陳 鵬,鐘瑜娜,于轢文,胡 瑾,謝梅英
(廣東生態(tài)工程職業(yè)學院,廣東 廣州 510520)
哺乳動物腸炎是由循環(huán)系統(tǒng)中的促炎癥細胞因子,如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素(interferon gamma,IFN-γ)和白細胞介素(interleukin,IL)-8等水平升高,引起機體劇烈的炎癥反應,導致腹痛腹瀉,甚至可能有血便,引發(fā)全身并發(fā)癥,如皮疹、關節(jié)疼痛等,嚴重影響人類身體健康[1]。腸上皮細胞作為腸道黏膜的重要組成,能夠阻斷腸道微生物進入人體內(nèi),在腸道免疫功能中扮演著重要角色[2]。以腸上皮細胞炎癥反應和凋亡為代表的腸上皮細胞損傷被認為是腸炎的初始步驟,與腸炎的發(fā)生發(fā)展密切相關[3]。Chen Jiali等[4]利用綠原酸抑制斷奶豬腸上皮細胞炎癥和細胞凋亡,促進腸道發(fā)育;Wang Yunxia等[5]利用葡萄籽多酚抑制腸上皮細胞炎癥和細胞凋亡,抑制硫酸葡聚糖鈉誘導的小鼠結(jié)腸炎;因此,阻斷腸上皮細胞炎癥反應和凋亡可能成為治療腸炎的有效手段。
羅伊氏乳桿菌是一種天然的益生菌,定殖在許多哺乳動物的胃腸道中,對宿主的健康發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[6]。給予乙酸誘導潰瘍性大腸炎的大鼠5×107~7×107CFU/g劑量的羅伊氏乳桿菌,可有效阻止?jié)冃源竽c炎的發(fā)展[7],但目前對于羅伊氏乳桿菌阻抑制腸炎發(fā)生的機制尚不清晰。
微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)是目前研究最多的一種非編碼小RNA,其作用的機制是通過抑制mRNA的翻譯或降解mRNA調(diào)節(jié)基因表達,在個體生長、發(fā)育、免疫、代謝等多種生物進程中發(fā)揮作用[8],對人類疾病治療有重要意義。研究表明,miRNA也與腸道微生物群-宿主的相互作用密切相關,如野生型小鼠和無菌小鼠的盲腸黏膜中存在16 種差異表達的miRNAs,這些miRNAs的功能主要與腸屏障和免疫調(diào)節(jié)有關[9]。因此本實驗擬探究羅伊氏乳桿菌是否通過改變宿主miRNAs表達調(diào)控腸上皮細胞炎癥反應和凋亡及其相關調(diào)控機制。
小鼠腸上皮細胞MODE-K和人腎上皮細胞293T購自ATCC公司;羅伊氏乳桿菌I5007由中國農(nóng)業(yè)大學譙仕彥教授團隊從健康豬腸道分離,本研究所使用羅伊氏乳桿菌I5007(簡稱羅伊氏乳桿菌)為譙仕彥教授團隊贈予。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1),野生型及突變型PDCD4雙熒光素酶pmirGLO質(zhì)粒,miR-196a mimics、inhibitor及對照均由北京擎科生物科技股份有限公司構(gòu)建或合成。
脂質(zhì)體3000、L2630脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)美國Sigma公司;胎牛血清、DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶 美國Gibco公司;pmirGLO質(zhì)粒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 美國Promega公司;IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 武漢華美生物技術(shù)有限公司;PDCD4抗體 美國CST公司;RNA快速提取試劑盒 廣州美基生物科技公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒日本TaKaRa公司。
CFX96熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀、12003153凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;NanoDrop One分光光度計、I160細胞培養(yǎng)箱美國Thermo Fisher Scientific公司;DMi8倒置顯微鏡德國Leica公司。
1.3.1 細胞培養(yǎng)及處理
首先腸上皮細胞按照3×105個/孔的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板,細胞貼壁后約30%匯合;待細胞匯合至50%后,轉(zhuǎn)染miR-196a inhibitor、mimics或PDCD4的pcDNA3.1過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1質(zhì)粒通過自身攜帶的CMV啟動子可在大多數(shù)細胞中對質(zhì)粒中插入基因的過表達),繼續(xù)培養(yǎng);待細胞匯合達到90%后,使用108CFU/mL的羅伊氏乳桿菌處理細胞5 h,然后更換含有1 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)處理細胞24 h,用于檢測細胞炎癥反應和凋亡。對照組為在培養(yǎng)基中添加和實驗組等體積的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)。
1.3.2 ELISA檢測炎癥因子水平
按照IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒操作步驟檢測細胞培養(yǎng)基中相關炎癥因子水平。
1.3.3 免疫熒光染色
用體積分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液固定不同處理條件的腸上皮細胞10 min,用PBS浸洗3 遍,5%羊血清封閉1 h,加入Cleaved Caspase-3抗體(稀釋比1∶200),4 ℃過夜孵育,用PBS浸洗3 遍,每遍5 min,按1∶1 000的稀釋比加入熒光二抗Alexa Fluor 594,室溫避光孵育1 h,按1∶2 000加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)細胞核染色劑,室溫孵育5 min,PBS浸洗后在熒光顯微鏡下觀察。
1.3.4 實時PCR(real-time PCR)
按照RNA快速提取試劑盒操作說明提取小鼠腸上皮細胞RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用于后續(xù)real-time PCR擴增。取cDNA 0.4 μL加入上下游引物各0.8 μL、SYBR Green Premix 10 μL和雙蒸水8 μL組成20 μL反應體系,置于PCR儀中按照設定的反應條件進行擴增,反應條件:94 ℃預變性60 s;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,35 個循環(huán);最后72 ℃延伸2 min。采用2-ΔΔCT法分別以U6和GAPDH計算目的基因表達水平。相關基因引物序列見表1。
表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in real-time PCR
1.3.5 miRNA篩選及miR-196a靶基因預測
首先通過基因表達綜合(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫下載LPS誘導腸上皮細胞炎癥反應的miRNA測序數(shù)據(jù),并通過GOR2R軟件進行差異表達miRNAs分析,real-time PCR檢測表達變化倍數(shù)前10的miRNAs在正常腸上皮細胞、LPS誘導炎癥反應的腸上皮細胞、羅伊氏乳桿菌和LPS共處理的腸上皮細胞中水平,篩選正常腸上皮細胞與羅伊氏乳桿菌和LPS共處理的腸上皮細胞中進行驗證表達一致,且兩組內(nèi)miRNA表達水平與LPS誘導炎癥反應的腸上皮細胞中表達存在差異的miRNAs。然后通過TargetScan數(shù)據(jù)庫分析miR-196a下游靶基因,利用GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載LPS處理的小鼠腸上皮細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(GSE139903),通過GEO2R軟件分析發(fā)現(xiàn):LPS處理后小鼠腸上皮細胞基因表達變化倍數(shù)排名前20的基因中,僅PDCD4基因是TargetScan數(shù)據(jù)庫預測的miR-196a下游靶基因,因此選擇PDCD4作為miR-196a下游靶基因進行驗證,使用RNA Hybird分析miR-196a與PDCD4基因3′非翻譯區(qū)(3′ untranslated region,3?UTR)的結(jié)合位點。
1.3.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>
293T細胞采用含有10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期293T細胞以20 000 個/孔接種于24 孔板,進行雙熒光素酶實驗。根據(jù)雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的不同進行分組,設置野生型質(zhì)粒(pmirGLO-PDCD4-WT)、突變型質(zhì)粒(pmirGLO-PDCD4-Mut)和空質(zhì)粒(pmirGLO)分別與miRNA陰性對照或miR-196a mimics共同轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染48 h后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作步驟檢測熒光素酶活性。pmirGLO載體包含螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因,其中海腎熒光素酶基因有獨立的啟動子和3′UTR,能夠穩(wěn)定表達海腎熒光素酶蛋白,是pmirGLO載體轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參基因;而螢火蟲熒光素酶基因的3′UTR包含多酶切位點,可進行同源重組,將靶基因3′UTR插入螢火蟲熒光素酶基因下游后,通過觀察miRNA對螢火蟲熒光素酶活性的影響,判斷miRNA和基因是否存在靶向關系。
1.3.7 Western blotting(WB)
按照蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白,Bradford法進行蛋白定量,12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,加入兔抗鼠PDCD4(稀釋比1∶1 000)抗體孵育過夜,PBS洗膜后加入過氧化物酶偶聯(lián)的二抗,37 ℃孵育2 h,PBS清洗后,用化學發(fā)光系統(tǒng)檢測目的條帶,以GAPDH抗體(稀釋比1∶1 000)作內(nèi)參照。
ELISA實驗結(jié)果表明,與對照組相比,LPS處理后腸上皮細胞促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌顯著增加,羅伊氏乳桿菌和LPS共處理后,羅伊氏乳桿菌抑制了腸上皮細胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌(圖1A)。免疫熒光染色結(jié)果表明,與對照組相比,LPS處理的腸上皮細胞中細胞凋亡相關蛋白Caspase-3表達顯著上調(diào),羅伊氏乳桿菌顯著抑制LPS引起的腸上皮細胞凋亡相關蛋白Caspase-3表達的上調(diào)(圖1B、C)。上述結(jié)果表明羅伊氏乳桿菌能夠阻斷腸上皮細胞炎癥反應和凋亡。
圖1 羅伊氏乳桿菌緩解LPS誘導的腸上皮細胞炎癥反應和細胞凋亡Fig.1 Lactobacillus reuteri alleviated LPS-induced inflammation and apoptosis in intestinal cells
由圖2A可知,與小鼠腸上皮細胞相比,LPS誘導細胞炎癥反應后,miR-196a水平降低82.14%(變化程度排名第2);羅伊氏乳桿菌和LPS共處理后,其細胞miR-196a水平較LPS處理細胞中miR-196a水平上調(diào)16.5 倍(變化程度排名第1),GEO測序數(shù)據(jù)和定量分析結(jié)果均表明miR-196a在此過程中變化最為顯著,miR-196a可能在LPS引起的腸上皮細胞炎癥反應、細胞凋亡和羅伊氏乳桿菌緩解LPS毒性過程中均發(fā)揮重要調(diào)控作用,且miR-196a在腸上皮細胞炎癥反應和凋亡中的功能鮮有報道。因此,利用羅伊氏乳桿菌和LPS共同處理抑制腸上皮細胞中miR-196a的表達(圖2B),結(jié)果表明干擾miR-196a表達后,羅伊氏乳桿菌抑制LPS引起的腸上皮細胞凋亡和炎癥反應的作用消失(圖2C~E),表明羅伊氏乳桿菌可能通過上調(diào)腸上皮細胞中miR-196a的表達,抑制細胞炎癥反應和凋亡。
圖2 羅伊氏乳桿菌緩解腸上皮細胞損傷依賴miR-196aFig.2 Lactobacillus reuteri alleviated intestinal epithelial cell injury by miR-196a
為進一步解析miR-196a腸上皮細胞炎癥反應和凋亡的分子機制,本研究通過TargetScan網(wǎng)站對miR-196a的靶基因進行分析預測,并與LPS誘導腸上皮細胞炎癥和凋亡模型的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)比對,發(fā)現(xiàn)miR-196a與PDCD4可能存在靶向結(jié)合(圖3A),且PDCD4在LPS誘導炎癥反應的腸上皮細胞中表達上調(diào),羅伊氏乳桿菌和LPS共處理抑制LPS引起的PDCD4表達上調(diào)(圖3B)。使用RNAhybrid 2.2在線網(wǎng)站分析miR-196a與PDCD43′UTR結(jié)合自由能情況,結(jié)果顯示二者的結(jié)合自由能較低(圖3C),miR-196a與PDCD4可能存在靶向結(jié)合。在腸上皮細胞中過表達miR-196a,可減少PDCD4 mRNA和蛋白含量;與之相反,在干擾miR-196a表達的腸上皮細胞中,PDCD4 mRNA和蛋白水平上調(diào)(圖3D、F)。此外,在293T細胞中開展的雙熒光素酶報告基因結(jié)果表明,miR-196a顯著抑制包涵PDCD4野生型3′UTR的pmirGLO載體熒光素酶活性,但對包涵PDCD4突變型3′UTR的pmirGLO載體熒光素酶活性無影響(圖3G)。上述結(jié)果表明miR-196a靶向抑制PDCD4表達。
圖3 miR-196a靶向抑制PDCD4表達Fig.3 Targeted inhibition of PDCD4 expression by miR-196a
為驗證miR-196a是否通過靶向PDCD4抑制腸上皮細胞炎癥反應和凋亡,在過表達miR-196a的腸上皮細胞中觀察過表達PDCD4對腸上皮細胞炎癥反應和凋亡的影響。ELISA結(jié)果表明,與LPS處理組相比,miR-196a過表達顯著抑制LPS誘導腸上皮細胞炎癥因子分泌;而過表達PDCD4后逆轉(zhuǎn)了miR-196a對腸上皮細胞炎癥因子分泌的抑制作用(圖4A)。進一步的免疫熒光實驗結(jié)果表明,與LPS處理組相比,miR-196a過表達后顯著抑制腸上皮細胞中細胞凋亡相關蛋白Caspase-3表達,PDCD4的過表達消除miR-196a對Caspase-3表達的抑制作用(圖4B、C)。
圖4 miR-196a通過PDCD4抑制腸上皮細胞炎癥反應和細胞凋亡Fig.4 MiR-196a inhibited inflammation and apoptosis in intestinal cells by targeting PDCD4
腸道不僅是人體消化、吸收、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運的主要器官,也是體內(nèi)最大的免疫器官和“細菌庫”,位于連接機體內(nèi)外環(huán)境的核心位置,對維持人體健康生長具有重要作用[10]。腸道黏膜作為機體免疫的第一道防線,在抵抗天然毒素、腸道共生菌群和入侵的病原體引起的腸道炎癥反應中扮演著重要角色[11]。腸炎是一種腸黏膜免疫系統(tǒng)紊亂性疾病[12],由遺傳因素、上皮屏障受損、腸道菌群失調(diào)等因素相互作用導致[13]。雖然,抗生素等藥物治療可緩解腸炎,但由于抗生素治療容易導致細菌產(chǎn)生耐藥性,所以腸炎極易復發(fā)[14-15]。因此,探究腸炎的發(fā)生發(fā)展機制、開發(fā)利用高效無副作用的生物制劑,對于防治腸炎具有緊迫的研究意義。
腸道微生物群被認為是調(diào)節(jié)宿主健康的關鍵因素之一[16]。益生菌是一種對宿主健康有益的微生物,它通過調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系和腸道免疫等方式抑制病原微生物對腸道健康的損害。Kim等[17]研究表明,短乳桿菌KU15152對HT-29細胞有較強的黏附力,其通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和糖原合酶激酶抑制核因子-κB的活化,從而減輕金黃色葡萄球菌脂磷壁酸誘導的腸道炎癥反應。戊糖片球菌ZY-B通過上調(diào)緊密連接蛋白的表達改善腸屏障功能障礙,并下調(diào)大麻素受體1和大麻素受體2表達,降低小鼠回腸、盲腸和結(jié)腸的副溶血性弧菌含量,從而防止結(jié)腸萎縮,增強黏膜完整性[18]。此外,副益生菌嗜酸乳桿菌PIN7可通過調(diào)節(jié)TLR-6介導的免疫反應和腸道菌群組成,改善葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結(jié)腸炎[19]。羅伊氏乳桿菌I5007最初從仔豬的結(jié)腸中分離出來,能夠上調(diào)豬小腸上皮細胞緊密連接蛋白和防御肽的表達,進而增強豬腸道免疫功能[20-21]。同時,羅伊氏乳桿菌可以預防和治療人腸道菌群紊亂引起的腸道不適,具有益生功能,但相關機制未明。本研究發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌減輕LPS引起的腸上皮細胞凋亡和炎癥反應,可開發(fā)為促進腸道健康的生物制劑。
miRNA是一種對哺乳動物細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄翻譯進行調(diào)控的非編碼小RNA,盡管不直接編碼蛋白質(zhì),但卻通過對靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯進行調(diào)控間接參與哺乳動物細胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡[22]。前期研究發(fā)現(xiàn),miR-196a在骨肉瘤細胞中表達上調(diào),從而抑制骨肉瘤細胞凋亡,促進骨肉瘤細胞的增殖及成瘤能力[23];此外,miR-196a通過抑制RAN結(jié)合蛋白10表達改善神經(jīng)元形態(tài),為亨廷頓舞蹈癥患者提供神經(jīng)保護[24]。本研究發(fā)現(xiàn),LPS誘導腸上皮細胞凋亡和炎癥反應過程中miR-196a表達下調(diào),而羅伊氏乳桿菌通過增加細胞miR-196a含量抑制腸上皮細胞凋亡和炎癥反應。
PDCD4是Shibahara等[25]在誘導凋亡的鼠細胞中發(fā)現(xiàn)的具有MA-3功能域的新基因。PDCD4是進化上高度保守的基因,廣泛表達于多種組織和器官,細胞凋亡和炎性疾病的發(fā)生密切相關[26]。在心臟缺血再灌注誘導心肌細胞凋亡過程中PDCD4基因表達升高,靶向抑制心肌細胞中PDCD4蛋白的表達,可顯著減少心肌細胞凋亡[27];PDCD4蛋白在高濃度葡萄糖誘導凋亡的血管內(nèi)皮細胞中表達上調(diào),干擾PDCD4基因表達顯著抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡[28]。此外,在腸缺血再灌注過程中,腸上皮細胞的炎癥反應和凋亡是由于miR-21表達下調(diào),其靶基因PDCD4表達增加導致[29]。產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素感染腸上皮細胞后通過抑制miR-21上調(diào)PDCD4表達,從而誘導細胞凋亡和炎癥反應[30];而在結(jié)直腸癌細胞中PDCD4基因表達降低,而miR-196a表達增加,miR-196a通過靶向PDCD4抑制結(jié)直腸癌細胞凋亡。這些研究表明靶向調(diào)控PDCD4表達可影響細胞凋亡[31]。
本實驗中羅伊氏乳桿菌通過上調(diào)腸上皮細胞miR-196a表達,下調(diào)miR-196a靶基因PDCD4表達,抑制LPS引起的腸上皮細胞炎癥反應和凋亡。研究結(jié)果為開發(fā)羅伊氏乳桿菌成為促進腸道健康發(fā)育的功能添加劑提供了理論支撐。