P＜0.05）。粒徑0.18、0.10 mm 磷礦粉接種P2 菌株氫氧化鈉提取有機(jī)磷（NaOH-Po）平均含量分別為73.5、72.0 mg·kg-1，均高于P0 處理（分別為63.0、64.1 mg·kg-1），提高了16.7%、12.3%（P＜0.05）。粒徑0.18 mm 磷礦粉接種P1 菌株稀鹽酸提取無機(jī)磷（Dil.HCl-Pi）平均含量為339.9 mg·kg-1，高于P0 處理（為302.3 mg·kg-1），提高10.5%（P＜0.05）。

表1 接種解磷菌后培養(yǎng)過程中土壤不同磷形態(tài)含量的變化Table 1 Changes of phosphorus pool content during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated

粒徑0.10 和0.05 mm 的磷礦粉接種P1 菌株濃鹽酸提取有機(jī)磷（Conc.HCl-Po）平均含量分別為82.0、82.2 mg·kg-1，接種P2 菌株的Conc.HCl-Po 平均含量分別為75.4、74.6 mg·kg-1，均低于P0 處理（分別為103.5、92.6 mg·kg-1），分別降低20.8%、11.2%和27.2%、19.4%（P＜0.05）。

根據(jù)有效性的不同，Resin-Pi 和碳酸氫鈉提取無機(jī)磷（NaHCO3-Pi）、碳酸氫鈉提取有機(jī)磷（NaHCO3-Po）劃分為活性磷（Labile-P）；氫氧化鈉提取無機(jī)磷（NaOH-Pi）、氫氧化鈉提取有機(jī)磷（NaOH-Po）和稀鹽酸提取無機(jī)磷（Dil.HCl-Pi）劃分為中等活性磷（Mod.labile-P）；濃鹽酸提取無機(jī)磷（Conc.HCl-Pi）、Conc.HCl-Po 和殘?jiān)鼞B(tài)磷（Residual-P）劃分為穩(wěn)定性磷（Non.labile-P）。本研究中各處理的磷形態(tài)主要以Non.labile-P 為主，其次是Mod.labile-P、Labile-P，分別占全磷的47.0%—57.0%、38.0%—48.0%和3.0%—6.0%（圖3）。與P0 相比，接種解磷細(xì)菌后粒徑0.18、0.10和0.05 mm 磷礦粉處理的Labile-P 分別增加28.4%—46.7%、15.0%—39.5%和19.1%—29.5%，Non.labile-P分別降低2.1%—8.0%、1.2%—12.2%和1.5%—10.6%（圖4），表明接種解磷細(xì)菌后，粒徑0.18 mm 磷礦粉的活性磷增幅最大。

圖3 接種解磷細(xì)菌后培養(yǎng)過程中磷庫占比（a-L1；b-L2；c-L3）Fig. 3 Proportion of phosphorus pool during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1; b-L2; c-L3)

圖4 接種解磷細(xì)菌后培養(yǎng)過程中磷庫相對變化比例（a-L1；b-L2；c-L3）Fig. 4 Relative change ratio of phosphorus pool during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1; b-L2; c-L3)

2.4 土壤pH 的變化

各處理下pH 在培養(yǎng)前期迅速增加（1—5 d），隨后緩慢上升至逐漸平穩(wěn)（5—60 d）。整個(gè)培養(yǎng)期間，與P0 相比，接種解磷細(xì)菌（P1 和P2）的處理均顯著降低了pH，分別降低了0.20—0.35 個(gè)單位和0.18—0.28 個(gè)單位（P＜0.05），但不同解磷細(xì)菌間差異不顯著（圖5-a，5-b，5-c）。整個(gè)培養(yǎng)期間，接種P1，粒徑0.10 和0.05 mm 磷礦粉處理的土壤pH 較粒徑0.18 mm 磷礦粉分別升高0.17—0.36 和0.14—0.25 個(gè)單位。接種P2，粒徑0.05 mm 磷礦粉處理的土壤pH 較粒徑0.18 mm 磷礦粉升高0.12—0.39 個(gè)單位（P＜0.05）（圖5-d，5-e，5-f）。

圖5 接種解磷細(xì)菌后培養(yǎng)過程中土壤pH 動(dòng)態(tài)變化（a-L1；b-L2；c-L3；d-P0；e-P1；f-P2）Fig. 5 Dynamic changes of soil pH during cultivation of phosphate-solubilizing bacteria inoculated (a-L1; b-L2; c-L3; d-P0; e-P1;f-P2)

2.5 土壤有機(jī)酸含量的變化

培養(yǎng)第60 天有機(jī)酸主要以乙酸（HAC）為主，其次是草酸（OXA）、丁酸（BA）、丙酸（PA）（圖6）。與P0 相比，接種P1 和P2 解磷細(xì)菌后不同粒徑磷礦粉處理下的HAC 含量均增加，分別提高5.2%—7.4%和9.1%—13.7%，OXA 含量分別提高3.5%—7.0%和1.5%—2.9%（粒徑0.10 mm 磷礦粉除外），BA 含量顯著提高27.2%—47.0%和17.2%—29.2%（P＜0.05），PA 含量顯著提高45.9%—94.0%和64.8%—127.5%（P＜0.05）。解磷細(xì)菌與磷礦粉粒徑對各有機(jī)酸含量的交互作用不顯著。

圖6 接種解磷細(xì)菌60 d 對土壤乙酸（a）、草酸（b）、丁酸（c）和丙酸（d）含量的影響Fig. 6 Effect of 60 days inoculation of phosphate-solubilizing bacteria on acetic acid (a), oxalic acid (b), butyric acid (c), and propionic acid (d) contents in soil

2.6 土壤磷酸酶活性及phoD 基因豐度的變化

培養(yǎng)第60 天堿性磷酸酶（ALP）活性高于酸性磷酸酶（ACP）活性。與P0 相比，接種P1 顯著提高了不同粒徑磷礦粉處理的ALP 活性，提高6.5%—13.4%（P＜0.05），接種P1 和P2 解磷細(xì)菌均顯著提高不同粒徑磷礦粉處理的ACP 活性，分別提高7.6%—10.8%和12.8%—17.2%（P＜0.05）（圖7）。與P0 相比，各不同粒徑磷礦粉接種解磷細(xì)菌phoD基因豐度均有增加趨勢，粒徑0.18 和0.05 mm 的磷礦粉接種P1 的phoD基因豐度分別顯著提高98.6%、81.2%，接種P2顯著提高37.1%、20.1%，且接種不同的解磷細(xì)菌phoD基因豐度存在顯著差異，接種P1 的phoD基因豐度較P2 顯著提高44.8%、50.8%（P＜0.05）（圖8），表明P1 主要分泌ALP，P2 主要分泌ACP。

圖7 接種解磷細(xì)菌60 d 對土壤堿性磷酸酶（a）、酸性磷酸酶（b）活性的影響Fig. 7 Effect of 60 days inoculation of phosphate-solubilizing bacteria on alkaline phosphatase (a) and acid phosphatase (b)activities in soil

圖8 接種解磷細(xì)菌對phoD 基因豐度的影響Fig. 8 Effects of phosphate-solubilizing bacteria inoculation on phoD gene abundance

2.7 土壤磷庫組分與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

磷庫組分與各指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果表明，AP、Resin-Pi 均與有機(jī)酸（HAC、OXA、PA、BA）、phoD、磷酸酶（ALP、ACP）含量呈顯著正相關(guān)，均與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)。NaHCO3-Pi 與有機(jī)酸（HAC、PA）、磷酸酶（ACP）呈顯著正相關(guān)。Conc.HCl-Pi 與有機(jī)酸（HAC、PA）、磷酸酶（ACP）呈顯著負(fù)相關(guān)。Conc.HCl-Po 與有機(jī)酸（HAC）、磷酸酶（ACP）顯著負(fù)相關(guān)，表明接種解磷細(xì)菌主要通過分泌有機(jī)酸（HAC、PA）溶解難溶性無機(jī)磷，分泌有機(jī)酸（HAC、PA），磷酸酶（ALP、ACP）溶解難溶性有機(jī)磷（圖9）。

圖9 磷庫組分與有機(jī)酸（a）、磷酸酶（b）的相關(guān)性分析Fig. 9 Correlation analysis of phosphorus pool components with organic acid (a) and phosphatase (b)

為了進(jìn)一步揭示難溶性磷的活化機(jī)制，將有效磷與各指標(biāo)的內(nèi)在關(guān)系進(jìn)行擬合，構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型（圖10-a），模型的卡方擬合指數(shù)/自由度（χ2/df）= 1.5，P=0.105，擬合優(yōu)度指數(shù)（GFI）=0.890，比較擬合指數(shù)（CFI）=0.963。結(jié)果顯示，該模型解釋了74.0%的有效磷的變異，其中接種解磷細(xì)菌與磷礦粉的粒徑均可直接影響土壤有效磷含量，通徑系數(shù)分別為0.32 和0.25。接種解磷細(xì)菌后增加有機(jī)酸分泌（0.79），提高磷酸酶活性（0.77），有機(jī)酸與磷酸酶促進(jìn)難溶性磷向活性磷轉(zhuǎn)化（0.44、0.51），對土壤有效磷有直接的正效應(yīng)（0.36）。有效磷（AP）的標(biāo)準(zhǔn)化總效應(yīng)通徑系數(shù)表明（圖10-b），磷礦粉粒徑（PRP）、解磷細(xì)菌（PSB）、有機(jī)酸（OA）、磷酸酶（Enzyme）、土壤理化性質(zhì)（SP）、穩(wěn)定性磷（Non.labile-P）、中等活性磷（Mod.labile-P）、活性磷（Labile-P）對有效磷的影響分別為0.17、0.77、0.16、0.17、-0.34、0.04、-0.03、0.36。綜上分析，接種解磷細(xì)菌與添加不同粒徑磷礦粉均可直接提高有效磷含量，解磷細(xì)菌對有效磷的影響更大，通過分泌有機(jī)酸、磷酸酶促進(jìn)磷庫的周轉(zhuǎn)，增加有效磷含量。

圖10 解磷細(xì)菌與磷礦粉粒徑影響有效磷含量的結(jié)構(gòu)方程模型（a）和有效磷的標(biāo)準(zhǔn)化總效應(yīng)（b）Fig. 10 Structural equation model of phosphate solubilizing bacteria and particle size of phosphate rock powder affecting available phosphorus content (a) and total standardized effect of available phosphorus (b)

3 討論

3.1 解磷細(xì)菌對紅壤施用低品位磷礦粉的活化效應(yīng)及其影響因素

本研究中影響磷有效性的因素主要有磷礦粉粒徑、解磷細(xì)菌和土壤環(huán)境等。其中粒徑是影響磷礦粉中磷形態(tài)的重要因素之一，同時(shí)，也影響解磷細(xì)菌對磷礦粉的活化效果。本研究表明，粒徑0.05 mm 磷礦粉接種解磷細(xì)菌后土壤有效磷含量增幅較高（圖1-a、1-b、1-c），可能磷礦粉粒徑越小，比表面積越大，與土壤及解磷微生物的接觸面積越大，活化效果越好[27]。本研究還發(fā)現(xiàn)，不接菌條件下，0.05 mm、0.10 mm 磷礦粉處理中Resin-Pi 含量要顯著高于0.18 mm磷礦粉，說明機(jī)械活化磷礦粉產(chǎn)生結(jié)構(gòu)缺陷使磷礦中的磷更多處于不穩(wěn)定態(tài)，更多的活性磷如Resin-Pi 被釋放，提高磷礦粉中磷灰石的反應(yīng)活性。但粒徑0.18 mm 磷礦粉接種解磷細(xì)菌后Resin-Pi 及活性磷含量增幅最大（圖4），可能是粒徑0.18 mm 的磷礦粉比表面積小，機(jī)械活化釋放的活性磷較少，接種解磷細(xì)菌后更多不穩(wěn)定性磷被活化，活性磷的增加比例更大，進(jìn)一步說明接種解磷細(xì)菌能夠促進(jìn)外源添加磷礦粉中難溶性磷的活化[28]。磷礦粉施入土壤后其肥效受土壤pH 影響，pH 越低，磷礦粉在土壤中的溶解性越強(qiáng)，難溶性磷越容易釋放[29]。解磷細(xì)菌在生長代謝過程中釋放質(zhì)子，降低土壤pH。本研究中，與不接種對照對比，接種解磷細(xì)菌pH 降低了0.18—0.35 個(gè)單位，促進(jìn)了磷礦粉中難溶性磷的溶解。機(jī)械活化磷礦粉可以提高磷礦粉的pH[30]。本研究也表明，在不接菌條件下，整個(gè)培養(yǎng)期間，粒徑0.05 和0.10 mm 磷礦粉處理的土壤pH 高于粒徑0.18 mm 磷礦粉，但粒徑0.05 和0.10 mm 磷礦粉接種解磷細(xì)菌后，土壤pH 顯著高于粒徑0.18 mm 磷礦粉?？赡芤?yàn)榱椎V粉施入土壤，其分解后釋放H2PO4-、F-、SO42-等陰離子置換了土壤膠體表面的OH-基，使土壤pH 升高[4]，這兩種粒徑磷礦粉的比表面積大，與解磷細(xì)菌的接觸面積大，接種解磷細(xì)菌后會(huì)增強(qiáng)此過程，導(dǎo)致其pH 增幅較大。

磷在土壤中以不同形態(tài)存在，因Tiessen 磷分級(jí)法同時(shí)適用于酸性、堿性土壤，將土壤磷形態(tài)劃分為6 種類型，分別為樹脂交換態(tài)磷、NaHCO3浸提態(tài)磷、NaOH 浸提態(tài)磷、Dil.HCl 浸提態(tài)磷、Conc.HCl 浸提態(tài)磷和殘留態(tài)磷，較為全面地評(píng)價(jià)土壤無機(jī)磷和有機(jī)磷有效性，是目前廣泛應(yīng)用的測定土壤各磷形態(tài)的方法[31]。各磷形態(tài)的生物學(xué)意義不同，其中樹脂交換態(tài)磷和NaHCO3浸提態(tài)磷，為易解離、易礦化成能被植物利用吸收的磷，NaOH 浸提態(tài)磷屬于土壤黏?；蜩F鋁化合物表面化學(xué)吸附的磷組分，Dil.HCl 浸提態(tài)磷和Conc.HCl 浸提態(tài)磷為磷灰石型磷和閉蓄態(tài)磷，與土壤中的Ca 有關(guān)，殘留態(tài)磷是土壤中最穩(wěn)定的磷，植物較難吸收利用[32]。接種解磷細(xì)菌可以改變磷形態(tài)，加速土壤中磷組分循環(huán)，提高磷素有效性。LIU 等[21]研究表明，解磷細(xì)菌會(huì)使難溶性磷HCl-P 和Residual-P含量降低，將其轉(zhuǎn)化成活性磷H2O-Pi、NaHCO3-Pi、NaOH-Pi，促進(jìn)土壤磷素活化。LIU 等[33]發(fā)現(xiàn)，接種解磷細(xì)菌使活性磷H2O-Pi 含量提高46.6%，穩(wěn)定性磷R(shí)esidual-P 含量降低20.0%。本研究結(jié)構(gòu)方程模型結(jié)果顯示，接種解磷細(xì)菌對有效磷的標(biāo)準(zhǔn)化總效應(yīng)通徑系數(shù)為0.77，是提高有效磷的主要因素（圖10）。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，接種解磷細(xì)菌土壤有效磷含量增加31.1%—53.1%（圖1），土壤活性磷庫增加15.0%—46.7%，穩(wěn)定性磷庫降低1.2%—12.2%（圖3），表明兩株解磷細(xì)菌均能夠分解難溶性磷，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長，接種解磷細(xì)菌處理的Resin-Pi 含量逐漸增加，說明培養(yǎng)期間解磷細(xì)菌能保持解磷活性，分解難溶性磷，使活性磷含量持續(xù)增加[34]。解磷細(xì)菌生長過程中利用一部分分解的磷組建其細(xì)胞成分，提高微生物量磷含量（圖2），隨時(shí)間延長，一部分微生物量磷又可轉(zhuǎn)化成無機(jī)磷，使有效磷含量又升高[35]。

3.2 解磷細(xì)菌對紅壤施用低品位磷礦粉的活化機(jī)制

3.2.1 有機(jī)酸對難溶性無機(jī)磷與有機(jī)磷的影響 堿性土壤中有機(jī)酸可以促進(jìn)土壤磷酸鈣鹽向有效性較高的磷形態(tài)轉(zhuǎn)化[36]，酸性土壤中低分子量有機(jī)酸作為金屬螯合劑，與土壤中的鐵鋁離子發(fā)生螯合[37]，促進(jìn)難溶性的土壤磷酸鐵/鋁鹽的轉(zhuǎn)化，提高可溶性磷酸鹽含量。王樹起等[38]研究發(fā)現(xiàn)添加檸檬酸、草酸使難溶性磷Ca10-P、Al-P 和Fe-P 含量均顯著降低，可溶態(tài)磷的Ca8-P 含量顯著增加，表明低分子量有機(jī)酸能與難溶性礦物中的Ca2+、Fe3+和Al3+產(chǎn)生螯合，促進(jìn)土壤難溶態(tài)磷向可溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化。因解磷細(xì)菌種類[39]以及接種土壤環(huán)境條件（如pH、養(yǎng)分）等因素[40]，解磷細(xì)菌分泌的有機(jī)酸種類存在差異，一般有葡萄糖酸、蘋果酸、乙酸、草酸、丙酸、丁二酸等。據(jù)報(bào)道，不動(dòng)桿菌屬的解磷細(xì)菌通過分泌乙酸、草酸、葡萄糖酸等有機(jī)酸[41]，減少磷的固定，促進(jìn)土壤中植物難以利用無機(jī)磷的形態(tài)向有效性較高的無機(jī)磷形態(tài)轉(zhuǎn)化[42]。本研究結(jié)果表明，接種解磷細(xì)菌增加乙酸、草酸、丙酸、丁酸的含量，降低了pH，從而促進(jìn)穩(wěn)定性磷酸鈣鹽（Conc.HCl-Pi）、磷酸鐵/鋁鹽（NaOH-Pi）向活性較高的無機(jī)磷形態(tài)轉(zhuǎn)化（Resin-Pi、NaHCO3-Pi）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)乙酸與難溶性有機(jī)磷Conc.HCl-Po呈顯著負(fù)相關(guān)，乙酸、丙酸與難溶性無機(jī)磷Conc.HCl-Pi 呈顯著負(fù)相關(guān)，與活性無機(jī)磷R(shí)esin-Pi、NaHCO3-Pi 顯著正相關(guān)（圖9-a），表明這兩種酸在促進(jìn)難溶性無機(jī)磷的轉(zhuǎn)化中占主導(dǎo)地位，且對難溶性有機(jī)磷具有很好的溶解效果，說明這兩株菌株能夠溶解難溶性無機(jī)磷和有機(jī)磷。

3.2.2 磷酸酶對難溶性有機(jī)磷的影響 解磷細(xì)菌產(chǎn)生的磷酸酶可水解C–O–P 酯鍵從有機(jī)磷中釋放出無機(jī)磷[43]，促進(jìn)難溶性有機(jī)磷的分解，轉(zhuǎn)化成利于被植物吸收利用的可溶性無機(jī)磷。本研究中接種2 株解磷細(xì)菌均增加了酸性和堿性磷酸酶活性（圖7），但可能因菌株自身遺傳特性等因素[44]，兩株解磷細(xì)菌主要分泌的磷酸酶種類亦不同。結(jié)構(gòu)方程模型顯示接種解磷細(xì)菌可以促進(jìn)磷酸酶分泌（0.51），且磷酸酶對活性磷庫有顯著的正向直接效應(yīng)（0.56），對難溶性磷庫有顯著的負(fù)向直接效應(yīng)（-0.43），磷酸酶對有效磷的標(biāo)準(zhǔn)化總效應(yīng)通徑系數(shù)為0.17（圖10），表明磷酸酶的分泌會(huì)影響磷庫組分，促進(jìn)磷庫周轉(zhuǎn)，其中酸性磷酸酶與難溶性有機(jī)磷Conc.HCl-Po 顯著負(fù)相關(guān)，與活性無機(jī)磷R(shí)esin-Pi、NaHCO3-Pi 顯著正相關(guān)（圖9-b），堿性磷酸酶與AP、Resin-Pi 含量顯著正相關(guān)，表明磷酸酶可以促進(jìn)難溶性有機(jī)磷溶解，從而提高無機(jī)磷含量。研究發(fā)現(xiàn)，酸性土壤主要以酸性磷酸酶為主[45]，但在本研究中的堿性磷酸酶活性高，主要是接種解磷細(xì)菌顯著增加了phoD基因豐度（圖8），接種解磷細(xì)菌導(dǎo)致phoD編碼的微生物群落組成發(fā)生變化，富集了phoD基因豐度，進(jìn)而釋放出更多的堿性磷酸酶[46]。HE 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，接種不動(dòng)桿菌屬解磷細(xì)菌增加了與有機(jī)磷轉(zhuǎn)化相關(guān)的phoD功能基因豐度，提高磷的有效性，這與本研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

接種解磷細(xì)菌能促進(jìn)磷礦粉中難溶性磷的活化，增加土壤有效磷含量及活性磷的占比，粒徑0.05 mm的磷礦粉有效磷增幅最大，但粒徑0.18 mm 磷礦粉中活性磷的占比增幅最大，活化效果最好。兩株解磷細(xì)菌主要通過分泌乙酸、丙酸溶解難溶性有機(jī)磷（Conc.HCl-Po）與無機(jī)磷（Conc.HCl-Pi、NaOH-Pi），分泌酸性磷酸酶與堿性磷酸酶溶解難溶性有機(jī)磷（Conc.HCl-Po），向活性較高的Resin-Pi、NaHCO3-Pi轉(zhuǎn)化，促進(jìn)磷庫的周轉(zhuǎn)，提高磷礦粉在紅壤性水稻土中的施用效果。