羅麗丹，陳嘉明，安琪，劉磊，孫勤哲，劉歡，王森山，宋麗雯

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070

0 引言

【研究意義】截形葉螨（Tetranychustruncatus）屬蛛形綱（Arachnida）、蜱螨目（Arachnoidea）、葉螨科（Tetranyehidea）、葉螨屬（Tetranychus）[1]，其寄主廣泛，在玉米、棉花、蔬菜等重要作物上危害嚴(yán)重，是我國(guó)北方大部分地區(qū)的一種重要害螨[2-4]。葉螨個(gè)體小、繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng)，且其在高溫干旱環(huán)境下危害程度加重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，尋求新的綠色防控策略迫在眉睫。【前人研究進(jìn)展】隨著全球氣候變暖，夏季極端氣溫發(fā)生頻次增加，田間溫度持續(xù)升高，尤其在午時(shí)瞬時(shí)增溫通常能達(dá)50 ℃[5]，這對(duì)昆蟲（或螨）適應(yīng)高溫環(huán)境提出了新的挑戰(zhàn)。當(dāng)昆蟲遭遇高溫時(shí)，通常會(huì)通過調(diào)節(jié)行為或生理生化活動(dòng)來躲避或降低高溫的傷害[6-7]。例如，它們會(huì)調(diào)節(jié)體內(nèi)抗逆物質(zhì)以減少高溫脅迫產(chǎn)生的危害[8-10]。海藻糖是昆蟲體內(nèi)的主要血糖，占血淋巴中糖分的80%—90%[11]。其不僅在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育過程中提供能量，也在抵御各種逆境中發(fā)揮著重要作用[12-13]。當(dāng)外界環(huán)境或昆蟲的營(yíng)養(yǎng)狀況發(fā)生變化時(shí)，昆蟲可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)血淋巴中的海藻糖濃度來穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，保護(hù)自身免受逆境影響[14]。海藻糖主要合成部位在脂肪體中[15-16]，其不能直接穿過細(xì)胞膜，主要依靠特定的海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（trehalose transporter，Tret）在細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。而在較多研究中發(fā)現(xiàn)海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tret1 在海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用[17-19]。Tret1 通過調(diào)整昆蟲體內(nèi)海藻糖的分布來抵抗各種逆境，亦直接參與各種抗逆活動(dòng)，其在昆蟲響應(yīng)環(huán)境脅迫中起著重要作用。例如低溫能顯著提高橢圓食粉螨（Aleuroglyphus ovatus）海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含量，積累海藻糖，且在低溫脅迫下，其兩個(gè)AoTret1顯著上調(diào)[20]；在岡比亞按蚊（Anophelesgambiae）中，AgTret1的表達(dá)受干燥和高溫的誘導(dǎo)，沉默AgTret1后可降低岡比亞按蚊血淋巴海藻糖水平，使其在干燥或炎熱的環(huán)境中更易死亡[21]。同樣，在高溫脅迫下，小菜蛾（Plutella xylostella）體內(nèi)的PxTret-1表達(dá)升高，PxTret-1被敲除后，其脂肪體中海藻糖難以運(yùn)輸至血淋巴中，因此在高溫脅迫下，小菜蛾成蟲的存活率降低[22]?？梢奣ret在調(diào)節(jié)機(jī)體應(yīng)對(duì)各種逆境活動(dòng)中具有重要作用。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于蛛形綱中Tret的報(bào)道較少，Tret1是否在截形葉螨耐受高溫環(huán)境的脅迫中發(fā)揮重要作用尚不明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】探究截形葉螨TtTret1-like和TtTret1編碼蛋白的理化性質(zhì)及其在抵抗高溫中的功能，為尋找新型殺蟲（螨）劑靶點(diǎn)和開發(fā)綠色農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2023年2—10月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

1.1 TtTret1-like 和TtTret1 蛋白序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

基于截形葉螨三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（已上傳至NCBI Sequence Read Archive （SRA）數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)：SRR21659835—SRR21659850），獲取兩個(gè)海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TtTret1-like和TtTret1的編碼序列。

采用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)TtTret1-like 和TtTret1 的理化性質(zhì)；ProScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析TtTret1-like 和TtTret1 的疏水性/親水性；Conserved Domain Database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和TMHMM2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)TtTret1-like 和TtTret1 的跨膜結(jié)構(gòu)域和保守結(jié)構(gòu)域；利用PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)TtTret1-like 和TtTret1 的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。選取不同物種Tret1 的氨基酸序列，采用MEGA11.0 軟件中的鄰接法構(gòu)建 TtTret1-like 和TtTret1 的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 供試螨源

截形葉螨飼養(yǎng)于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲生態(tài)養(yǎng)蟲室（溫度24—26 ℃，相對(duì)濕度55%—65%，光周期16 h∶8 h（L∶D））的盆栽豇豆植株上。采用雌雄單系（一雌一雄）進(jìn)行擴(kuò)繁后，挑取齡期一致的卵（2 000 粒）、幼螨（1 000 頭）、若螨（500 頭）和雌成螨（200 頭）于1.5 mL 無酶離心管中，液氮冷凍后，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 高溫脅迫試驗(yàn)

高溫脅迫試驗(yàn)在智能人工氣候箱（QRGN-400-3，杭州琦勝電子科技有限公司，中國(guó)）內(nèi)進(jìn)行，挑取2—3 日齡截形葉螨雌成螨200 頭于葉碟上[23]，分別置于38、42、46、50 ℃下處理2 h，以25 ℃為對(duì)照，每處理設(shè)置4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。挑取高溫脅迫后的成螨200頭于1.5 mL 無酶離心管中，液氮冷凍后，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 海藻糖含量測(cè)定

采用勻漿法提取截形葉螨的血淋巴[24]，參照微量法海藻糖含量試劑盒說明書（上海液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)有限公司）進(jìn)行海藻糖含量檢測(cè)。

1.5 截形葉螨總RNA 的提取及cDNA 的合成

用Trizol 法提取不同發(fā)育階段和不同處理下截形葉螨的總RNA，用微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 的濃度，選取1.8＜ODA260/A280＜2.2 的樣品，按照寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后的cDNA 保存于-20 ℃冰箱中。

1.6 引物設(shè)計(jì)

用Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)TtTret1-like和TtTret1的qRT-PCR 引物和dsRNA 引物，選用Actin和RPS18作為截形葉螨qRT-PCR 的內(nèi)參基因，以dsGFP為對(duì)照，具體引物序列見表1。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.7 TtTret1-like 和TtTret1 的表達(dá)分析

采用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 試劑盒（Novoprotein Scientific Inc，中國(guó)上海）進(jìn)行檢測(cè)，qRT-PCR 反應(yīng)體系10 μL：0.5 μL cDNA 模板，5 μL 2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus，0.5 μL 10 μmol·L-1Sense-Primer ， 0.5 μL 10 μmol·L-1AntiSense-Primer，0.2 μL ROX Ⅱ，3.3 μL RNase Free Water。qRT-PCR 程序：（1）95 ℃ 2 min，接著（2）95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s 和95 ℃ 15 s 循環(huán)40 次，（3）60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。每處理4 個(gè)模板。具體qRT-PCR 引物序列見表1。

1.8 RNAi

使用dsRNA 引物（表1），PCR 擴(kuò)增TtTret1-like和TtTret1的目的片段，其在正義鏈和反義鏈中均含有T7 啟動(dòng)子區(qū)域。以回收的PCR 產(chǎn)物為模板進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，對(duì)轉(zhuǎn)化成功的菌液進(jìn)行質(zhì)?；厥?。然后使用TranscriptAid T7 高產(chǎn)轉(zhuǎn)錄試劑盒制備dsRNA 并純化。最終的dsRNA 溶解在無酶水中，短暫離心后，使用分光光度計(jì)對(duì)dsRNA 進(jìn)行濃度的測(cè)定，dsRNA 濃度稀釋為1 400 ng·μL-1。

喂食截形葉螨目的基因的dsRNA[25]，具體步驟如下：將豇豆葉片切成邊長(zhǎng)為1.5 cm 的正方形，60 ℃烘箱干燥脫水3 min 后，分別用50 μL 濃度為1 400 ng·μL-1的dsGFP、dsTtTret1-like和dsTtTret1處理葉片1—2 h。完全吸收后，將葉片放在制備好的葉碟上。挑取饑餓處理24 h 的3—5 日齡的70 頭雌成螨至處理過的葉片上，每處理3 個(gè)重復(fù)。飼喂dsRNA 48 h 后，挑取存活的截形葉螨用于qRT-PCR 檢測(cè)和海藻糖含量測(cè)定。并挑取存活的50 頭葉螨于新鮮葉碟中，置于50 ℃下處理2 h，進(jìn)行耐熱性測(cè)試，每處理3 個(gè)重復(fù)。以dsGFP作為對(duì)照。處理后置于常溫進(jìn)行恢復(fù)，每隔12 h 觀察并統(tǒng)計(jì)其死亡率。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2016 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，整理后的數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素ANOVA 檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Origin 2018 軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 TtTret1-like 和TtTret1 生物信息學(xué)分析

TtTret1-like和TtTret1的CDS 全長(zhǎng)分別為1 389和1 569 bp，分別編碼463 和523 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量分別為50 189.03 和57 358.10 Da，等電點(diǎn)分別為8.87 和8.70。TtTret1-like 和TtTret1 均為堿性氨基酸和疏水性氨基酸且同屬于不穩(wěn)定蛋白。TtTret1- like 和TtTret1 蛋白均具有12 個(gè)跨膜區(qū)（圖1-A），均具有MFS 超家族的典型結(jié)構(gòu)域（圖1-B）。此外，TtTret1-like 和TtTret1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖1-C）及三級(jí)結(jié)構(gòu)（1-D）以螺旋和卷曲為主。

圖1 TtTret1-like 和TtTret1 生物信息學(xué)分析Fig. 1 Bioinformatics analysis of TtTret1-like and TtTret1

2.2 TtTret1-like 和TtTret1 進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，截形葉螨TtTret1-like 和TtTret1 分別與同屬于葉螨屬的二斑葉螨TuTret1-like和TuTret1 親緣關(guān)系較近（圖2）。

圖2 TtTret1-like 和TtTret1 系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of TtTret1-like and TtTret1

2.3 截形葉螨不同發(fā)育階段TtTret1-like 和TtTret1的表達(dá)模式

利用qRT-PCR 檢測(cè)截形葉螨各發(fā)育階段TtTret1-like和TtTret1的相對(duì)表達(dá)量（圖3）。TtTret1-like和TtTret1在截形葉螨各發(fā)育階段均有表達(dá)。在卵、幼螨和成螨期，TtTret1-like的表達(dá)量無顯著差異，但均顯著高于若螨期的表達(dá)量。TtTret1在幼螨期的表達(dá)量最高，其次是成螨期；卵期和若螨期的表達(dá)量無顯著差異。

圖3 TtTret1-like 和TtTret1 在截形葉螨不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expression level of TtTret1-like and TtTret1 at different developmental stages of T. truncatus

2.4 高溫對(duì)TtTret1-like 和TtTret1 表達(dá)的影響

由圖4 可見，各處理組TtTret1-like的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（25 ℃），且隨著溫度升高呈上升趨勢(shì)，在50 ℃表達(dá)量最高，為對(duì)照組的5.65 倍；TtTret1的表達(dá)量隨溫度的升高先上升后下降，直至趨于對(duì)照組水平，其在42 ℃達(dá)到最大值，為對(duì)照組的5.01 倍。該結(jié)果表明高溫誘導(dǎo)了截形葉螨TtTret1-like和TtTret1的表達(dá)。

圖4 不同高溫下TtTret1-like 和TtTret1 的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression level of TtTret1-like and TtTret1 at different high temperatures

2.5 高溫對(duì)截形葉螨海藻糖含量的影響

海藻糖含量測(cè)定結(jié)果顯示，各高溫處理組的截形葉螨體內(nèi)海藻糖含量均顯著高于對(duì)照組（圖5），其中38、46、50 ℃海藻糖含量最高，表明截形葉螨在應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)可能通過調(diào)控海藻糖含量來提高自身耐熱性。

圖5 不同高溫下截形葉螨的海藻糖含量Fig. 5 Trehalose content of T. truncatus at different high temperatures

2.6 沉默TtTret1-like 和TtTret1 對(duì)截形葉螨海藻糖含量的影響

采用qRT-PCR 方法檢測(cè)飼喂dsRNA 48 h 后TtTret1-like和TtTret1的相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組dsGFP相比，TtTret1-like和TtTret1的相對(duì)表達(dá)量均極顯著下調(diào)（P＜0.01），沉默效率分別為78.2%、70.3%（圖6-A、6-B），飼喂dsRNA 可有效降低截形葉螨靶標(biāo)基因的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)了飼喂dsTtTret1-like和dsTtTret148 h 后截形葉螨成螨體內(nèi)的海藻糖含量。與對(duì)照組dsGFP相比，干擾TtTret1-like和TtTret1后截形葉螨體內(nèi)的海藻糖含量顯著增加（圖6-C），血淋巴的海藻糖含量顯著降低（圖6-D）。

圖6 干擾TtTret1-like 和TtTret1 對(duì)截形葉螨體內(nèi)基因表達(dá)及海藻糖含量的影響Fig. 6 Effects of interference with TtTret1-like and TtTret1 on gene expression and trehalose content in T. truncatus

2.7 RNAi 對(duì)截形葉螨耐熱性的影響

由圖7 可知，將飼喂dsTtTret1-like和dsTtTret148 h 后的截形葉螨進(jìn)行高溫50 ℃暴露處理2 h，再置于室溫，12 h 后，存活率分別為44%和78%，顯著低于對(duì)照組dsGFP，96 h 后存活率分別為11%和46.67%。表明TtTret1-like和TtTret1在截形葉螨抵御高溫脅迫中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。

圖7 50 ℃極端溫度對(duì)沉默TtTret1-like 和TtTret1 后截形葉螨成螨生存的影響Fig. 7 Effects of 50 ℃ extreme temperature on the survival of T. truncatus adults after silencing TtTret1-like and TtTret1

3 討論

3.1 TtTret1-like 和TtTret1 生物信息學(xué)分析

海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種海藻糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在維持昆蟲體內(nèi)平衡和溫度脅迫耐受方面發(fā)揮重要作用[26-27]，其具有與大多數(shù)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似的理化性質(zhì)。本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的TtTret1-like 和TtTret1 均屬于MFS 超家族，它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)主要為卷曲和螺旋結(jié)構(gòu)[28]。同時(shí)，TtTret1-like 和TtTret1 具有12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而大多數(shù)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的典型結(jié)構(gòu)具有12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。SAIER 研究發(fā)現(xiàn)，MFS 超家族成員蛋白多數(shù)具有12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，少數(shù)具有14 或24 個(gè)跨膜區(qū)[29]；棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）中的大多數(shù)糖轉(zhuǎn)運(yùn)體有10—12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[30]。這說明TtTret1-like 和TtTret1 與大多數(shù)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)相似。KIKAWADA 等研究也發(fā)現(xiàn)，Tret1 與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporter，Glut）家族之間保守氨基酸序列總體相似，推測(cè)Tret1 可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的功能。對(duì)嗜眠搖蚊（Polypedilumvanderplanki）的研究發(fā)現(xiàn)，PvTret1 不僅可以運(yùn)輸海藻糖，還可以運(yùn)輸葡萄糖類似物，因此推測(cè)Tret1 可能是Glut 超家族的新成員；但也有研究表明Tret 在底物選擇和運(yùn)輸動(dòng)力學(xué)方面與Glut 不同，Tret1 是否為Glut 超家族新成員還有待進(jìn)一步研究[19,31]。

3.2 TtTret1-like 和TtTret1 在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

海藻糖是昆蟲體內(nèi)一種主要的循環(huán)糖，在發(fā)育轉(zhuǎn)變和應(yīng)激恢復(fù)期間維持能量和葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，其在昆蟲體內(nèi)的分布主要由海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tret 調(diào)節(jié)，是飛行肌肉、卵巢和睪丸等生殖組織的即時(shí)能量來源[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在截形葉螨不同發(fā)育階段中均能檢測(cè)到TtTret1-like和TtTret1的表達(dá)，說明TtTret1-like和Tret1在截形葉螨的生長(zhǎng)發(fā)育及生殖中不可或缺。TtTret1-like和TtTret1在截形葉螨幼螨和成螨期均高表達(dá)，在若螨期低表達(dá)，推測(cè)活動(dòng)性較差的幼螨及成螨更需要海藻糖作為能源來完成生長(zhǎng)發(fā)育及生殖活動(dòng)，因此作為重要中介的海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表現(xiàn)出較高的表達(dá)量。與此類似的有，橢圓食粉螨AoTret1-1和AoTret1-2在卵期和成螨期高表達(dá)，在幼螨和若螨期低表達(dá)[20]。因此，對(duì)于能量需求較大的螨態(tài)，會(huì)通過調(diào)整自身的一系列行為來適應(yīng)逆境，進(jìn)而完成其生命活動(dòng)[32]。此外，果蠅（Drosophila）的Tret1-1和Tret1-2在脂肪體和外周組織中表達(dá)，Tret1-1在大腦中高度表達(dá)，這對(duì)于果蠅在血腦屏障處輸入富含能量的糖類至關(guān)重要[33-34]。在家蠶（Bombyxmori）中，Tret1在脂肪體、睪丸和肌肉中高度表達(dá)[31]。本試驗(yàn)僅研究了截形葉螨Tret1在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，尚未對(duì)該螨各組織中Tret1的表達(dá)水平進(jìn)行研究，后續(xù)有待于進(jìn)一步開展。

3.3 截形葉螨海藻糖及TtTret1-like 和TtTret1 對(duì)高溫的響應(yīng)

海藻糖在抵抗高溫方面的重要作用已得到廣泛認(rèn)可，如雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲（Monoleptahieroglyphica）[35]、白蠟窄吉丁（Agrilusplanipennis）[36]、西伯利亞蝗（Gomphocerussibiricus）[8]在高溫條件下會(huì)通過積累海藻糖來提高耐熱性，以適應(yīng)高溫環(huán)境。Tret在長(zhǎng)紅獵蝽（Rhodniusprolixus）吸血后或饑餓狀態(tài)下表達(dá)增加，表明其可能在血淋巴直接吸收或釋放海藻糖中發(fā)揮作用[37]；此外，該基因在嗜眠搖蚊需要能量時(shí)高表達(dá)，比如交配和環(huán)境壓力（脫水、冷、熱、濕或鹽脅迫）下[19,31,38]。本研究中發(fā)現(xiàn)高溫處理下截形葉螨體內(nèi)TtTret1-like和TtTret1表達(dá)上調(diào)，推測(cè)截形葉螨需要足夠的海藻糖來抵御外界高溫，進(jìn)而海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因也協(xié)同上調(diào)表達(dá)，表明TtTret1-like和TtTret1參與了應(yīng)對(duì)高溫脅迫的過程。

為了進(jìn)一步研究TtTret1-like和TtTret1對(duì)極端高溫的響應(yīng)，本研究通過RNAi 技術(shù)沉默TtTret1-like和TtTret1后發(fā)現(xiàn)，截形葉螨體內(nèi)的海藻糖含量顯著上升，但血淋巴的海藻糖含量顯著降低，截形葉螨對(duì)高溫的耐受性降低，在高溫中更易死亡。海藻糖的跨膜運(yùn)輸主要依賴于海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，推測(cè)沉默TtTret1-like和TtTret1后海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減少，導(dǎo)致在脂肪體中合成的海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)到血淋巴的過程受阻，進(jìn)而降低了截形葉螨對(duì)高溫的適應(yīng)性。這與許多研究結(jié)果一致。沉默AgTret1后，岡比亞按蚊血淋巴中的海藻糖含量降低，在高溫低濕環(huán)境中更易死亡[19]。敲除PxTret-1的突變體小菜蛾，其海藻糖含量整體升高，但血淋巴海藻糖含量降低，導(dǎo)致小菜蛾對(duì)溫度的適應(yīng)性降低[22]。此外，在大猿葉甲（Colaphellusbowringi）中，沉默CbTret1a提高了脂肪體中海藻糖含量，降低了一些應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)[39]。在褐飛虱（Nilaparvata lugens）中，沉默NlTret1-likeX1后，降低了褐飛虱體內(nèi)所有海藻糖合成酶和海藻糖酶基因的表達(dá)，同時(shí)降低了海藻糖酶活性，從而引起褐飛虱體內(nèi)海藻糖含量升高[40]。這些研究表明特異性轉(zhuǎn)運(yùn)海藻糖蛋白在昆蟲的能量供應(yīng)中具有重要作用，增強(qiáng)了昆蟲對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)能力。究其原因，可能是昆蟲在不斷取食的過程中，蔗糖可在腸道內(nèi)水解成果糖和葡萄糖[41]，隨即葡萄糖通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體Glut 轉(zhuǎn)運(yùn)到脂肪體，并通過TPS/TPP 迅速合成海藻糖[15-16]，而脂肪體合成的海藻糖需要依靠海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到血淋巴和其他需要能量的組織中。這說明海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tret 在昆蟲或螨應(yīng)對(duì)高溫環(huán)境中具有重要作用。

4 結(jié)論

TtTret1-like 和TtTret1 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，二級(jí)結(jié)構(gòu)以螺旋和卷曲為主，且均屬于MFS 超家族，具有12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。TtTret1-like 和TtTret1 分別與同為葉螨屬的二斑葉螨TuTret1-like 和TuTret1 的親緣關(guān)系較近。高溫使截形葉螨體內(nèi)的海藻糖含量顯著上升，誘導(dǎo)TtTret1-like和TtTret1上調(diào)表達(dá)，且當(dāng)這兩個(gè)基因的表達(dá)被抑制后，可明顯降低截形葉螨的耐熱性。研究結(jié)果可為研發(fā)新型殺螨劑的防控靶標(biāo)提供理論依據(jù)。