李藝穎，初英杰#，孔令東，謝 芳，何昱廷，劉 霞，李俊良，羅 政，周義翔，王 遙*

1.北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 100029

2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029

土木香是菊科植物土木香InulaheleniumL.的干燥根，為蒙醫(yī)常用清熱類藥，收錄于《中國藥典》2020 年版、《本草綱目拾遺》等[1]，其味苦、甘、辛，性平，具有解巴達干熱、清赫依血相訌、開胃止痛、溫中消食的功效，并作為多種蒙藥復方中主藥，用于瘟疫熱癥的治療。如四味土木香散為治療瘟病熱癥的經(jīng)典方和基礎(chǔ)方，于1977 年被載入《中國藥典》[2-5]。該方清瘟解表，用于瘟病初期發(fā)冷發(fā)熱、頭痛咳嗽、咽喉腫痛的治療。土木香內(nèi)酯是從土木香中提取出的倍半萜烯內(nèi)酯類小分子化合物，是《中國藥典》2020 年版中規(guī)定的土木香主要的藥效和質(zhì)量評價成分，分子式為C15H20O2?，F(xiàn)代藥理學研究表明，土木香內(nèi)酯對細菌、真菌具有明顯的抵抗活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌具有較佳的抑菌作用；土木香內(nèi)酯能夠通過抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路發(fā)揮抗炎功能。然而，作為土木香主要活性成分的土木香內(nèi)酯，對其臨床相關(guān)的抗病毒感染作用與機制的研究仍未見報道，很大程度上限制了土木香及其活性成分藥用價值的提升。

抗病毒天然免疫反應是宿主抵御病毒入侵的第一道防線[6]。病毒釋放基因組進入細胞質(zhì)，宿主細胞通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別并結(jié)合病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），將病毒入侵信號傳給接頭蛋白（MAVS/STING），進而激活轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和IRF7 轉(zhuǎn)位入核，啟動I 型干擾素（type I interferon，IFN-I）的轉(zhuǎn)錄和表達。環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-STING 信號軸由第二信使cGAS 和干擾素基因STING 的環(huán)鳥苷酸-腺苷酸受體刺激物組成，可檢測致病DNA，以觸發(fā)先天免疫反應，涉及針對微生物感染的強IFN-I 反應[7]。在細胞質(zhì)中，視黃酸誘導基因-I 樣受體（retinoic acid-inducible gene I-like receptor，RLR）、視黃酸誘導基因-I（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）和黑色素瘤分化相關(guān)基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）感知與病毒感染相關(guān)的非典型RNA[8-9]，通過接頭分子MAVS觸發(fā)信號級聯(lián)反應，翻譯產(chǎn)生IFN-I，干擾素分泌到細胞外，與細胞膜表面的干擾素受體[I 型干擾素受體1（type I interferon receptor 1，IFNAR1）、I 型干擾素受體2（type I interferon receptor 2，IFNAR2）]結(jié)合，激活JAK 激酶（Janus kinase，JAK）-信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路，并誘導大量干擾素刺激基因（interferon stimulated genes，ISGs）表達，這些ISGs 可在病毒生命周期的各個階段包括入侵、復制、裝配和釋放發(fā)揮廣泛的抗病毒作用[10]。

本研究通過構(gòu)建多種病毒感染的細胞模型，發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯對水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、甲型流感病毒（influenza A virus，H1N1）、腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）等病毒復制的體外抑制作用。此外，通過構(gòu)建小鼠H1N1 病毒滴鼻感染模型，發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯能夠提高感染小鼠的存活率，降低肺組織中H1N1 的病毒載量。本研究利用分子生物學及免疫學研究手段，初步闡明土木香內(nèi)酯通過活化抗病毒天然免疫信號通路抵抗病毒復制的免疫藥理機制。為土木香及蒙藥四味土木香散的抗病毒臨床應用提供了重要的科學數(shù)據(jù)支撐，為相關(guān)藥物未來的科學開發(fā)打下了堅實的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細胞與病毒

人肺上皮細胞系A(chǔ)549 細胞購自美國ATCC 公司；IFNAR1 敲除A549 細胞（Ifnar1?/?A549）由本實驗室構(gòu)建[11]；小鼠原代成纖維MEF 細胞來源于本實驗室凍存；VSV（印第安納株）、VSV-GFP、H1N1（PR8 株）、EMCV 均來自本實驗室，病毒擴增后置于?80 ℃保存。

1.2 動物

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，6～8 周，體質(zhì)量18～20 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證SCXK（京）2019-0010。動物于室溫（23±2）℃、相對濕度40%～70%、晝夜交替照明的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號BUCM-2023120501-4152）。

1.3 藥品與試劑

土木香內(nèi)酯（質(zhì)量分數(shù)≥98.0%，批號PS1852-0025）購自成都普思生物科技股份有限公司；達菲?磷酸奧司他韋膠囊（以奧司他韋計75 mg/粒，批號0221906016）購自宜昌長江藥業(yè)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號D4540）購自美國Sigma 公司；IFN 刺激性DNA（interferon stimulatory DNA，ISD，批號tlrl-isdn）、聚乙烯亞胺（PEI，批號 BMS1003-A）、Trizol 試劑（批號15596018）均購自美國Invitrogen 公司；Evo M-MLV RT Kit（批號AG11711）、SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（批號AG11701）購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號C11995500CP）、青霉素-鏈霉素（10 000 U/mL，批號15140-122）、胎牛血清（批號2358184P）購自美國Gibco 公司；0.25%胰蛋白酶/EDTA 細胞消化液（批號T1300）購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 細胞增殖-毒性檢測試劑盒（批號CK04）購自東仁化學科技（上海）有限公司；VSV-G tag 重組抗體（ 批號 ab183497 ）、H1N1 Influenza A virus Nucleocapsid protein（H1N1-NP）抗體（批號104870）購自英國Abcam 公司；超敏ELC 發(fā)光液（批號WBKLS0500）購自美國Millipore 公司；HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗（批號M21002）購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司。

1.4 儀器

CytoFLEX 流式細胞儀（美國Beckman 公司）；CFX96 型熒光定量PCR 儀、T100 型PCR 儀、PowerPac 型基礎(chǔ)電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；NANODROP ONEc 型分光光度計、Sorvall?Legend?Micro 21R 型微量離心機、300 Series A2 型生物安全柜、Heracell 150i 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；SpectraMax i3x 型多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；Mill-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；ZHCH-C1115B 型超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；SKL180-Pro 型數(shù)控線性搖床[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司]；EPS-300 型數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（天能公司）；SCl-VS 型可調(diào)式混勻儀（美國Scilogex 公司）；1CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 藥物的配制

取土木香內(nèi)酯25 mg，加入1.076 1 mL DMSO，充分振蕩，37 ℃超聲60 min 后即為100 mmol/L 母液，分裝后儲存于?80 ℃?zhèn)溆?。根?jù)具體使用濃度計算所需母液體積，按照一定比例用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋至使用濃度，充分渦旋振蕩后，加入細胞使用。

2.2 細胞活力測定

A549細胞以每孔2.5×104個的密度接種于96孔板，培養(yǎng)過夜使細胞完全貼壁；配制0.078 125、0.156 250、0.312 500、0.625 000、1.250 000、2.500 000、5.000 000、10.000 000、20.000 000、40.000 000、80.000 000 μmol/L 的土木香內(nèi)酯溶液加入細胞中，同時設(shè)置僅加入DMEM 的空白組（不含細胞）和0.1% DMSO溶劑對照組（含細胞），每孔設(shè)置3 個復孔，于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑孵育30 min，使用酶標儀測定450 nm 處吸光度（A）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A對照－A空白)

2.3 流式細胞術(shù)檢測土木香內(nèi)酯對A549 細胞中VSV-GFP 病毒復制的影響

A549 細胞以每孔1.2×105個密度接種于24 孔板，培養(yǎng)過夜至細胞貼壁后，設(shè)置對照組、模型組和土木香內(nèi)酯（5、10、20 μmol/L）組，除對照組外，VSV-GFP 以 0.05 的感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）感染各組細胞[11]，同時加藥共同孵育，對照組和模型組加入DMSO。孵育12 h 后用預冷PBS 清洗細胞2 次，加入100 μL 胰酶消化，收集細胞至流式管，采用流式細胞儀上機檢測GFP 陽性細胞比例。

2.4 熒光顯微鏡檢測土木香內(nèi)酯對A549 細胞中VSV-GFP 病毒復制的影響

細胞接種、分組同“2.3”項，除對照組外，VSVGFP 以MOI＝0.1 感染各組細胞[11]，同時加藥共同孵育，對照組和模型組加入DMSO。孵育24 h 后，采用熒光顯微鏡檢測土木香內(nèi)酯對VSV-GFP 的抑制作用。

2.5 qRT-PCR 檢測土木香內(nèi)酯對EMCV、H1N1 病毒mRNA 表達的影響

細胞接種、分組同“2.3”項，分別使用H1N1（MOI＝0.05）、EMCV（MOI＝3）感染細胞[11]，同時加藥共同孵育。共同孵育12 h 后，收集細胞，加入Trizol 試劑提取總RNA 并合成cDNA，進行qRT-PCR分析，檢測病毒基因的表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.6 Western blotting 檢測土木香內(nèi)酯對VSV-G 和H1N1-NP 蛋白表達的影響

收集不同濃度（5、10、20 μmol/L）土木香內(nèi)酯和不同時間（0、8、12、16 h）處理后的病毒感染細胞蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后，分別加入VSV-G 抗體（1∶3 000）和H1N1-NP 抗體（1∶1 500），4 ℃孵育過夜；室溫孵育二抗（1∶5 000），加入ECL 化學發(fā)光試劑，于凝膠成像儀中曝光顯影。

2.7 土木香內(nèi)酯對VSV-GFP、H1N1 和EMCV 病毒復制周期的影響

細胞接種同“2.3”項，過夜培養(yǎng)后，設(shè)置對照組、模型組和土木香內(nèi)酯（5、10、20 μmol/L）組。土木香內(nèi)酯使用病毒感染前預處理12 h、病毒吸附2 h 過程中、病毒吸附后3 種不同方式給藥，加入VSV-GFP（MOI＝0.05）或H1N1（MOI＝0.05）或EMCV（MOI＝3）感染12 h，通過流式細胞術(shù)檢測土木香內(nèi)酯對VSV-GFP 病毒復制的影響，通過qRTPCR 檢測土木香內(nèi)酯對EMCV、H1N1 病毒復制的影響。

2.8 RNA 測序及轉(zhuǎn)錄組學分析

MEF 細胞接種于12 孔板，培養(yǎng)過夜后，加入DMSO（對照組）或20 μmol/L 土木香內(nèi)酯處理12 h，收集細胞，加入Trizol 試劑提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 進行測序。使用 Hieff NGS Ultima Dualmode mRNA Library Prep Kit for Illumina（Yeasen Biotechnology Co.，Ltd.）產(chǎn)生測序文庫。文庫在Illumina NovaSeq 平臺上測序，產(chǎn)生150 bp 的成對端讀數(shù)。使用Hisat2 工具軟件與參考基因組進行映射，并獲得每個樣本中基因的原始表達值。使用edgeR 進行差異表達分析，錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05 且|log2FC|＞1 的基因被認為是差異表達基因。

2.9 qRT-PCR 檢測土木香內(nèi)酯對ISGs mRNA 表達的影響

MEF 細胞以每孔1×105個的密度接種于12 孔板，培養(yǎng)過夜后，加入DMSO（對照組）或5、10、20 μmol/L 土木香內(nèi)酯處理12 h，收集細胞，加入Trizol 試劑提取總RNA 并合成cDNA，進行qRTPCR 分析，檢測干擾素α1（interferon α1，Ifna1）、干擾素β1（interferon β1，Ifnb1）、干擾素誘導蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，Ifit1）、Isg15的mRNA 表達。引物序列見表1。

2.10 土木香內(nèi)酯對Ifnar1?/? A549 細胞中VSVGFP、H1N1、EMCV 病毒復制的影響

A549 細胞和Ifnar1?/?A549 細胞分別以每孔1.2×105個密度接種于24 孔板，培養(yǎng)過夜至細胞貼壁后，設(shè)置對照組、模型組和土木香內(nèi)酯（5、10、20 μmol/L）組，使用VSV（MOI＝0.05）、EMCV（MOI＝3）、H1N1（MOI＝0.05）感染細胞[11]，同時加藥共同孵育。共同孵育12 h 后，通過流式細胞術(shù)檢測A549 細胞和Ifnar1?/?A549 細胞中給予土木香內(nèi)酯對GFP 陽性細胞比率的影響，或者通過qRTPCR 檢測這2 種細胞中給予土木香內(nèi)酯對H1N1 和EMCV 病毒復制的影響。

2.11 土木香內(nèi)酯對流感病毒感染小鼠的保護作用

將小鼠隨機分為對照組、模型組、土木香內(nèi)酯（30 mg/kg）組和磷酸奧司他韋膠囊（40 mg/kg）組，每組10 只。小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，除對照組外，其余小鼠于實驗第0 天滴鼻接種H1N1 病毒（50 μL/只）建立流感病毒感染小鼠模型。各給藥組ig 相應藥物，對照組和模型組ig 生理鹽水，1 次/d，連續(xù)14 d。給藥組小鼠第7 天每組隨機選取5 只小鼠處死，采集小鼠肺組織，經(jīng)Trizol 法提取總RNA，qRT-PCR檢測肺組織中H1N1的mRNA 表達水平。統(tǒng)計各組剩余小鼠存活天數(shù)及死亡數(shù)，計算存活率。

2.12 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 軟件進行可視化處理，以±s表示，兩組樣本間通過雙尾非配對t檢驗進行比較，多組樣本間通過單因素方差分析進行比較。

3 結(jié)果

3.1 土木香內(nèi)酯對A549 細胞存活率的影響

通過CCK-8 法檢測不同濃度的土木香內(nèi)酯處理24 h 后，對A549 細胞存活率的影響，計算得到半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為79.63 μmol/L（圖1）。后續(xù)選取無明顯細胞毒性的低、中、高濃度（5、10、20 μmol/L）進行實驗。

圖1 土木香內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式 (A) 及其對A549 細胞存活率 (B) 的影響 (±s, n = 3)Fig.1 Structure of alantolactone (A) and its effect on survival rate (B) of A549 cells (±s, n = 3)

3.2 土木香內(nèi)酯對VSV 病毒復制的影響

如圖2-A 所示，與對照組比較，VSV-GFP 感染引起了A549 細胞GFP 陽性細胞比例的增加（P＜0.001）；與模型組比較，土木香內(nèi)酯呈劑量相關(guān)性地減少了GFP 陽性細胞的比例（P＜0.001），尤其在濃度為20 μmol/L 時抑制病毒復制的效果顯著，GFP陽性細胞即被感染細胞的比例降低至5.74%。隨后，使用熒光顯微鏡檢測了土木香內(nèi)酯對VSV-GFP 感染的細胞綠色熒光強度的影響，如圖2-B 所示，與模型組比較，土木香內(nèi)酯可以顯著抑制VSV-GFP 的熒光強度（P＜0.001）；此外，檢測了土木香內(nèi)酯對野生型VSV 的抑制作用，如圖2-C、D 所示，與模型組比較，土木香內(nèi)酯在劑量和時間梯度上降低了VSV-G 蛋白表達。表明土木香內(nèi)酯能夠在細胞水平有效抑制VSV 的復制。

圖2 土木香內(nèi)酯對A549 細胞中VSV 病毒復制的抑制作用 (±s, n = 3)Fig.2 Inhibition of alantolactone on VSV replication in A549 cells (±s, n = 3)

3.3 土木香內(nèi)酯對EMCV、H1N1 病毒復制的影響

為了探究土木香內(nèi)酯對不同病毒的抑制作用，利用EMCV、H1N1 感染A549 細胞，同時加入土木香內(nèi)酯處理12 h。通過qRT-PCR 技術(shù)檢測病毒基因拷貝情況，如圖3-A、B 所示，與對照組比較，模型組病毒基因的拷貝數(shù)均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，土木香內(nèi)酯組病毒基因的拷貝數(shù)均顯著降低（P＜0.001）。如圖3-C 所示，土木香內(nèi)酯在劑量和時間梯度上明顯抑制了H1N1-NP 蛋白表達，表明土木香內(nèi)酯顯著抑制EMCV、H1N1 病毒的復制。

圖3 土木香內(nèi)酯對A549 細胞中H1N1、EMCV 病毒復制的抑制作用 (±s, n = 3)Fig.3 Inhibition of alantolactone on H1N1, EMCV replication in A549 cells (±s, n = 3)

3.4 土木香內(nèi)酯作用于VSV-GFP、EMCV、H1N1病毒復制周期的多個階段

為了探究土木香內(nèi)酯對VSV-GFP、EMCV、H1N1 病毒復制周期不同階段的影響，設(shè)置了不同的加藥方式（圖4-A），分別對細胞進行了預處理、病毒吸附過程中給藥、病毒吸附后給予土木香內(nèi)酯。結(jié)果表明，預處理給予土木香內(nèi)酯處理方式下，與模型組比較，土木香內(nèi)酯預給藥組可以抑制VSVGPF、EMCV、H1N1 病毒復制（P＜0.01、0.001，圖4-B、E、H）；在病毒吸附的過程中給藥時，與模型組比較，病毒復制水平?jīng)]有顯著性變化（圖4-C、F、I）；在病毒吸附后給藥，與模型組比較，土木香內(nèi)酯可以顯著抑制VSV-GPF、EMCV、H1N1 病毒復制（P＜0.01、0.001，圖4-D、G、J）。上述結(jié)果表明，土木香內(nèi)酯對VSV-GFP、EMCV 和H1N1 病毒的吸附過程沒有影響，而預處理或吸附后給藥可以顯著抑制VSV-GFP、EMCV、H1N1 病毒復制。

圖4 土木香內(nèi)酯在病毒復制周期不同階段給藥對VSV-GFP、EMCV、H1N1 病毒復制的影響 (±s, n = 3)Fig.4 Effect of alantolactone administration at different stages of virus replication cycle on VSV-GFP, EMCV, H1N1 virus replication (±s, n = 3)

3.5 土木香內(nèi)酯誘導抗病毒天然免疫信號通路激活

為了探究土木香內(nèi)酯抵抗病毒復制的分子機制，對土木香內(nèi)酯處理的MEF 細胞進行了轉(zhuǎn)錄組學測序分析。如圖5-A 所示，與對照組比較，土木香內(nèi)酯處理誘導了549 個差異表達基因，其中包含367 個上調(diào)基因、182 個下調(diào)基因。值得注意的是，幾種與抗病毒IFN-I 通路相關(guān)的基因被顯著上調(diào)，如Ifna1、Ifnb1、Ifit44、Isg15、Ifit1等。通過對差異基因進行KEGG 通路富集分析，結(jié)果顯示病毒感染和抗病毒天然免疫相關(guān)的通路被顯著富集，主要包括EB 病毒感染、甲流病毒感染和Toll 樣受體信號通路等（圖5-B）。基于基因表達值的GSEA 分析發(fā)現(xiàn)（圖5-C），土木香內(nèi)酯處理組顯著富集到與抗病毒天然免疫反應相關(guān)的IFN-α 信號通路。上述結(jié)果提示，土木香內(nèi)酯可能通過激活細胞內(nèi)的抗病毒天然免疫信號通路，發(fā)揮抗病毒功能。

圖5 土木香內(nèi)酯處理細胞的生物信息學分析 (A)、KEGG 通路分析 (B) 和GSEA (C)Fig.5 Bioinformatics analysis of alantolactone-treated cells (A), KEGG pathway analysis (B) and GSEA (C)

3.6 土木香內(nèi)酯通過激活I(lǐng)FN-I 信號通路發(fā)揮抗病毒作用

藥物處理細胞的生物信息學分析結(jié)果提示，土木香內(nèi)酯的抗病毒功能與宿主抗病毒天然免疫應答的核心信號通路IFN-I 信號通路高度相關(guān)。因此，檢測了土木香內(nèi)酯處理MEF 細胞中ISGs（Ifna1、Ifnb1、Ifit1、Isg15）的表達情況。如圖6 所示，與對照組比較，土木香內(nèi)酯處理顯著誘導Ifna1、Ifnb1、Ifit1、Isg15的mRNA 表達水平升高（P＜0.001）。表明土木香內(nèi)酯單獨藥物處理有效促進IFN-I 的表達，并誘導干擾素誘導基因Ifit1、Isg15等的表達。

圖6 土木香內(nèi)酯對MEF 細胞IFN-I 通路中相關(guān)基因表達的影響 (±s, n = 3)Fig.6 Effect of alantolactone on expressions of related genes in IFN-I pathway of MEF cells (±s, n = 3)

3.7 Ifnar1?/? A549 細胞中土木香內(nèi)酯對病毒復制的影響

IFNAR1 是細胞表面IFN 的重要受體，其與IFN結(jié)合后可激活下游JAK-STAT 信號通路。因此，利用IFNAR1 敲除A549 細胞（Ifnar1?/?A549）探究土木香內(nèi)酯發(fā)揮抗病毒作用與IFN-I 信號通路的依賴關(guān)系。qRT-PCR 結(jié)果顯示，與野生型細胞（A549細胞）相比，在Ifnar1?/?A549 細胞中土木香內(nèi)酯對VSV、EMCV 和H1N1 病毒的抑制功能被顯著削弱。上述結(jié)果表明，土木香內(nèi)酯的抗病毒功能部分依賴IFN-I 信號通路（圖7）。

圖7 土木香內(nèi)酯對Ifnar1?/? A549 細胞中VSV、EMCV、H1N1 病毒復制的影響 (±s, n = 3)Fig.7 Effect of alantolactone on VSV, EMC and H1N1 virus replication in Ifnar1?/? A549 cells (±s, n = 3)

3.8 土木香內(nèi)酯對流感病毒感染小鼠的保護作用

如圖8-A 所示，模型組小鼠在感染后第8 天開始出現(xiàn)死亡，到第10 天全部死亡。而磷酸奧司他韋膠囊組和土木香內(nèi)酯組的生存率分別為60%和80%，表明土木香內(nèi)酯提高流感病毒感染小鼠的生存率。如圖8-B 所示，在病毒感染后第7 天檢測小鼠肺組織流感病毒載量，與模型組比較，土木香內(nèi)酯給藥組小鼠肺臟中H1N1病毒mRNA 表達顯著降低（P＜0.001），表明土木香內(nèi)酯在體內(nèi)抑制流感病毒的復制。

圖8 土木香內(nèi)酯對流感病毒感染小鼠的保護作用 (±s, n = 5)Fig.8 Protective effect of alantolactone on influenza virus-infected mice (±s, n = 5)

4 討論

土木香是菊科植物土木香I.heleniumL.的干燥根，又名黃花菜，始載于《本草圖經(jīng)》，土木香性微溫，味辛苦，無毒，入肺、肝、脾三經(jīng)。有健脾和胃、行氣止痛之效，臨床用于治胸腹脹滿疼痛、嘔吐泄瀉、痢疾、瘧疾等。土木香中主要的化學成分是倍半萜內(nèi)酯類，包括土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、土木香醇、土木香酸、二氫土木香內(nèi)酯等。其中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯是《中國藥典》土木香質(zhì)量評價的對照品成分[12]。土木香內(nèi)酯的藥理作用包括抗菌、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、保肝等[1,13-18]。然而，土木香內(nèi)酯作為土木香中主要藥效和質(zhì)量評價成分，關(guān)于其臨床應用、治療由病毒感染引發(fā)的瘟疫熱癥的藥理作用及機制研究匱乏，限制了土木香及其活性成分藥用價值提升和藥物研發(fā)。

VSV、H1N1 和EMCV 病毒是抗病毒研究中常用的RNA 模式病毒[19-22]，因此本研究利用流式細胞術(shù)、qRT-PCR 等技術(shù)證明了土木香內(nèi)酯可在細胞水平抑制VSV-GFP、H1N1 和EMCV 病毒復制，并發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯預處理和在病毒吸附后處理其抗病毒效應最優(yōu)，這提示土木香內(nèi)酯可能通過影響宿主細胞的細胞內(nèi)因素發(fā)揮抗病毒功能。通過生物信息學分析結(jié)合qRT-PCR 驗證土木香內(nèi)酯單獨處理可誘導IFN-I 編碼基因Ifna1、Ifnb1表達，并同時誘導干擾素誘導基因Ifit1、Isg15表達，即土木香內(nèi)酯可直接激活細胞IFN-I信號通路。接著在Ifnar1?/?A549細胞中證明土木香內(nèi)酯抗病毒功能與IFN 通路的部分依賴關(guān)系。此外，土木香內(nèi)酯在H1N1 感染的小鼠模型中表現(xiàn)出提升小鼠生存率、降低肺組織病毒載量的作用。

IFN 是對病毒感染的先天免疫反應的關(guān)鍵效應因子。通過結(jié)合IFNAR 誘導下游ISGs 的表達。這些ISGs基因能夠抑制病毒復制和促進病毒清除[23]。本研究結(jié)果表明，藥物處理細胞后抗病毒通路相關(guān)的基因包括Ifna1、Ifnb1、Ifi44、Isg15、Ifit1被顯著上調(diào)。其中，IFIT 蛋白在人體內(nèi)包含4 個家族成員（IFIT1、IFIT2、IFIT3 等）[24-25]，在病毒感染或IFNs誘導后，IFIT 家族蛋白能夠與其他家族蛋白以及數(shù)種RNA 結(jié)合蛋白形成復合體，從而清除病毒[24]。ISG15 編碼的蛋白ISG15 是一個類泛素蛋白，該家族蛋白能夠與IFN 誘導的抗病毒因子如蛋白激酶R（protein kinase R，PKR）、三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶MxA、HuP 家族結(jié)合將靶蛋白ISG化，從而促進這些抗病毒因子的表達活性[25]。

綜上，本研究表明土木香內(nèi)酯通過激活I(lǐng)FN-I通路誘導干擾素誘導基因表達，在體內(nèi)外發(fā)揮抵抗病毒復制的作用。為土木香及蒙藥四味土木香散的抗病毒研究提供扎實的科學數(shù)據(jù)支持，并為其臨床應用提供重要的科學理論支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突