袁傳裕，胡俊杰，李 娟，劉焱文，劉松林，陳 新

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與中藥化學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065

疏肝和胃湯（Shugan Hewei Decoction，SHD）是國(guó)醫(yī)大師梅國(guó)強(qiáng)教授在經(jīng)典名方四逆散的基礎(chǔ)上加味而成，由柴胡、白芍、甘草、枳實(shí)、木香、郁金、吳茱萸、白術(shù)、黃連、砂仁10 味藥組成；具有疏肝解郁、調(diào)達(dá)肝氣、行氣散結(jié)、除痞導(dǎo)滯、養(yǎng)血滋肝、柔肝止痛、解胃脘氣滯、痞脹不舒的功效，全方疏肝理氣、健脾和胃，主要用于治療“肝郁氣滯”所致的抑郁癥[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SHD能夠調(diào)節(jié)抑郁大鼠下丘腦-垂體- 腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸功能，提高腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、N-甲基-D-天冬氨酸受體1（Nmethyl-D-aspartate receptor，NMDAR1）蛋白表達(dá)水平，保護(hù)神經(jīng)元；也可改善肝臟病理狀態(tài)，調(diào)節(jié)大鼠氨基酸代謝、能量代謝和甘油磷脂代謝以減輕抑郁癥狀[2-3]?；谖墨I(xiàn)考證和課題組前期研究，SHD全方藥材數(shù)量較多，成分較復(fù)雜；其主要成分尚不清楚，進(jìn)而影響到與其質(zhì)量控制相關(guān)的含量測(cè)定。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有高效、高分辨率、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的化學(xué)成分分析[4-5]。指紋圖譜技術(shù)在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)、真?zhèn)舞b別等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6-7]。本研究基于UPLC-Q-TOFMS/MS 技術(shù)，對(duì)該方中化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)利用HPLC 建立了SHD 的指紋圖譜，并結(jié)合3種化學(xué)模式識(shí)別進(jìn)行多維度質(zhì)量評(píng)價(jià)，且對(duì)其中9個(gè)成分的含量進(jìn)行測(cè)定，為SHD 后期深入研究以及新藥開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)、6540 四級(jí)桿-飛行時(shí)間（Q-TOF）液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)、MassHunter Acquisition 色譜工作站、1260 液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Agilent 公司；Heal Force Smart 超純水系統(tǒng)，武漢力康生物醫(yī)療科技有限公司；MS105DU 型電子天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司；YS0203 型超聲波清洗機(jī)，深圳云奕科技股份有限公司。

1.2 材料

對(duì)照品芍藥苷（批號(hào)M28GB143089，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、檸檬苦素（批號(hào)H23J9K65962，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、白術(shù)內(nèi)酯II（批號(hào)J18HB173939，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、甘草苷（批號(hào)Z10J8X39611，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、槲皮苷（批號(hào)J12H13186308，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、橙皮苷（批號(hào)K09S11L123847，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、小檗堿（批號(hào)S01A10K94340，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、柚皮素（批號(hào)L21O10Q100513，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、木香烴內(nèi)酯（批號(hào)J22GB152186，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；用于質(zhì)譜的甲醇、乙腈購(gòu)自德國(guó)默克公司；甲酸購(gòu)自美國(guó)邁瑞達(dá)公司；用于HPLC 的甲醇、乙腈購(gòu)自德國(guó)默克公司；其他試劑為分析純。

1.3 藥材

10 種飲片均由湖北中醫(yī)藥大學(xué)李娟教授鑒定為正品。柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根（批號(hào)202301006、230202201，產(chǎn)地河北；批號(hào)C089221202，產(chǎn)地山西）；甘草為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖（批號(hào)230201、C201230101，產(chǎn)地新疆；批號(hào)202301018、202302021，產(chǎn)地內(nèi)蒙古）；白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根（批號(hào)230201、202302009、C035220602，產(chǎn)地安徽）；木香為菊科川木香屬植物木香Aucklandia lappaDecne.的干燥根（批號(hào)2322050101、202111001、230201、220401，產(chǎn)地云南）；枳實(shí)為蕓香科柑橘屬植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥幼果（批號(hào)2322120127、2222040206，產(chǎn)地湖北）；吳茱萸為蕓香科吳茱萸屬植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果實(shí)（批號(hào)202301004、230101、C554221201，產(chǎn)地江西）；白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖（批號(hào)C039230201，產(chǎn)地安徽；批號(hào)202306012、202303027，產(chǎn)地浙江）；郁金為姜科姜黃屬植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling 的干燥塊根（批號(hào)202112010、202206008、220800181，產(chǎn)地廣西；批號(hào)230101，產(chǎn)地四川）；砂仁為姜科豆蔻屬植物陽(yáng)春砂AmomumvillosumLour.的干燥成熟果實(shí)（批號(hào)221103321、202210027，產(chǎn)地廣東；批號(hào)202111011，產(chǎn)地云南）；黃連為毛茛科黃連屬植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖（批號(hào)C806221101、221201451、C806221101，產(chǎn)地四川）。SHD 的各個(gè)藥材組合見(jiàn)表1。

表1 SHD 的藥材組合Table 1 Combination of SHD medicinal materials

2 方法

2.1 色譜條件

2.1.1 成分鑒定 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～5 min，5%乙腈；5～15 min，5%～35%乙腈；15～18 min，35%～45%乙腈；18～22 min，45%～55%乙腈；22～27 min，55%～95%乙腈；27～32 min，95%乙腈；32.1～37 min，95%～5%乙腈；體積流量為0.2 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2 指紋圖譜及含量測(cè)定 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脫為0～15 min，5.0%～12.7%乙腈；15～18 min，12.7%～12.8%乙腈；18～22 min，12.8%～16.0%乙腈；22～23.3 min，16.0%～16.1%乙腈；23.3～25.5 min，16.1%～16.3%乙腈；25.5～33 min，16.3%乙腈；33～55 min，16.3%～17.9%乙腈；55～70 min，17.9%～26.0%乙腈；70～72 min，26.0%～31.0%乙腈；72～78 min，31.0%～33.0%乙腈；78～80 min，33.0%～35.0%乙腈；80～83 min，35.0%～45.0%乙腈；83～87 min，45.0%乙腈；87～100 min，45.0%～47.0%乙腈；100～108 min，47.0%～57.0%乙腈；108～113 min，57.0%～70.0%乙腈；113～116 min，70.0%～75.0%乙腈；116～120 min，75.0%～95.0%乙腈；120～125 min，95.0%乙腈；125～125.01 min，95.0%～5.0%乙腈；125.01～130 min，5.0%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；變波長(zhǎng)檢測(cè)：0～27 min，225 nm；27～76 min；210 nm；76～82 min，287 nm；82～130 min，210 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；采集模式為正、負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500；去溶劑氣流溫度320 ℃；去溶劑氣流體積流量8 L/min；鞘氣溫度280 ℃；鞘氣體積流量11 L/min；噴霧器壓力275.79 kPa（40 psi）；毛細(xì)管電壓4 000 V（負(fù)離子模式3 500 V）；噴嘴電壓1 000 V（負(fù)離子模式1 500 V）；碎裂電壓150 V。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

2.3.1 成分鑒定 稱取芍藥苷、柴胡皂苷A、甘草苷、槲皮苷、橙皮苷、甘草次酸、小檗堿、柚皮素、檸檬苦素、白術(shù)內(nèi)酯II、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度約1 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.3.2 指紋圖譜及含量測(cè)定 精密稱定芍藥苷、甘草苷、槲皮苷、橙皮苷、小檗堿、柚皮素、檸檬苦素、白術(shù)內(nèi)酯II、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為3 058.00、2 666.00、290.30、348.20、1 330.00、304.00、642.00、118.40、4.69 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 成分鑒定 取柴胡10 g、白芍10 g、炙甘草6 g、麩炒枳實(shí)10 g、郁金10 g、木香10 g、麩炒白術(shù)15 g、砂仁10 g、吳茱萸6 g、黃連6 g，置于圓底燒瓶中，加入10 倍藥材質(zhì)量的純化水，回流提取4 h 后，紗布濾過(guò)，取清液，濃縮至約400 mL，冷凍干燥，得到SHD 凍干粉（收率49.3%），稱取12 mg，用50%甲醇定容至5 mL，超聲（500 W、240 kHz）15 min 后過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4.2 指紋圖譜及含量測(cè)定 按“2.4.1”項(xiàng)下處方比例稱取SHD 全方置于圓底燒瓶中，加入10 倍藥材質(zhì)量的純化水，回流提取4 h 后，紗布濾過(guò)，取清液，冷卻至室溫后精密吸取5 mL，置于100 ℃水浴鍋上揮干溶劑，殘?jiān)?0%甲醇水溶液復(fù)溶，定容至10 mL，超聲（500 W、240 kHz）15 min，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

3 結(jié)果

3.1 SHD 中化合物的指認(rèn)與鑒定

取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件與“2.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，所得一級(jí)正、負(fù)離子模式下的基準(zhǔn)峰強(qiáng)度（base peak intensity，BPI）圖見(jiàn)圖1。通過(guò)分析一級(jí)所得的化合物分子離子與二級(jí)模式下的碎片離子峰，比較已有對(duì)照品與樣品的保留時(shí)間并參考相關(guān)文獻(xiàn)，從SHD 中鑒定出88 種成分，包括26 個(gè)黃酮類成分、27 個(gè)萜類成分、18 個(gè)生物堿類成分、6 個(gè)香豆素類成分、6 個(gè)有機(jī)酸類成分、2 個(gè)苯丙素類化合物、4個(gè)其他類成分。其中4 個(gè)來(lái)自柴胡，4 個(gè)來(lái)自白芍，16 個(gè)來(lái)自甘草，21 個(gè)來(lái)自枳實(shí)，13 個(gè)來(lái)自黃連，7個(gè)來(lái)自白術(shù)，1 個(gè)來(lái)自砂仁，4 個(gè)來(lái)自郁金，14 個(gè)來(lái)自吳茱萸，7 個(gè)來(lái)自木香。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 SHD 的UPLC-Q-TOF-MS/MS 定性分析結(jié)果Table 2 UPLC-Q-TOF-MS/MS qualitative analysis results of SHD

3.1.1 黃酮類化合物 黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為基本母核的一類多酚化合物，多以糖苷的形式存在于植物體內(nèi)。其基本碳架結(jié)構(gòu)為C6-C3-C6[21]。根據(jù)B 環(huán)的取代位置和C 環(huán)C-2 和C-3 位的還原情況可將黃酮分為黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、二氫異黃酮、查耳酮、二氫查爾酮、花色素等[22]。

從SHD 共鑒定出黃酮類化合物26 個(gè)，按其結(jié)構(gòu)類型可分為黃酮11 個(gè)、黃酮醇4 個(gè)、二氫黃酮8個(gè)、異黃酮3 個(gè)、黃烷酮1 個(gè)。根據(jù)黃酮C 環(huán)和A環(huán)上的取代基差異可將黃酮簡(jiǎn)單地分為羥基取代黃酮、甲氧基取代黃酮、黃酮苷等。相似的，黃酮類化合物會(huì)出現(xiàn)丟失C-4 位羰基，即M－CO，C 環(huán)形成呋喃環(huán)；也可同時(shí)丟失C-1 位O 和C-4 位羰基，即M－CO2，C 環(huán)形成四元烯烴環(huán)。還可發(fā)生逆迪爾斯-阿爾德（retro Diels-Alder，RDA）重排，C 環(huán)1、2 位與3、4 位斷開(kāi)，C 環(huán)上的2、3 位形成中性分子并連同B 環(huán)丟失，C 環(huán)1 位O 與4 位羰基相連，生成四元丙內(nèi)酯環(huán)。羥基取代黃酮在分子結(jié)構(gòu)中含有鄰二羥基時(shí)可發(fā)生脫水重排，即M－H2O，但在一些黃酮苷類化合物中，由于糖基上與黃酮苷元的雙羥基在空間上臨近，也可發(fā)生脫水重排；甲氧基取代黃酮由于O 元素的強(qiáng)電負(fù)性，易發(fā)生MCH3·的異裂[23-24]。以黃酮類成分橘皮素為例，正離子模式出現(xiàn)分子離子峰m/z373 [M＋H]+，其特征碎片離子m/z358 [M＋H－CH3]+、345 [M＋H－CO]+、343 [M＋H－2CH3]+、329 [M＋H－CO2]+、211 [M＋H－2CH3－C9H8O]+、183 [M＋H－2CH3－C9H8OC2H4]+。通過(guò)比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)報(bào)道[25]，證實(shí)該化合物為橘皮素，推測(cè)裂解途徑見(jiàn)圖2。

圖2 桔皮素裂解途徑預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of cleavage pattern of tangeretin

3.1.2 生物堿類化合物 生物堿類化合物的特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)中至少有1 個(gè)堿性N 原子[26]。按結(jié)構(gòu)可分為有機(jī)胺類，如麻黃堿；異喹啉類，如小檗堿；喹唑啉類，如吳茱萸堿；吲哚類，如長(zhǎng)春新堿等[27]。SHD共鑒定出生物堿類化合物18 個(gè)，多數(shù)存在于黃連和吳茱萸中，按其結(jié)構(gòu)類型可分為有機(jī)胺類1 個(gè)；異喹啉類13 個(gè)；喹唑啉類2 個(gè)；吲哚類1 個(gè)。異喹啉生物堿的基本結(jié)構(gòu)為異喹啉環(huán)通過(guò)1 個(gè)飽和六元環(huán)與苯環(huán)相連。

按異喹啉環(huán)上取代基的差異分為多種類型；當(dāng)異喹啉有甲氧基取代時(shí)，易發(fā)生β 異裂，失去-CH3后分子結(jié)構(gòu)重排形成羰基，后發(fā)生RDA 重排丟失1分子羰基，也可以再失去1 分子-CH3，繼而發(fā)生RDA 重排[28]。喹唑啉生物堿基本結(jié)構(gòu)為喹唑啉環(huán)與一吲哚環(huán)通過(guò)飽和六元環(huán)相連；從SHD 鑒定到的2種喹唑啉化合物吳茱萸堿與吳茱萸次堿的喹唑啉基團(tuán)的4 位均有羰基，可發(fā)生RDA 重排，丟失1 分子羰基，進(jìn)而生成苯丙咪唑環(huán)，并在此基礎(chǔ)上發(fā)生重排反應(yīng)，丟失1 分子HCN，并生成4 元氮雜環(huán)；此反應(yīng)可重復(fù)發(fā)生2 次，即發(fā)生2 次重排，丟失2分子HCN[29]。以異喹啉類生物堿黃藤素為例，正離子模式可見(jiàn)分子離子峰m/z352 [M]+，其特征碎片離子m/z337 [M－CH3]+、336 [M－CH3－H]+、322[M－2CH3]+、308 [M－CH3－H－CO]+、294 [M－2CH3－CO]+。經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道[30]比對(duì)，確定該化合物是黃藤素。裂解途徑見(jiàn)圖3。

圖3 黃藤素裂解途徑預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of cleavage pattern of palmatine

3.1.3 萜類化合物 萜類化合物是以異戊二烯（C5）為基本單元組成的一類化合物，按異戊二烯單元的數(shù)目可分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多萜。從SHD 共鑒定出萜類化合物26 個(gè)，包括單萜類2 個(gè)，如芍藥苷、芍藥內(nèi)酯C；倍半萜類11 個(gè)，如白術(shù)內(nèi)酯I、珊塔瑪內(nèi)酯等；三萜類13 個(gè)，如甘草次酸、檸檬苦素等。倍半萜類化合物含有3 個(gè)異戊二烯單元，其分子結(jié)構(gòu)多含有羰基和羥基；在其分子內(nèi)含有羥基時(shí)，一般可發(fā)生鄰位脫水，即M－18，并形成1 個(gè)雙鍵；由于倍半萜結(jié)構(gòu)中存在多數(shù)飽和C 原子，這一反應(yīng)通?？梢酝茰y(cè)該倍半萜所含的羥基數(shù)目，即發(fā)生幾次脫水反應(yīng)。含有羰基的倍半萜化合物可發(fā)生重排反應(yīng)，脫去羰基，即M－28。由于上述反正的進(jìn)行，雙鍵的存在可使與其相連的甲基發(fā)生重排裂解，甲基上的1 個(gè)H 原子轉(zhuǎn)移到雙鍵上，單鍵斷裂，即M－14。分子中如果有γH 和雙鍵同時(shí)存在時(shí)，可以發(fā)生麥?zhǔn)现嘏?，丟失1 分子C2H4，即M－26[31]。以倍半萜類化合物白術(shù)內(nèi)酯III 為例，正離子模式可見(jiàn)分子離子峰m/z249 [M＋H]+，其特征碎片離子m/z231 [M＋H－H2O]+、203 [M＋H－H2O－CO]+、189 [M＋HH2O－C3H6]+、175 [M＋H－H2O－C3H6－CH2]+、163[M＋H－H2O－C5H8]+。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[32]比對(duì)，確定該化合物為白術(shù)內(nèi)酯III，裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 白術(shù)內(nèi)酯III 裂解途徑預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of cleavage pattern of atractylenolide III

三萜類化合物含有6 個(gè)異戊二烯單元，其一般多與各種單糖或二糖相連，其相對(duì)分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。與糖苷相連的三萜類化合物通常會(huì)丟失分子內(nèi)的糖苷，此反應(yīng)可以1 次丟失1 分子的單糖，也可將所連接的糖苷全部脫去；甘草酸可見(jiàn)上述反應(yīng)。未與糖苷結(jié)合的三萜類化合物多發(fā)生重排反應(yīng)，可丟失的較常見(jiàn)的中性碎片有H2O、CO、CO2等[33]。以三萜類化合物甘草酸為例，正離子模式可見(jiàn)分子離子峰m/z823 [M＋H]+，其特征碎片離子m/z647[M＋H－C6H8O6]+、471 [M＋H－2C6H8O6]+、453[M＋H－2C6H8O6－H2O]+、435 [M＋H－2C6H8O6－2H2O]+、407 [M＋H－2C6H8O6－H2O－C2H4]+。根據(jù)與文獻(xiàn)比對(duì)[34-35]，確定該化合物為甘草酸，裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖5 甘草酸裂解途徑預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of cleavage pattern of glycyrrhizin

3.2 SHD 指紋圖譜研究

3.2.1 精密度試驗(yàn) 取同一批SHD 樣品（S5）1 份，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，以3 號(hào)峰槲皮苷為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.02%～0.21%，相對(duì)峰面積的RSD 為0.14%～2.32%，表明該方法精密度良好。

3.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批SHD 樣品（S5）6 份，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以8 號(hào)峰槲皮苷為參照峰（S），計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.05%～0.67%，相對(duì)峰面積的RSD 為0.47%～3.36%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取SHD（S5）供試品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，于0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以8 號(hào)峰槲皮苷為參照峰（S），計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.04%～0.67%，相對(duì)峰面積的RSD 為0.23%～3.86%，表明SHD 供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4 指紋圖譜的建立及其相似度評(píng)價(jià) 取10 批SHD 樣品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012）版”，以S1 號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗設(shè)為0.1 min，通過(guò)多點(diǎn)校正進(jìn)行Marker 峰匹配，建立疊加圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見(jiàn)圖6，確定20 個(gè)共有峰，其中2 號(hào)峰為芍藥苷、4 號(hào)峰為甘草苷、8 號(hào)峰為槲皮苷、9 號(hào)峰為橙皮苷、12 號(hào)峰為小檗堿、13 號(hào)峰為柚皮素、14 號(hào)峰為檸檬苦素、19 號(hào)峰為木香烴內(nèi)酯、20 號(hào)峰為白術(shù)內(nèi)酯II。各樣品之間的相似度在0.958～1.000，結(jié)果見(jiàn)表3，表明10 批SHD 樣品存在一定差異。

圖6 10 批SHD 疊加譜圖及對(duì)照指紋譜圖 (R)Fig.6 Superimposed spectra of 10 batches of SHD and control fingerprint spectra (R)

表3 10 批SHD 指紋圖譜相似度Table 3 Similarity of fingerprints of 10 batches of SHD

3.3 化學(xué)模式識(shí)別分析

3.3.1 層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 將10 批SHD 的20 個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 27.0 軟件，采用組間聯(lián)接的聚類方法，以平方歐氏距離為樣品間距離進(jìn)行HCA，當(dāng)平方歐式距離為25 時(shí)。SHD 樣品聚為2 類，樣品S2、S4、S8、S10 聚為一類，其余樣品聚為另一類，見(jiàn)圖7。

圖7 10 批SHD 的HCA 樹(shù)狀圖Fig.7 Tree diagram of HCA for 10 batches of SHD

3.3.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將10 批SHD 樣品的20 個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 27.0 軟件，對(duì)20 個(gè)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)表4。前6 個(gè)因素的累積方差貢獻(xiàn)率＞85%，且特征值＞1，可以概括SHD 樣品的大部分信息。

使用SPSS 27.0 軟件對(duì)10 批SHD 樣品共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)為變量，運(yùn)用SIMCA 14.1 軟件得到10 批SHD 樣品PCA 得分圖見(jiàn)圖8。結(jié)果所有樣品均在95%的置信區(qū)間內(nèi)分為2 類，其中樣品S2、S4、S8、S10 聚為一類，其余樣品聚為另一類，與HCA 結(jié)果一致。

圖8 10 批SHD 的PCA 得分圖Fig.8 PCA score chart of 10 batches of SHD

3.3.3 正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）使用SPSS 27.0 軟件對(duì)10 批疏肝和胃湯SHD 樣品共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理，將標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1，通過(guò)該軟件對(duì)10 批疏肝和胃湯SHD樣品進(jìn)行OPLS-DA。使用有監(jiān)督模式識(shí)別方法進(jìn)行建模。該模型RX2＝0.824，RY2＝1.000，Q2＝0.931，模型預(yù)測(cè)參數(shù)均大于0.5，說(shuō)明該模型穩(wěn)定可靠，有較好的預(yù)測(cè)能力[36]。OPLS-DA 得分圖見(jiàn)圖9。以變量重要性投影（variable importance projection，VIP）大于1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異性成分，共篩選出8 個(gè)對(duì)分類影響較大的成分，分別為峰8、13、6、11、10、12、16、15，見(jiàn)圖10。

圖9 10 批SHD 的OPLS-DA 得分圖Fig.9 OPLS-DA scores chart of 10 batches of SHD

圖10 20 個(gè)共有峰的VIP 值Fig.10 VIP value chart of 20 common peaks

3.4 含量測(cè)定

3.4.1 線性關(guān)系考察 取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程分別為芍藥苷Y＝16 672.0X＋37.111，R2＝0.999 8，線性范圍50.10～175.40 μg/mL；甘草苷Y＝32 402.0X＋9.193，R2＝0.999 3，線性范圍14.93～57.59 μg/mL；槲皮苷Y＝44 407.0X－534.610，R2＝0.999 7，線性范圍193.54～647.94 μg/mL；橙皮苷Y＝30 318.0X＋32.836，R2＝0.999 0，線性范圍17.43～61.03 μg/mL；小檗堿Y＝28 874.0X－34.934，R2＝0.999 6，線性范圍33.77～116.81 μg/mL；柚皮素Y＝20 953.0X－0.190 1，R2＝0.999 2，線性范圍0.92～15.20 μg/mL；檸檬苦素Y＝5 786.7X－0.421 9，R2＝0.999 3，線性范圍3.24～25.92 μg/mL；木香烴內(nèi)酯Y＝19 829.0X＋1.698 3，R2＝0.999 2，線性范圍1.07～4.11 μg/mL；白術(shù)內(nèi)酯IIY＝36 843.0X－25.565，R2＝0.999 7，線性范圍4.33～22.14 μg/mL。

3.4.2 專屬性試驗(yàn) 取SHD 樣品溶液、混合對(duì)照品溶液、50%甲醇溶液及各藥材陰性溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明供試品溶液與對(duì)照品溶液保留時(shí)間相同位置的色譜峰與各對(duì)照品一致，陰性無(wú)干擾，其中峰2 為芍藥苷、峰4 為甘草苷、峰8 為槲皮苷、峰9 為橙皮苷、峰12 為小檗堿、峰13 為柚皮素、峰14 為檸檬苦素、峰19 為木香烴內(nèi)酯、峰20 為白術(shù)內(nèi)酯II，色譜圖見(jiàn)圖11。

圖11 SHD 樣品溶液、混合對(duì)照品溶液、50%甲醇溶液及各藥材陰性樣品色譜圖Fig.11 Chromatograms of sample solution of SHD, mixed reference substances solution, 50% methanol solution and negative samples of medicinal materials

3.4.3 精密度試驗(yàn) 取SHD 樣品（S5），按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)定并計(jì)算色譜峰峰面積RSD。各成分峰面積的RSD 分別為0.34%、2.31%、0.13%、0.14%、1.37%、0.63%、0.61%、1.88%、0.86%。表明儀器精密度良好。

3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批SHD 樣品（S5），按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定并計(jì)算色譜峰峰面積RSD。各成分峰面積的RSD 分別為1.08%、2.61%、0.43%、0.43%、1.31%、0.50%、1.31%、1.45%、1.46%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取SHD 樣品（S5），按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、4、8、12、16、20、24 h 后按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算色譜峰峰面積RSD。各成分峰面積的RSD 分別為3.40%、1.18%、0.40%、0.73%、3.42%、2.84%、1.51%、2.47%、0.97%。表明該方法所得供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定各指標(biāo)成分含量的SHD 樣品（S5）6 份，精密量取5 mL，分別加入相當(dāng)于S5 樣品中各指標(biāo)成分80%、100%、120%的各對(duì)照品，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到芍藥苷、甘草苷、槲皮苷、橙皮苷、小檗堿、柚皮素、檸檬苦素、木香烴內(nèi)酯、白術(shù)內(nèi)酯II 的平均回收率為100.51%、96.80%、103.52%、101.16%、101.77%、103.60%、100.43%、99.02%、99.75%，RSD 分別為2.91%、4.39%、3.70%、2.70%、3.64%、1.86%、2.71%、3.78%、1.96%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

3.4.7 多指標(biāo)成分含量測(cè)定 取10 批SHD 樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 10 批SHD 含量測(cè)定結(jié)果 (±s, n = 3)Table 5 Content determination of 10 batches of SHD (±s, n = 3)

表5 10 批SHD 含量測(cè)定結(jié)果 (±s, n = 3)Table 5 Content determination of 10 batches of SHD (±s, n = 3)

樣品 質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)芍藥苷 甘草苷 槲皮苷 橙皮苷 小檗堿 柚皮素 檸檬苦素 木香烴內(nèi)酯 白術(shù)內(nèi)酯II S1 98.23±0.75 23.42±0.57 430.01±4.35 28.54±0.43 64.02±1.73 10.66±0.23 8.64±0.21 2.10±0.12 7.13±0.28 S2 96.83±2.15 31.72±1.79 289.44±10.17 37.61±1.86 74.62±1.25 6.45±0.08 8.10±0.38 2.96±0.04 8.17±0.31 S3 95.71±1.69 27.71±1.37 373.99±13.29 29.47±1.66 55.11±1.07 8.90±0.13 5.33±0.04 1.28±0.04 5.75±0.26 S4 89.06±1.79 28.48±0.40 317.07±2.52 25.37±0.97 63.29±2.54 5.53±0.22 5.66±0.16 1.98±0.04 4.99±0.03 S5 88.78±3.07 24.72±0.33 380.79±3.51 36.38±1.07 61.02±0.71 10.56±0.74 7.69±0.17 2.25±0.01 7.14±0.38 S6 94.29±0.44 30.05±0.67 415.43±5.40 36.56±1.42 57.27±1.48 10.60±0.44 20.07±0.59 1.30±0.06 5.54±0.18 S7 94.03±1.64 26.54±0.29 427.52±1.80 27.28±0.85 67.39±1.74 11.16±0.31 5.23±0.16 3.07±0.05 10.06±0.07 S8 97.15±1.15 25.41±0.87 325.29±6.43 45.53±0.95 68.42±2.90 7.30±0.09 5.69±0.22 1.08±0.01 6.05±0.22 S9 92.75±0.51 32.45±0.18 396.58±1.69 30.15±0.95 62.21±0.73 10.77±0.04 20.78±0.18 1.48±0.06 5.51±0.28 S10 90.50±1.33 31.70±1.47 308.10±7.11 37.21±0.71 65.19±1.05 7.65±0.22 8.28±0.03 1.70±0.01 5.84±0.06

4 討論

通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)從SHD 中共鑒定88 種成分，包括26 個(gè)黃酮類成分、15 個(gè)萜類成分、17 個(gè)生物堿類成分、6 個(gè)香豆素類成分、6 個(gè)有機(jī)酸類成分、2 個(gè)苯丙素類化合物、2 個(gè)其他類成分。柴胡配以白芍，以柴胡苦辛解表泄熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣，以白芍苦酸養(yǎng)血滋肝、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)，兩者相配已有千年歷史，在調(diào)肝方面尤長(zhǎng)[37-38]。枳實(shí)破氣散結(jié)，除痞導(dǎo)滯，可以用于治療積滯內(nèi)停、痞滿脹痛，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)枳實(shí)有調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)功能和抗炎的作用[39-40]。其中枳實(shí)貢獻(xiàn)了21種成分，包括黃酮類（17 種）、有機(jī)酸類（2 種）、生物堿類（1 種）、三萜類成分（2 種）；白芍貢獻(xiàn)了4 種成分，包括黃酮類（3 種）、有機(jī)酸類（1 種）、單萜類（2 種）和其他類成分（1 種）。本研究從柴胡中鑒定出的化合物較少，其原因可能是由于直接采用水煎煮法制備供試品溶液，而柴胡主要化學(xué)成分是皂苷類成分，加之皂苷類成分在熱水中易分解，因此造成本條件下檢出的柴胡皂苷較少[41-42]。后續(xù)將結(jié)合常溫提取方法和UPLC-Q-TOF-MS/MS 針對(duì)皂苷類成分進(jìn)行鑒定，并利用HPLC-ELSD 方法進(jìn)行皂苷類成分的指紋圖譜和多成分定量研究。

通過(guò)指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)合CA、PCA 和OPLS-DA，發(fā)現(xiàn)不同批次SHD 樣品存在一定差異并聚為2 類，其原因是樣品S2、S4、S8、S10 所用的枳實(shí)為同一批藥材，其余樣品為同一批藥材。說(shuō)明影響SHD 質(zhì)量差異的主要原因可能是枳實(shí)的批次不同；影響SHD 質(zhì)量的差異成分共8 個(gè)，分別為槲皮苷、柚皮素、峰6、峰11、峰10、小檗堿、峰16 和峰15。其中槲皮苷在OPLS-DA 中的VIP值最大，是影響SHD 質(zhì)量最為重要的成分。該提取方法中，枳實(shí)是槲皮苷含量的重要來(lái)源，在影響SHD 質(zhì)量的差異成分中，枳實(shí)所提供的黃酮類成分的權(quán)重較高。

本實(shí)驗(yàn)前期考察了柴胡皂苷A 和姜黃素在HPLC 圖中的響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷A 色譜峰峰面積小，強(qiáng)度低，且信噪比（S/N）低于10∶1，不滿足定量所屬的條件；加之在樣品中并未檢出姜黃素色譜峰，故并未選擇以上2 種對(duì)照品。考慮到SHD 全方組成，并參考《中國(guó)藥典》對(duì)于單味藥材的含量測(cè)定方法，結(jié)合前文所提及的枳實(shí)的高權(quán)重性，最終選擇以下9 種對(duì)照品。其中，芍藥苷歸屬于白芍；甘草苷歸屬于甘草；小檗堿歸屬于黃連；白術(shù)內(nèi)酯II 歸屬于白術(shù)；木香烴內(nèi)酯歸屬于木香；檸檬苦素歸屬于吳茱萸；槲皮苷、橙皮苷和柚皮素均歸屬于枳實(shí)。旨在全面地反映SHD 的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，在一定程度上反映了SHD 質(zhì)量的差異。

本研究使用具有高靈敏度、高分辨率的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和對(duì)照品指認(rèn)，基本闡明了SHD 中化合物的類型以及化合物藥材來(lái)源的歸屬；使用控制中藥復(fù)方整體質(zhì)量較常用的方法HPLC 法建立了SHD 的指紋圖譜，兩者結(jié)合，既可以提供該方所含化合物信息及其歸屬，又可對(duì)該方進(jìn)行質(zhì)量控制，為后續(xù)新藥研發(fā)以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突