錢(qián)舒樂(lè)，于 露，李曉鳳，王潤(rùn)英，宋博涵，趙玉珂，郭海珍，杜武勛*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150

心律失常是指心臟沖動(dòng)的頻率、節(jié)律、起源部位、傳導(dǎo)速度或激動(dòng)次序的異常[1]。研究表明，88%的心源性猝死是由心律失常引起的，心律失常會(huì)導(dǎo)致心臟和其他器官疾病嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生[2]。心肌梗死缺血再灌注后，室早、室速、室顫及房顫的發(fā)生率高達(dá)80%[3]，是增加心梗后手術(shù)難度及影響患者預(yù)后的主要因素，也是心肌缺血再灌注損傷最主要、最嚴(yán)重的表現(xiàn)，可占心血管死亡事件的50%左右[4]。心律失常還是心衰常見(jiàn)并發(fā)癥之一，為心衰患者死亡的重要原因。由此可知，心律失常不僅是獨(dú)立的心血管事件，還會(huì)伴隨許多基礎(chǔ)心臟疾病出現(xiàn)并嚴(yán)重影響預(yù)后，心律失常的防治對(duì)于心血管疾病的預(yù)后意義重大。

以穩(wěn)心顆粒為代表的中藥復(fù)方在抗心律失常方面療效顯著，且安全性高，臨床未見(jiàn)致心律失常等不良反應(yīng)的報(bào)道[5-8]。許多研究表明，穩(wěn)心顆粒單獨(dú)或聯(lián)合化學(xué)藥用于心律失常，均有良好的療效[9-11]。炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)是心力衰竭、心律失常、心肌梗死等多種心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生及病情進(jìn)展的病理基礎(chǔ)，減輕炎癥、抑制氧化應(yīng)激可減少心肌細(xì)胞凋亡，緩解心肌損傷，改善心律失常癥狀[12]。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建心律失常大鼠模型，探討穩(wěn)心顆粒對(duì)其凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激的影響，為其抗心律失常的機(jī)制研究開(kāi)辟新的思路，也為穩(wěn)心顆粒的臨床運(yùn)用夯實(shí)理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均飼養(yǎng)于環(huán)境溫度為（23±2）℃，相對(duì)濕度為（35±5）%的中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，光照12 h 明暗交替，自由飲水、普通飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)IRM-DWLL-2023190）。

1.2 藥品與試劑

穩(wěn)心顆粒（無(wú)糖型，5 g/袋，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950026，批號(hào)2205019）購(gòu)自山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司；鹽酸胺碘酮片（可達(dá)龍，0.2 g/片，國(guó)藥準(zhǔn)字HJ20181050，批號(hào)EA2413）購(gòu)自賽諾菲（杭州）制藥有限公司；烏頭堿（批號(hào)110799-201608）購(gòu)自寶雞市辰光生物科技有限公司；烏拉坦（批號(hào)Z11M12Y141466）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號(hào)均為20231010-20240409）購(gòu)自天津天景澄生物科技有限公司；NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗體（批號(hào)8798121）購(gòu)自美國(guó)Affinity Bioscience 公司；蘭尼堿受體2（ryanodine receptor 2，RYR2）抗體（批號(hào)1016750-2）、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體（批號(hào)1009562-8）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)1003067-1）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)1002634-1）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；蘇木素（批號(hào)H9627）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；伊紅水溶液（批號(hào)71014544）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；Masson 染色試劑盒（批號(hào)BA4079）購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)037E2220IA）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RIPA 裂解液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司；β-actin 抗體（批號(hào)F180047）購(gòu)自Abways Technology 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號(hào)SA00001-2）、HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（批號(hào)SA00001-1）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

RM6240 型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；DS-Fi3 型生物顯微鏡（上海尼康精機(jī)有限公司）；DYCZ-40 型電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）；MQX200 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

60 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及穩(wěn)心顆粒低、中、高劑量（1.34、2.68、5.36 g/kg，分別相當(dāng)于臨床等效劑量的1、2、4 倍）組和胺碘酮（35.7 mg/kg）組，每組10 只。穩(wěn)心顆粒溶于純凈水中，以超聲振蕩器制備成質(zhì)量濃度分別為0.134、0.268、0.536 g/mL 的藥液。鹽酸胺碘酮片用研缽搗成粉末狀，并用電子天平稱(chēng)取藥粉溶于純凈水中，以超聲振蕩器制成質(zhì)量濃度為3.57 mg/mL 的藥液。各給藥組ig 相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig 等體積純水，1 次/d，連續(xù)21 d。

末次給藥1 h 后，稱(chēng)定大鼠質(zhì)量，ip 20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉，采用多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)觀察并采集標(biāo)準(zhǔn)II 導(dǎo)聯(lián)心電圖數(shù)據(jù)。記錄正常心電圖20 min 后，基線調(diào)零。待心電圖平穩(wěn)后，用1 mL 注射器抽取0.002%的烏頭堿溶液（2 mL/kg），根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)研究[13]，尾iv 烏頭堿（40 μg/kg）構(gòu)建心律失常模型，當(dāng)大鼠心電圖出現(xiàn)室性期前收縮、室性心動(dòng)過(guò)速等波形，即視為造模成功，記錄心律失常出現(xiàn)及恢復(fù)的時(shí)間，心律恢復(fù)正常后再記錄20 min 心電圖。若造模期間出現(xiàn)大鼠死亡，則停止記錄。對(duì)照組大鼠尾iv 生理鹽水（2 mL/kg）。

2.2 心電圖觀察及記錄

采用多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)連續(xù)記錄尾iv烏頭堿前后的大鼠心電圖，觀察室性期前收縮（premature ventricular contraction，PVC）、室性心動(dòng)過(guò)速（ventricular tachycardia，VT）、心室撲動(dòng)（ventricular flutter，VFl）及心室顫動(dòng)（ventricular fibrillation，VF）等異常心電發(fā)生情況。觀察并記錄大鼠心律失常的發(fā)生及持續(xù)時(shí)間，當(dāng)心電表現(xiàn)恢復(fù)正常時(shí)，再記錄20 min 心電圖，若無(wú)異常則視為成功復(fù)律；最長(zhǎng)觀測(cè)2 h 心電圖變化，若仍為異常心電表現(xiàn)，則視為未能復(fù)律；同時(shí)根據(jù)心電表現(xiàn)進(jìn)行心律失常評(píng)分。評(píng)分以Lambeth 會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)為參考，具體如下：0 分，無(wú)心律失?；蛏儆? 次室早；1 分，不少于5 次室早；2 分，室速持續(xù)時(shí)間少于60 s；3分，室速持續(xù)時(shí)間少于60 s 或多陣室速累計(jì)時(shí)間少于60 s；4 分，多陣室速且總持續(xù)時(shí)間不少于60 s或偶發(fā)室顫；5 分，持續(xù)性室顫或死亡[12,14-15]。

2.3 大鼠心肌組織病理觀察

大鼠脫頸處死后，開(kāi)胸取出心臟，以生理鹽水沖洗干凈，取適量心肌組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，以梯度乙醇對(duì)組織進(jìn)行脫水處理，常規(guī)進(jìn)行組織透明、浸蠟、包埋、切片和烤片、脫蠟等步驟后，進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，Masson 染色以觀察心肌組織的纖維化改變。

2.4 大鼠血清中氧化應(yīng)激和炎癥因子相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

大鼠于麻醉狀態(tài)下行腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心15 min，取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD活性及MDA、GSH、IL-18、IL-1β、TNF-α 水平。

2.5 大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)

取各組大鼠心肌組織，固定、包埋及切片后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL、DPAI 雙染色，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，組織切片上凋亡的細(xì)胞呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。

細(xì)胞凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)

2.6 心肌組織RYR2、NLRP3、TLR4、Bcl-2 和Bax蛋白表達(dá)的檢測(cè)

取各組大鼠心肌組織置于RIPA 裂解液中研磨，直至看不見(jiàn)明顯塊狀，12 000 r/min 離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，采用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液進(jìn)行沸水浴使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌5 次，5 min/次；加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗滌5 次，顯色曝光并拍照，用ipp軟件分析膠片灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)組間各樣本量參數(shù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布，則數(shù)據(jù)以±s進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)，采用Lev-enes Test 判斷方差齊性，若符合方差齊性則采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間比較，事后比較采用LSD檢驗(yàn)；若方差不齊時(shí)，采用Tamhane’sT2法進(jìn)行兩兩比較。若不符合正態(tài)分布，則數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)，組間比較采用獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 穩(wěn)心顆粒對(duì)心律失常大鼠心電圖的影響

3.1.1 各組大鼠心律失常出現(xiàn)及持續(xù)時(shí)間 對(duì)照組大鼠在監(jiān)測(cè)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)明顯心電異常表現(xiàn)，模型組大鼠在尾iv 烏頭堿后，心電圖可見(jiàn)明顯的PVC、VT 等心律失常表現(xiàn)，提示心律失常大鼠模型復(fù)制成功。各給藥組大鼠在尾iv 烏頭堿后亦出現(xiàn)PVC、VT 等心律失常表現(xiàn)，其中胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒中、高劑量組均能有效縮短大鼠心律失常持續(xù)時(shí)間（P＜0.05、0.01，表1）；各組大鼠在尾iv 烏頭堿后，心律失常開(kāi)始出現(xiàn)的時(shí)間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠心律失常出現(xiàn)及持續(xù)時(shí)間Table 1 Occurrence and duration of arrhythmia of rats in each group

3.1.2 各組大鼠心律失常評(píng)分 如圖1 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)持續(xù)性室速、室顫等異常心電情況明顯增多，心律失常評(píng)分大幅增加（P＜0.01），進(jìn)一步提示模型復(fù)制成功；與模型組比較，胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒中、高劑量組大鼠心律失常評(píng)分明顯降低（P＜0.05、0.01），穩(wěn)心顆粒低劑量組心律失常評(píng)分無(wú)顯著變化，提示穩(wěn)心顆粒具有明確的抗心律失常作用，且其作用呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。

圖1 各組大鼠心律失常評(píng)分 (±s, n = 10)Fig.1 Arrhythmia score of rats in each group(±s, n = 10)

3.1.3 典型心電圖表現(xiàn) 各組大鼠在尾iv 烏頭堿之前，心電圖均無(wú)明顯異常；在尾iv 烏頭堿后，均不同程度出現(xiàn)各種類(lèi)型的心律失常，圖2 所示的心電表現(xiàn)各組均有出現(xiàn)，其中最常見(jiàn)的是各類(lèi)室性期前收縮，包括單發(fā)室早、多源性室早、二聯(lián)律等；其次為室性心動(dòng)過(guò)速，包括短陣室速和持續(xù)性室速；此外，室撲與室顫也有出現(xiàn)，大部分出現(xiàn)持續(xù)性室染色均勻，未見(jiàn)明顯心肌細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組心肌組織結(jié)構(gòu)破壞，心肌細(xì)胞層次及輪廓模糊，心肌纖維排列紊亂伴腫脹和斷裂，可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及散在小灶性及條索狀變性、壞死。胺碘酮和穩(wěn)心顆粒中、高劑量干預(yù)后，可減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，染色結(jié)果顯示心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，但穩(wěn)心顆粒低劑量組心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)欠佳，心肌纖維排列紊亂伴斷裂，可見(jiàn)散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 各種類(lèi)型心電表現(xiàn)Fig.2 Various types of ECG manifestations

圖3 各組大鼠心肌組織HE 染色 (×200)Fig.3 HE staining of myocardial tissue in each group of rats (× 200)

Masson 染色結(jié)果如圖4 所示，對(duì)照組心肌組織顫的大鼠最后均死亡（模型組死亡3 只，胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒中、高劑量組各死亡1 只）。

圖4 各組大鼠心肌組織Masson 染色 (×200)Fig.4 Masson staining of myocardial tissue in each group of rats (× 200)

3.2 穩(wěn)心顆粒對(duì)心律失常大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)的影響

HE 染色結(jié)果如圖3 所示，采用高倍光鏡觀察各組大鼠心肌組織HE 染色后所示的病理情況，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、肌纖維呈紅色。其中，對(duì)照組心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，心肌細(xì)胞排列緊密、層次清晰，胞核與胞質(zhì)邊緣分明，心肌細(xì)胞胞質(zhì)、核染色均勻，心肌肌束排列均勻。模型組心肌組織著色較淺而不均，心肌組織排列紊亂，心肌肌束可見(jiàn)一定程度的增寬，細(xì)胞間質(zhì)可見(jiàn)較多的藍(lán)色膠原纖維沉積。各給藥組心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善，膠原纖維沉積有一定減少，其中以胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒高劑量組效果最為明顯。

3.3 穩(wěn)心顆粒對(duì)心律失常大鼠離子通道蛋白R(shí)YR2 表達(dá)的影響

如圖5 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織RYR2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組RYR2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），其中胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒高劑量組RYR2 蛋白表達(dá)水平更趨向于對(duì)照組。根據(jù)大鼠心電和離子通道蛋白R(shí)YR2 的表達(dá)改變，并結(jié)合心肌組織病理情況，提示心律失常模型復(fù)制成功，且藥物干預(yù)確有療效。

圖5 各組大鼠心肌組織RYR2 蛋白表達(dá) (±s, n = 6)Fig.5 RYR2 protein expression in myocardial tissue of rats in each group (±s, n = 6)

3.4 穩(wěn)心顆粒對(duì)心律失常大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

如表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中SOD 活性顯著降低（P＜0.01），MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒高劑量組大鼠血清中SOD 活性明顯升高（P＜0.01），MDA 水平顯著降低（P＜0.05）；穩(wěn)心顆粒中劑量組有升高SOD、降低MDA 含量的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清中GSH 水平結(jié)果顯示，模型組較對(duì)照組減少，且經(jīng)過(guò)胺碘酮或穩(wěn)心顆粒干預(yù)后有升高趨勢(shì)，但各組間含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 各組大鼠血清中SOD 活性及MDA、GSH 水平 (±s, n = 10)Table 2 SOD activity and MDA, GSH levels in serum of rats in each group (±s, n = 10)

表2 各組大鼠血清中SOD 活性及MDA、GSH 水平 (±s, n = 10)Table 2 SOD activity and MDA, GSH levels in serum of rats in each group (±s, n = 10)

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，表3 同。**P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as below Table 3.

組別 劑量/(g·kg?1) SOD/(ng·mL?1) MDA/(nmol·L?1) GSH/(ng·L?1)對(duì)照 — 132.85±10.46 2.16±0.38 317.57±22.89模型 — 116.70±8.43** 2.65±0.38** 296.57±60.92穩(wěn)心顆粒 1.34 119.29±12.10 2.68±0.26 302.85±29.77 2.68 123.98±5.83 2.55±0.28 305.85±24.38 5.36 129.95±7.57## 2.27±0.29# 310.22±26.28胺碘酮 0.035 7 128.57±7.88## 2.31±0.23# 306.95±20.18

3.5 穩(wěn)心顆粒對(duì)心律失常大鼠血清炎癥因子水平的影響

如表3 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α 水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒高劑量組大鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α 水平均明顯降低（P＜0.05、0.01）；穩(wěn)心顆粒低、中劑量組有一定的降低血清中IL-18、IL-1β、TNF-α 水平的趨勢(shì)，但其含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組大鼠血清中炎性因子水平 (±s, n = 10)Table 3 Levels of inflammatory factors in serum of rats in each group (±s, n = 10)

表3 各組大鼠血清中炎性因子水平 (±s, n = 10)Table 3 Levels of inflammatory factors in serum of rats in each group (±s, n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) IL-18/(ng·L?1) IL-1β/(ng·L?1) TNF-α/(ng·L?1)對(duì)照 — 88.42±5.03 52.15±3.02 152.63±13.28模型 — 100.96±6.48** 59.95±3.85** 206.20±10.10**穩(wěn)心顆粒 1.34 96.29±9.33 56.17±3.30 198.18±19.24 2.68 94.93±3.94 56.22±3.48 189.25±28.26 5.36 94.02±5.64# 54.00±3.81## 173.02±19.97#胺碘酮 0.035 7 93.35±7.94# 52.79±5.98## 173.54±31.04#

3.6 穩(wěn)心顆粒對(duì)心律失常大鼠心肌組織NLRP3、TLR4 蛋白表達(dá)的影響

如圖6 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織NLRP3、TLR4 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒中、高劑量組大鼠心肌組織NLRP3、TLR4 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），穩(wěn)心顆粒低劑量組TLR4 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。

3.7 穩(wěn)心顆粒對(duì)心律失常大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

如圖7 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后，大鼠心肌細(xì)胞凋亡率均有不同程度的降低，且穩(wěn)心顆粒各組表現(xiàn)出劑量相關(guān)性療效，其中胺碘酮組、穩(wěn)心顆粒高劑量組與模型組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、0.01）。

圖7 各組大鼠心肌組織TUNEL 染色 (±s, n = 6)Fig.7 TUNEL staining of myocardial tissue of rats in each group (±s, n = 6)

如圖8 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織Bax 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），Bax/Bcl-2 值顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒中、高劑量組大鼠心肌組織Bax 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），各給藥組大鼠心肌組織Bax/Bcl-2 值顯著降低（P＜0.01）。表明穩(wěn)心顆粒可抑制心律失常大鼠心肌細(xì)胞凋亡，與TUNEL 染色結(jié)果一致。

圖8 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá) (±s, n = 6)Fig.8 Bax and Bcl-2 protein expressions in myocardium of rats in each group (±s, n = 6)

4 討論

4.1 穩(wěn)心顆粒防治心律失常效果顯著

穩(wěn)心顆粒收載于《中國(guó)藥典》2020 年版、《國(guó)家基本藥物目錄》《國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)、工傷保險(xiǎn)和生育保險(xiǎn)藥品目錄》，傳承了炙甘草湯補(bǔ)益氣陰、陰陽(yáng)兼顧的組方原則，由現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及藥理學(xué)等技術(shù)與臨床經(jīng)驗(yàn)方相結(jié)合研制而成。其由黨參、黃精、三七、琥珀、甘松5 味中藥組成，黨參、黃精性甘平，補(bǔ)脾氣而潤(rùn)心肺，相佐以益氣生血；三七、琥珀活血化瘀而安神定痛；再以甘松之甘溫，開(kāi)郁散滯，氣血得以兼行。全方君臣佐使相得益彰，益氣活血、補(bǔ)而不滯，共奏益氣養(yǎng)陰、定悸復(fù)脈、活血化瘀之功，氣血暢行而心悸自止。

穩(wěn)心顆?？梢栽黾庸跔顒?dòng)脈血流量，減少心肌耗氧量，增強(qiáng)心肌順應(yīng)性，改善心肌耐缺氧能力，減輕心臟前后負(fù)荷，減少心律失常的發(fā)生[16]。尤其是在防治心律失常方面，穩(wěn)心顆粒發(fā)揮著重要作用。研究表明，穩(wěn)心顆?？梢詼p少心室顫動(dòng)的發(fā)生率和室性心動(dòng)過(guò)速發(fā)作的次數(shù)，改善心律失常的嚴(yán)重程度[17]。在離體豚鼠心臟模型中，奎尼丁快速灌注可改變心率并延長(zhǎng)Q-T 間期，而穩(wěn)心顆粒預(yù)處理可顯著縮短QRS 和Q-T 間期以改善心電表現(xiàn)[18-19]。此外，穩(wěn)心顆粒還通過(guò)降低炎癥因子及下調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)而表現(xiàn)出抗炎特性[20]。如黨參多糖可有效抑制巨噬細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）炎癥信號(hào)通路的激活，并可顯著下調(diào)炎性細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β 的分泌[21]；黨參弱極性部分中三萜及甾醇類(lèi)化合物在抗炎中起到重要作用[22]；人參皂苷Rg1通過(guò)抑制過(guò)氧化體增殖物激活型受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來(lái)改善大鼠心肌缺血再灌注后心律失常[23]；人參皂苷Rg1及三七總皂苷能抑制多種炎癥因子的分泌，減輕心肌缺血再灌注損傷[24]；三七皂苷R1有助于減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低缺血/再灌注損傷引起的心律失常[25]；三七多糖可以降低炎癥因子水平[26]；黃精多糖可通過(guò)調(diào)控RAW264.7 細(xì)胞TNF-α/IL-6/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）信號(hào)通路的表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[27]。本研究結(jié)果顯示，穩(wěn)心顆?？梢杂行Эs短大鼠心律失常持續(xù)時(shí)間、降低心律失常評(píng)分，顯著改善心電圖表現(xiàn)，具有明確的抗心律失常作用，基于現(xiàn)有研究所顯示穩(wěn)心顆粒的抗炎特性，從凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激的角度探索其抗心律失常機(jī)制，對(duì)于穩(wěn)心顆粒的臨床運(yùn)用及心律失常的防治均具有重要意義。

4.2 抑制凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激可能是穩(wěn)心顆粒抗心律失常的重要機(jī)制

胺碘酮抗心律失常譜廣，臨床運(yùn)用廣泛，且許多研究顯示其在抑制凋亡[28-29]、抗氧化應(yīng)激[28,30-31]及減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)[30,32]方面具有一定的作用，故以此作為本研究的陽(yáng)性對(duì)照藥。

氧化應(yīng)激是指當(dāng)身體在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化物，包括ROS 和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）超過(guò)身體細(xì)胞的內(nèi)源或外源抗氧化物的結(jié)果。炎癥和氧化應(yīng)激是互相影響的，且越來(lái)越多的研究表明炎癥和氧化應(yīng)激與心血管疾病是因果關(guān)系[33-34]。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，常用來(lái)反映脂質(zhì)過(guò)氧化水平，是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。SOD 是一種重要的抗氧化酶，能使氧自由基產(chǎn)生歧化反應(yīng)，生成氧分子和過(guò)氧化氫分子。本研究結(jié)果顯示，穩(wěn)心顆粒干預(yù)后能有效升高SOD 活性、降低MDA 含量，提示其具有一定的抗氧化應(yīng)激作用。SOD 減少將導(dǎo)致氧化應(yīng)激升高，使線粒體中ROS 生成和抗氧化能力失衡，最終導(dǎo)致線粒體氧化損傷。當(dāng)線粒體功能受損后，線粒體中ROS 水平會(huì)增加，對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性也會(huì)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致炎癥出現(xiàn)及凋亡異常，同時(shí)NLRP3 炎癥小體也會(huì)由此而被激活。NLRP3 炎癥小體是目前研究最充分的炎癥小體之一，并已被證明可以促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究中，與模型組比較，穩(wěn)心顆粒中、高劑量組能顯著降低心肌組織NLRP3 蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明穩(wěn)心顆?？梢杂行Ы档脱趸瘧?yīng)激水平、減輕炎癥反應(yīng)。當(dāng)NLRP3 炎性小體啟動(dòng)后，又會(huì)促使致炎癥細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 的大量分泌。IL-1β 在介導(dǎo)免疫反應(yīng)以及刺激巨噬細(xì)胞增加炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)方面發(fā)揮作用；IL-18 能調(diào)節(jié)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)；TNF-α 可誘導(dǎo)炎癥和各種細(xì)胞因子的釋放。本研究中，胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒高劑量組均能有效降低血清中IL-18、IL-1β 和TNF-α 水平，與Western blotting 結(jié)果所示的NLRP3表達(dá)降低相印證。TLR4 是TLR 家族的成員，該家族在病原體識(shí)別和先天免疫激活中起著基本作用，同時(shí)TLR4 的激活也會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)NLRP3 的表達(dá)。研究表明，TLR4 可與髓樣分化蛋白88 結(jié)合，激活胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)NF-κB、JNK 等多種轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)參與細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等生理過(guò)程[35]。本研究結(jié)果顯示，穩(wěn)心顆粒各劑量組均可不同程度地降低TLR4 表達(dá)水平，在炎癥及凋亡的上游水平發(fā)揮了其抑制作用。

凋亡又稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡，在此過(guò)程中機(jī)體能清除衰老及異常細(xì)胞，并在維持很多細(xì)胞功能方面有重要作用，但是因各種原因?qū)е碌牡蛲霎惓t會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡并可能引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。促凋亡和抑制凋亡2 類(lèi)最典型的蛋白分別是Bax 和Bcl-2，Bax/Bcl-2 的比值被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的可靠指標(biāo)。本研究中模型組Bax/Bcl-2 值顯著升高；胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒高劑量組Bax/Bcl-2 值低，趨向于對(duì)照組的表達(dá)情況，提示凋亡情況降低。TUNEL 染色顯示模型組凋亡水平升高，胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒高劑量組能明顯降低凋亡水平，接近于對(duì)照組，與Western blotting 結(jié)果一致。異常的心肌細(xì)胞凋亡也會(huì)在一定程度上促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。心臟纖維化是心臟對(duì)多種損傷的常見(jiàn)反應(yīng)，在心臟纖維化過(guò)程中，過(guò)多的膠原沉積和細(xì)胞外基質(zhì)的堆積導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降，電傳導(dǎo)也受到影響，進(jìn)一步導(dǎo)致心律失常[36]，并且纖維化發(fā)生會(huì)誘導(dǎo)更多的炎癥因子釋放，會(huì)進(jìn)一步加重纖維化的過(guò)程[37]。在本研究中，包括模型組在內(nèi)的各組大鼠Masson 染色所示的心肌纖維化程度總體而言不高，這可能與心律失常大鼠的急性造模方式有關(guān)，心肌組織無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)大量纖維化病變。但相對(duì)而言，模型組心肌排列紊亂，纖維化范圍增多；胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒高劑量組能在一定程度上減輕心肌纖維化程度。

現(xiàn)有的許多關(guān)于穩(wěn)心顆粒作用機(jī)制的研究，亦關(guān)注了凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激等方面[38]，但多為側(cè)重某一方面，本研究不僅關(guān)注了這3 方面的病理變化，更是將三者進(jìn)行了病理串話。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激發(fā)機(jī)體防御性炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生更多炎癥因子；炎癥因子又促進(jìn)氧自由基的大量產(chǎn)生[39-40]。氧化應(yīng)激與凋亡、炎癥反應(yīng)等不是簡(jiǎn)單的先后發(fā)生關(guān)系，而是互相影響進(jìn)而形成惡性循環(huán)，逐漸加劇心肌細(xì)胞損傷，導(dǎo)致心肌組織結(jié)構(gòu)損壞及電信號(hào)傳導(dǎo)異常。而穩(wěn)心顆?？梢种菩募〖?xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，打破三者所串?dāng)_的連鎖反應(yīng)，緩解心肌細(xì)胞和組織的病理?yè)p傷，以發(fā)揮其抗心律失常作用。穩(wěn)心顆?，F(xiàn)不僅用于心律失常，還用于冠心病、心力衰竭等多種心血管疾病。凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激是包括心血管疾病在內(nèi)的多種疾病的基本病理改變，對(duì)穩(wěn)心顆粒該方面的機(jī)制探索，乃是追本溯源之舉，亦符合中醫(yī)“異病同治”的理念。本研究中，穩(wěn)心顆粒的作用也呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，高劑量組療效最好，中劑量組對(duì)部分指標(biāo)也有一定的改善作用，未來(lái)還需對(duì)穩(wěn)心顆粒使用的最佳劑量進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突