張 一,李小燕,牛麗敏,李 慧,*,沈 鉑,陳文波,*,上官靜雨
(1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司,老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室,營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102209;2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023;3.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院,河北 石家莊 050000;4.回瀾威士忌蒸餾科技(成都)有限公司,四川 邛崍 611500)
威士忌是世界上最受消費(fèi)者喜愛的蒸餾酒之一,以大麥等谷物為原料,經(jīng)過大麥發(fā)芽、糖化、發(fā)酵、蒸餾、桶陳、復(fù)配等工藝制得。經(jīng)過長期發(fā)展,全球已經(jīng)形成了5 個(gè)重要的威士忌產(chǎn)區(qū):蘇格蘭、愛爾蘭、美國、加拿大和日本[1-2]。不同產(chǎn)區(qū)的威士忌因原料、工藝、氣候、水質(zhì)等因素的影響差異較大。根據(jù)原料差異,威士忌可初步分為麥芽威士忌和谷物威士忌[3],其中,麥芽威士忌的主要產(chǎn)區(qū)在蘇格蘭和日本。在蘇格蘭,威士忌生產(chǎn)廠家超過100 家,包括被譽(yù)為“單一麥芽威士忌中的勞斯萊斯”的麥卡倫[4]。日本威士忌最早是模仿學(xué)習(xí)蘇格蘭威士忌的釀造流程,經(jīng)過百余年的發(fā)展也逐漸形成自己的風(fēng)格特點(diǎn)。當(dāng)前最受歡迎的日本威士忌產(chǎn)自三得利和一甲等廠家[5-6],其中日本第一家生產(chǎn)單一麥芽威士忌的蒸餾廠—三得利旗下的山崎威士忌的風(fēng)格與蘇格蘭威士忌比較接近,富含成熟水果芳香,但香氣更加甘醇[7]。
近年來,威士忌的研究主要集中在風(fēng)味方面。Lee等[8]的研究發(fā)現(xiàn),蘇格蘭威士忌所具有的水果味、堅(jiān)果味、肥皂味與異戊酸乙酯、威士忌內(nèi)酯、月桂酸乙酯等物質(zhì)密切相關(guān),并據(jù)此開發(fā)了威士忌感官評(píng)價(jià)風(fēng)味輪,為消費(fèi)者識(shí)別判斷威士忌風(fēng)味特點(diǎn)和行業(yè)監(jiān)管提供了一個(gè)有效方法。伍思佳等[9]認(rèn)為威士忌的香氣可分為原料香[10-11]、發(fā)酵香[12]、蒸餾香和陳釀香[13],與己醛、壬醛、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁香酚等物質(zhì)密切相關(guān)。Poisson團(tuán)隊(duì)[14-15]以美國產(chǎn)區(qū)的波本威士忌為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)了45 種風(fēng)味化合物,其中26 種風(fēng)味化合物氣味活度值(odor activity value,OAV)大于1。
目前關(guān)于不同產(chǎn)區(qū)威士忌香氣特點(diǎn)的相對(duì)較少,國內(nèi)威士忌研究起步較晚,對(duì)威士忌關(guān)鍵香氣成分組成的認(rèn)識(shí)及工藝控制點(diǎn)的把控經(jīng)驗(yàn)也相對(duì)不足。開展不同威士忌的風(fēng)味特點(diǎn)研究十分必要。本研究以具有代表性的2 款麥卡倫威士忌和2 款山崎威士忌為研究對(duì)象,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(headspace-solid phase micro extraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)聯(lián)用技術(shù)并結(jié)合OAV與生產(chǎn)工藝研究其關(guān)鍵香氣成分組成,并通過二維層析聚類分析與主成分分析(principal component analysis,PCA)進(jìn)一步挖掘蘇格蘭威士忌與日本威士忌的香氣特點(diǎn),以期為國產(chǎn)威士忌高品質(zhì)發(fā)展提供理論參考和科學(xué)依據(jù)。
研究所用4 款威士忌酒樣品來自蘇格蘭麥卡倫和日本山崎酒廠,酒標(biāo)年齡分別為12 a和18 a,均由WBA威士忌商學(xué)院提供。4 款威士忌酒樣品編號(hào)分別為M-1(麥卡倫12 a,乙醇體積分?jǐn)?shù)40%)、M-2(麥卡倫18 a,乙醇體積分?jǐn)?shù)43%)、S-1(山崎12 a,乙醇體積分?jǐn)?shù)43%)、S-2(山崎18 a,乙醇體積分?jǐn)?shù)43%)。
氯化鈉(分析純)國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司;1,2,3-三氯丙烷(色譜純)北京曼哈格生物科技有限公司;正構(gòu)烷烴(色譜純)上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;純水均從Milliq凈化系統(tǒng)獲得。
GC-MS-2020NX GC-MS聯(lián)用儀(配備AOC-6000三位一體自動(dòng)進(jìn)樣器、20 mL SPME/頂空樣品瓶及安全瓶蓋)、SPME fiber Carboxen/DVB/PDMS固相微萃取頭(50/30 μm,2 cm)島津企業(yè)管理(中國)有限公司;ME204/04型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。
1.3.1 樣品預(yù)處理
參考文獻(xiàn)[16]并進(jìn)行適當(dāng)修改:用蒸餾水將所有樣品稀釋調(diào)節(jié)乙醇體積分?jǐn)?shù)至5%。取5 mL待測樣品于頂空瓶中,加入3 g氯化鈉,之后準(zhǔn)確加入三氯丙烷(10 mg/L)內(nèi)標(biāo)溶液150 μL,迅速擰緊并封好瓶塞,搖勻待測。
1.3.2 GC條件
色譜柱:InertCap UI-Wax(60 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:初始溫度40 ℃,保持3 min,以10 ℃/min速率上升到150 ℃,隨后以4 ℃/min速率上升到230 ℃,保持8 min;載氣:99.999%高純度氦氣;載氣流速:1 mL/min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃。
1.3.3 MS條件
電離方式:電子電離;電子能量:70 eV;發(fā)射電流:200 μA;離子源溫度:230 ℃;四極桿溫度:150 ℃;接口溫度:280 ℃;掃描方式:全掃描模式;質(zhì)量范圍:30~500 Da。
1.3.4 揮發(fā)性化合物定性分析
根據(jù)峰面積大小篩選分析GC-MS風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖,自動(dòng)識(shí)別信噪比大于200的峰并進(jìn)行匹配度篩選,得到匹配度大于80%的物質(zhì),再結(jié)合NIST 14譜庫檢索進(jìn)行保留指數(shù)(retention index,RI)定性[17]。
RI定性:將樣品與正構(gòu)烷烴(C7~C40)在相同色譜條件下進(jìn)樣分析,計(jì)算RI值,并與文獻(xiàn)中RI進(jìn)行對(duì)比,將絕對(duì)值相差100以內(nèi)的確定為同一化合物。計(jì)算公式如下:
式中:n和n+1分別為目標(biāo)物流出前后正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù);t為目標(biāo)物的保留時(shí)間;tn和tn+1為對(duì)應(yīng)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。
1.3.5 揮發(fā)性化合物定量分析
揮發(fā)性化合物相對(duì)含量[18]:根據(jù)定性結(jié)果,對(duì)GC-MS中信噪比大于200的峰的峰面積求和作為總揮發(fā)性化合物峰面積,采用面積歸一化法計(jì)算不同類型揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量,計(jì)算公式如下:
揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度:采用三氯丙烷作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量[19],即假定各物質(zhì)的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)相同,通過各揮發(fā)性化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度,計(jì)算出各揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度,計(jì)算公式如下:
1.3.6 OAV計(jì)算
與風(fēng)味數(shù)據(jù)庫(https://www.femaflavor.org/flavorlibrary)的揮發(fā)性化合物香氣特征進(jìn)行比對(duì),篩選風(fēng)味化合物。根據(jù)威士忌酒樣中揮發(fā)性化合物的質(zhì)量濃度和各化合物在水溶液中的嗅覺閾值[20],OAV計(jì)算公式如下:
將OAV≥1的化合物視作對(duì)樣品香氣品質(zhì)具有貢獻(xiàn)作用的物質(zhì),其值越大代表其貢獻(xiàn)性越大,是樣品中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物[21]。
采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)比分析4 款麥芽威士忌的揮發(fā)性化合物組成,共鑒定出243種揮發(fā)性化合物,包括酯類88 種、醇類40 種、醛類16 種、酸類13 種、酮類11 種和其他化合物74 種。由圖1a可知,揮發(fā)性化合物相對(duì)含量最高的是酯類、酸類和醇類化合物,3 類物質(zhì)在4 款威士忌酒中的相對(duì)含量可達(dá)到90%以上。對(duì)相對(duì)含量最高的酯類、酸類和醇類化合物濃度進(jìn)一步分析表明,酯類化合物在S-1、S-2、M-1、M-2中質(zhì)量濃度分別為93.40、86.67、61.90 mg/L和92.53 mg/L。酸類化合物在S-1、S-2中質(zhì)量濃度分別為40.58、40.32 mg/L,在M-1、M-2中質(zhì)量濃度分別為33.68 mg/L和34.06 mg/L。醇類化合物在S-1、S-2、M-1、M-2中的質(zhì)量濃度分別為25.27、22.20、24.32、35.04 mg/L(圖1b)。4 款威士忌酒酸類和醇類化合物之間質(zhì)量濃度差異不顯著,但M-1中酯類化合物質(zhì)量濃度顯著低于S-1、S-2、M-2中的酯類化合物質(zhì)量濃度。
圖1 不同威士忌樣本中各類揮發(fā)性化合物相對(duì)含量(a)和質(zhì)量濃度(b)Fig.1 Proportions (a) and concentrations (b) of various volatile compounds in different whisky samples
為明確4 款威士忌中的香氣化合物,對(duì)檢測得到的243 種揮發(fā)性成分進(jìn)行OAV分析并篩選得到58 種風(fēng)味化合物,其中酯類25 種、醇類13 種、醛類10 種、酮類5 種、酸類3 種、其他類2 種(表1)。一般來說,OAV越大說明該化合物對(duì)酒體的總體香氣貢獻(xiàn)越大,OAV≥1說明該化合物對(duì)酒體的總體香氣有直接貢獻(xiàn)。
表1 威士忌風(fēng)味物質(zhì)信息、OAV及風(fēng)味描述特點(diǎn)Table 1 OAV and aroma description characteristics of aroma components in whisky samples
由表1可知,S-1、S-2、M-1、M-2威士忌酒中分別有32、31、35、36 種OAV≥1的風(fēng)味化合物。4 種威士忌中含有31 種共有OAV≥1的組分,包括酯類17 種、醇類7 種、醛類4 種、酮類1 種、酸類2 種。
酯類物質(zhì)是4 款威士忌中種類最多、OAV最高的風(fēng)味化合物,大部分呈現(xiàn)花香、果香的特點(diǎn),是威士忌酒的重要香氣物質(zhì)。辛酸乙酯在4 款酒中OAV均較高,OAV在773.67~1374.77之間,能賦予威士忌果味(香蕉味、梨味)和果酒味。癸酸乙酯和月桂酸乙酯OAV范圍分別在264.61~371.74和25.79~56.17之間,能賦予威士忌甜味、果味、肥皂味。兩款日本威士忌中異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯OAV最高,分別是1445.40、1990.11(S-1)和1512.70、1912.74(S-2),這兩種酯類物質(zhì)賦予了山崎威士忌更強(qiáng)的蘋果味。此外,雖然丁酸乙酯、己酸乙酯、丁酸甲酯在4 款威士忌中都是重要的香氣物質(zhì),但在山崎威士忌中的OAV遠(yuǎn)高于麥卡倫威士忌,使山崎威士忌表現(xiàn)出更濃郁的菠蘿香氣。乙酸苯乙酯在兩款麥卡倫威士忌中OAV較高,賦予麥卡倫威士忌更強(qiáng)的玫瑰花味、蜂蜜味。酯類化合物的合成與麥芽原料中的不飽和脂肪酸、糖化工藝、發(fā)酵工藝等密切相關(guān),麥芽中的不飽和脂肪酸和麥角甾醇會(huì)抑制酵母細(xì)胞膜上乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性,從而抑制脂肪酸乙酯類化合物的合成[24]。通過制麥工藝及發(fā)酵工藝的調(diào)整,可控制麥芽中不飽和脂肪酸含量及酵母細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸和麥芽甾醇的積累[24],進(jìn)而顯著影響脂肪酸乙酯類的種類和濃度[25]。此外,低溫發(fā)酵及用發(fā)酵液直接蒸餾也可保留更多的酯類物質(zhì)[26]。
醇類化合物主要來源于麥汁(谷物糖化液)發(fā)酵過程中氨基酸代謝或糖代謝產(chǎn)物,在酒中可以起到增味助香的作用[27-28]。4 款威士忌中共有的OAV最高的醇類化合物是1-癸醇,范圍在16.61~31.92之間,其次是異戊醇,范圍在6.47~7.21之間,這兩種物質(zhì)能賦予威士忌柑橘香氣和雜醇味。金合歡醇、反式-橙花叔醇是4 款威士忌中重要的醇類物質(zhì),但在麥卡倫威士忌中的OAV遠(yuǎn)高于山崎威士忌,使麥卡倫威士忌表現(xiàn)出更強(qiáng)的花香味。兩款山崎威士忌中,1-癸醇和正己醇OAV明顯高于麥卡倫威士忌,賦予山崎威士忌更濃郁的柑橘風(fēng)味。
酸類化合物是威士忌中的重要揮發(fā)性化合物,以酵母代謝產(chǎn)生的辛酸、癸酸、月桂酸等脂肪酸為主。由于酸類化合物閾值較高,對(duì)威士忌有風(fēng)味貢獻(xiàn)的酸類化合物較少。4 款威士忌中共有兩種OAV>1的酸類化合物,分別是癸酸和辛酸,OAV范圍分別在9.21~10.92和0.98~1.79之間。酸類化合物具有奶酪發(fā)酵的酸腐味,可協(xié)調(diào)威士忌的酒體、風(fēng)味和口感。
醛酮類化合物主要來源于脂肪氧化和氨基酸降解。4 款威士忌中共有的醛酮類化合物有大馬士酮、反式-2-壬烯醛和壬醛。大馬士酮OAV范圍在243.43~306.38,是威士忌中玫瑰花香味和蜂蜜味的風(fēng)味來源[14],其中麥卡倫威士忌中大馬士酮OAV高于山崎威士忌。反式-2-壬烯醛和壬醛的OAV范圍分別在22.30~51.15和18.97~24.18之間,具有黃油味、堅(jiān)果味的風(fēng)味特點(diǎn)[29-30]。山崎威士忌中的正己醛OAV高于麥卡倫威士忌,賦予山崎威士忌更強(qiáng)的水果風(fēng)味。
上述數(shù)據(jù)表明,日本山崎威士忌和蘇格蘭麥卡倫威士忌具有豐富的果香味和花香味,這也是它們在世界范圍內(nèi)獲得廣泛認(rèn)可的原因之一。
聚類分析利用合并算法計(jì)算各變量間的距離,距離越小,相似度越高,將距離最近的2 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)或類別進(jìn)行組合,生成樹狀圖,將結(jié)果更加直觀地表現(xiàn)出來[16]。本研究采用WARD方法對(duì)威士忌中58 種風(fēng)味化合物OAV進(jìn)行層次聚類分析。
從圖2可看出,58 種風(fēng)味化合物被分為6 組,以不同顏色加以區(qū)分,其中顏色越紅說明該風(fēng)味化合物在威士忌中具有更強(qiáng)的典型性[16]。多數(shù)酯類化合物OAV在山崎威士忌中較高,如2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯等,主要呈水果香味和甜香味等特點(diǎn),乙酸苯乙酯、辛酸異戊酯、棕櫚酸甲酯等物質(zhì)OAV在麥卡倫威士忌中較高,主要呈花香味、菠蘿味等風(fēng)味特點(diǎn)。山崎威士忌中有代表性的醇類化合物是正己醇、正辛醇、2-庚醇、2-壬醇等物質(zhì),主要呈青草味、柑橘味,麥卡倫威士忌中有代表性的醇類化合物是金合歡醇、反式-橙花叔醇等物質(zhì),主要呈花香味、柑橘味。大馬士酮是麥卡倫威士忌中的典型酮類風(fēng)味化合物,能賦予其蜂蜜味和玫瑰花味,與上述風(fēng)味化合物分析鑒定結(jié)果(表1)一致。通過對(duì)比風(fēng)味化合物的相似程度,可非常直觀地將麥卡倫威士忌與山崎威士忌有效區(qū)分為兩組,明確了山崎威士忌與麥卡倫威士忌中的風(fēng)味物質(zhì)差異及其特點(diǎn)。
圖2 4 款威士忌中風(fēng)味物質(zhì)雙向?qū)哟尉垲悎DFig.2 Two-dimensional hierarchical clustering dendrogram of aroma substances in fouy whisky samples
對(duì)4 種威士忌中具有OAV的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行PCA,分析結(jié)果見表2。4 款威士忌中風(fēng)味物質(zhì)PCA得分圖及載荷圖見圖3。
表2 4 款威士忌中風(fēng)味物質(zhì)PC的方差貢獻(xiàn)率Table 2 Variance contribution rates of first three principal components for aroma components in four whisky samples
圖3 4 款威士忌酒中風(fēng)味化合物PCA得分圖(a)和載荷圖(b)Fig.3 PCA score (a) and loading plots (b) of aroma compounds in four whisky samples
PCA是一種通過降維將多個(gè)變量變?yōu)樯贁?shù)綜合變量,用簡化的數(shù)據(jù)反應(yīng)原始變量的大部分信息的統(tǒng)計(jì)方法[31]。當(dāng)累計(jì)貢獻(xiàn)率超過80%時(shí),通常認(rèn)為兩種PC基本包含樣品的信息。在4 種威士忌58 種風(fēng)味化合物中,共提取出3 個(gè)特征值大于1的PC,其中前兩個(gè)PC的方差貢獻(xiàn)率分別為65.1%和21.2%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到86.3%,綜合了4 款威士忌中風(fēng)味物質(zhì)的大部分信息。
由圖3a可看出,4 款威士忌分別位于圖的不同區(qū)域,表明4 款威士忌各具獨(dú)特的風(fēng)味特點(diǎn)。PC1方差貢獻(xiàn)率最高,其中山崎威士忌位于PC1正半軸,麥卡倫威士忌位于PC1負(fù)半軸,兩款威士忌明顯區(qū)分,說明不同酒廠生產(chǎn)的威士忌存在較大的差異性。載荷圖如圖3b所示,乙酸乙酯、苯甲酸乙酯等11 種酯類、5 種醇類物質(zhì)及7 種其他物質(zhì)在PC1正半軸的載荷矩陣大于0.9,與山崎威士忌呈正相關(guān)。反式-橙花叔醇、金合歡醇、月桂醇及乙酸苯乙酯4 種風(fēng)味物質(zhì)在PC1負(fù)半軸的載荷矩陣大于0.9,與麥卡倫威士忌呈正相關(guān)。載荷圖表明山崎威士忌具有更加豐富的風(fēng)味物質(zhì)組成,麥卡倫威士忌的香氣特點(diǎn)則更加單一純凈。影響單一麥芽威士忌風(fēng)味的因素較多,如麥芽類型、蒸餾方式等[9]。據(jù)官方披露的資料顯示,山崎蒸餾廠使用大量木桶進(jìn)行開放式發(fā)酵,保證酵母等微生物能夠產(chǎn)生更豐富的風(fēng)味物質(zhì)[32]。山崎配備了多種不同類型的蒸餾器和橡木桶,為山崎威士忌獨(dú)特的風(fēng)味特點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。麥卡倫蒸餾廠則使用小巧精細(xì)的蒸餾設(shè)備,只摘取少量酒液作為酒心,并且?guī)缀跛性贫荚谘├蛲爸惺斐桑瑥亩炀土他溈▊愅考杉儍舻南銡馓攸c(diǎn)。PC2方差貢獻(xiàn)率占21.2%,僅壬醛、月桂酸乙酯、丙位癸內(nèi)酯、異戊醛4 種風(fēng)味化合物在PC2中載荷矩陣大于0.9,說明桶齡可能是威士忌風(fēng)味品質(zhì)的次要影響因素。Kew等[33]認(rèn)為陳釀時(shí)間雖然會(huì)改變威士忌中的化學(xué)組成,但不同橡木桶的活性對(duì)威士忌的影響同樣至關(guān)重要。因此,生產(chǎn)威士忌時(shí)也應(yīng)充分考慮橡木桶帶來的影響。
4 款威士忌樣品中,S-1位于得分圖的第1象限,與2-戊酮、1-癸醇等物質(zhì)比較接近,賦予S-1甜味、果酒味、柑橘味等風(fēng)味特點(diǎn)。S-2威士忌位于第4象限,與2-甲基-3-戊酮、反式-2-壬烯醛等物質(zhì)比較接近,賦予S-2黃油味、薄荷味等風(fēng)味特點(diǎn)。M-1位于第3象限,與正辛醛、十三醛等物質(zhì)接近,賦予M-1更濃郁的柑橘味。M-2位于第2象限,與大馬士酮、乙酸苯乙酯等物質(zhì)接近,賦予M-2更濃郁的花香味。
本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃取提取4 款威士忌中的揮發(fā)性成分,通過GC-MS共篩選出243 種揮發(fā)性化合物,結(jié)合OAV進(jìn)一步分析,篩選出58 種風(fēng)味化合物及其風(fēng)味特點(diǎn)。山崎威士忌含有OAV更高的異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、1-癸醇等物質(zhì),表現(xiàn)出更明顯的果香味。麥卡倫威士忌含有OAV更高的乙酸苯乙酯、金合歡醇、反式-橙花叔醇等物質(zhì),呈現(xiàn)更明顯的花香味。二維層次聚類分析有效區(qū)分了麥卡倫威士忌與山崎威士忌,明確了山崎威士忌與麥卡倫威士忌中的風(fēng)味物質(zhì)差異及其風(fēng)味特點(diǎn)。PCA結(jié)果表明4 款威士忌各具特點(diǎn),不同酒廠生產(chǎn)的威士忌風(fēng)味組分之間存在較大的差異性,這是威士忌生產(chǎn)過程中眾多因素影響的結(jié)果。威士忌的風(fēng)味比較復(fù)雜,呈現(xiàn)果香、花香、油香等特點(diǎn),但風(fēng)味物質(zhì)的來源及組成尚不完全清晰,后續(xù)工作可結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的生成機(jī)理,優(yōu)化生產(chǎn)工藝,進(jìn)一步提升國產(chǎn)威士忌的品質(zhì)。