孫文鑫,郭俞利,劉祖國,3

0引言

干眼(dry eye,DE)是多因素引起的慢性眼表疾病,是由淚液的質(zhì)、量及動力學(xué)異常導(dǎo)致的淚膜不穩(wěn)定或眼表微環(huán)境失衡,可伴有眼表炎癥反應(yīng),組織損傷及神經(jīng)異常,造成眼部多種不適癥狀,嚴(yán)重時可引起視功能障礙[1]。目前,我國按照淚液的主要成分和淚液動力學(xué)因素將干眼分為5類,分別是水液缺乏型干眼、脂質(zhì)異常型干眼、黏蛋白異常型干眼、淚液動力學(xué)異常型干眼及混合型干眼[2]。既往研究表明,DE是一種炎癥性疾病,與自身免疫性疾病有許多共同特征。相關(guān)基礎(chǔ)研究表明,干眼是眼表的非感染性炎癥[3]。環(huán)境因素、內(nèi)源性應(yīng)激和抗原等應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是DE的觸發(fā)機制。眼表免疫系統(tǒng)被激活,免疫細(xì)胞浸潤到眼表組織,分泌多種免疫分子造成眼表炎癥反應(yīng),加劇眼表損傷。本文就干眼的免疫機制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述并重點討論獲得性免疫在DE的啟動與維持。

1天然免疫

角膜上皮細(xì)胞位于眼表的最外層,并與環(huán)境直接接觸[4]。長期暴露于多種環(huán)境應(yīng)激下引起淚膜不穩(wěn)定性增加最終導(dǎo)致眼表高滲狀態(tài),引起角膜上皮細(xì)胞損傷和天然免疫炎癥反應(yīng)發(fā)生,最終導(dǎo)致眼表疾病[5]。環(huán)GMP-AMP合成酶(cGAS)刺激因子(STING)通路是近年來通過識別細(xì)胞質(zhì)DNA發(fā)現(xiàn)的一種炎癥信號通路[6-7]。在各種應(yīng)激條件下,來自細(xì)胞核和線粒體的DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中[8],cGAS識別細(xì)胞質(zhì)雙鏈DNA(dsDNA)并產(chǎn)生稱為2’3’-cGAMP的第二信使,該信使進(jìn)一步激活STING的表達(dá)和易位,誘導(dǎo)TBK1(p-TBK1)和IRF3(p-IRF3)磷酸化,進(jìn)一步介導(dǎo)下游炎癥細(xì)胞因子(IFN-a/β和CXCL10)的釋放[9]。我們團(tuán)隊的最新研究發(fā)現(xiàn),高滲應(yīng)激(HS)介導(dǎo)線粒體DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中可能通過cGAS-STING信號通路引起炎癥。這項研究提供了線粒體DNA感應(yīng)激活cGAS-STING信號通路的證據(jù),該通路在兩個實驗性干眼模型(BAC誘導(dǎo)的小鼠眼表損傷模型和手術(shù)摘除淚腺的干眼小鼠模型),干眼患者樣本以及暴露于HS培養(yǎng)的HCE中介導(dǎo)眼表炎癥反應(yīng)[10]。這一研究證實了角膜上皮細(xì)胞在DE炎癥反應(yīng)啟動中的新作用,這一與天然免疫反應(yīng)相關(guān)的信號通路的識別,可能成為DE潛在的治療靶點。此外,眼表的高滲狀態(tài)早期通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)應(yīng)激信號通路,啟動一系列反應(yīng)破壞角膜上皮細(xì)胞屏障功能。產(chǎn)生的活性氧(ROS)抑制了磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11],導(dǎo)致眼表上皮細(xì)胞受損或死亡,同時通過Toll樣受體4(TLR4)、Nod樣受體蛋白-3(NLRP3)炎癥小體等向天然免疫細(xì)胞傳遞炎癥信號,產(chǎn)生炎癥因子導(dǎo)致眼表炎癥[12]。大量研究表明,干眼狀態(tài)下淚液和角膜組織中炎癥細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等表達(dá)水平增高[13]。

干眼導(dǎo)致眼表組織發(fā)生損傷后,角膜上皮細(xì)胞首先啟動了免疫炎癥反應(yīng),隨后眼表的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等先后活化,這些天然免疫細(xì)胞的活化,一方面擴(kuò)大了眼表炎癥級聯(lián)反應(yīng),造成眼表損傷;另一方面促進(jìn)了自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與分化,激活獲得性免疫反應(yīng)。T細(xì)胞活化后又可以分泌多種炎癥因子和趨化因子繼續(xù)促進(jìn)天然免疫反應(yīng)的發(fā)生,形成惡性循環(huán)(圖1)。因此,了解DE發(fā)生發(fā)展時的病理過程有助于為DE的治療提供新靶點。

2獲得性免疫

獲得性免疫(acquired immunity)是指體內(nèi)抗原特異性T/B淋巴細(xì)胞接受抗原刺激后,自身活化、增殖、分化為效應(yīng)細(xì)胞,產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的全過程(圖2)。根據(jù)參與免疫應(yīng)答細(xì)胞種類及其機制的不同,可將獲得性免疫反應(yīng)分為B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答兩種類型[14]。T細(xì)胞是不均一的細(xì)胞群體,根據(jù)其表面標(biāo)志及功能特點,可分為不同的T細(xì)胞類別及其亞群。在本篇綜述中,我們根據(jù)T細(xì)胞抗原受體(TCR)分類將T細(xì)胞分為TCRαβT細(xì)胞和TCRγδT細(xì)胞,并分別介紹這兩類T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在DE病理中的作用。

2.1TCRαβT細(xì)胞細(xì)胞免疫是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在清除癌變組織和病原體入侵中發(fā)揮重要作用。在既往臨床和基礎(chǔ)研究中觀察到DE患者和小鼠結(jié)膜中有T細(xì)胞的浸潤,提示T細(xì)胞參與了干眼的病理過程[15],但具體的T細(xì)胞亞群特征及功能有待闡明。近期一項研究特異性地分離了DE小鼠的結(jié)膜,并通過高通量TCR測序來揭示DE發(fā)生時的TCR序列。與對照組小鼠相比,干眼小鼠結(jié)膜αβT細(xì)胞受體(αβTCR)的α鏈和β鏈克隆型明顯增加。TCRα鏈和β鏈的互補決定區(qū)3區(qū)(CDR3)氨基酸長度較健康對照組顯著增多[16]。αβT細(xì)胞亞群占T細(xì)胞群體的65%-70%,其表面的TCRs由α鏈和β鏈兩條糖蛋白鏈組成,具有主要組織相容性復(fù)合物(MHC)介導(dǎo)的特異性識別抗原細(xì)胞毒功能[17]。該研究進(jìn)一步證實了DE是一種主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,αβT細(xì)胞亞群參與了DE的發(fā)展并為DE的治療提供了新靶點。

目前關(guān)于DE獲得性免疫應(yīng)答的研究主要集中在CD4+T細(xì)胞。T細(xì)胞在眼表浸潤的場所主要為結(jié)膜。CD4+T細(xì)胞可以通過淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(LFA-1)黏附在眼表組織中并促進(jìn)DE炎癥發(fā)生現(xiàn)已成為DE的治療靶點[18]。一項來自新加坡的臨床研究對健康個體和DE患者結(jié)膜樣本中的T細(xì)胞進(jìn)行了分析,研究者通過收集結(jié)膜印記細(xì)胞學(xué)樣本對來自健康供體的T細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞具有明顯的優(yōu)勢[19]。此外,研究還發(fā)現(xiàn)健康人的結(jié)膜中含CD8+/CD69+/CD103+/CCR7-T淋巴細(xì)胞。利用一系列T細(xì)胞特異性的表面標(biāo)記物,研究者進(jìn)一步分析了52例DE患者眼表存在的不同T細(xì)胞亞群。根據(jù)特異性標(biāo)記物,可以將這些DE患者分為兩種類型：第一類DE患者有較高的眼紅發(fā)生率,結(jié)膜中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量明顯升高;第二類DE患者的淚膜不穩(wěn)定性增加,結(jié)膜中CD4+T細(xì)胞的比例更高,研究結(jié)果表明大部分患者屬于第二類。因此,與健康眼部組織樣本中的T細(xì)胞相比,DE發(fā)生時T細(xì)胞群的再分配導(dǎo)致了其發(fā)病機制的復(fù)雜性[19]。近期的一項基礎(chǔ)研究評估了CD4+T細(xì)胞在苯扎氯銨(BAC)誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠眼表損傷中的致病作用。研究結(jié)果表明,與正常組相比,通過BAC誘導(dǎo)可以引起CD4+CD69+,CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+細(xì)胞數(shù)量增加,并且伴有IFN-γ、IL-17、Th1、Th17以及轉(zhuǎn)錄因子T-bet和RORγt的增加。此外,BAC還可以引起眼表損傷,包括角膜屏障功能受損,結(jié)膜杯狀細(xì)胞丟失和淚液生成減少。從BAC誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)特異性地分離出CD4+T細(xì)胞并過繼轉(zhuǎn)接到裸鼠體內(nèi),可導(dǎo)致與直接局部BAC處理相似的眼表表現(xiàn),具體包括了CD4+T細(xì)胞、IFN-γ、IL-17的增加以及眼表損傷[20]。干燥綜合征相關(guān)DE(ssDE)發(fā)生時伴有淚腺、結(jié)膜和瞼板腺上皮細(xì)胞的自身免疫性炎癥反應(yīng),并且產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞可以通過穿孔素-顆粒酶途徑破壞角膜上皮[21]。由此可見,深入研究CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在DE發(fā)生發(fā)展中的具體作用,對于DE免疫炎癥方面的治療具有重要指導(dǎo)意義。

輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)是一種能夠分泌白介素17(interleukin17,IL-17)的T細(xì)胞亞群,在自身免疫性疾病和機體防御反應(yīng)中具有重要的意義。Th17細(xì)胞在淋巴組織中分化擴(kuò)增后遷移到眼表并釋放炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮致病作用,引起角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞凋亡,瞼板腺基底腺泡細(xì)胞增殖和脂質(zhì)生成異常,以及神經(jīng)退行性改變[22]。隨著急性期的消退,記憶性Th17細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生的IL-17可維持DE發(fā)生時眼表慢性炎癥反應(yīng),局部阻斷IL-17可顯著緩解DE癥狀[23]。Th17細(xì)胞除了可以直接引起眼表組織損傷外,還可以通過放大炎癥反應(yīng)介導(dǎo)DE病理過程導(dǎo)致惡性循環(huán),IL-17可以有效地誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8,引起眼表炎癥級聯(lián)反應(yīng),進(jìn)一步招募中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞并激活抗原提呈細(xì)胞(antigenpresenting cells,APCs)[24]。在由過敏性疾病導(dǎo)致的瞼板腺功能障礙的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞向結(jié)膜聚集,在導(dǎo)致瞼板腺阻塞中起核心作用,阻斷Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)可以顯著減少瞼板腺阻塞的發(fā)生[25]。同時APCs和CD4+T細(xì)胞通過免疫突觸在淋巴結(jié)中相互作用,產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子,刺激CD4+T細(xì)胞分化為不同類型的T細(xì)胞亞群。Th17產(chǎn)生的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)主要通過促進(jìn)眼表APCs的成熟和遷移促進(jìn)DE眼表炎癥反應(yīng),有研究表明DE發(fā)生時淚液中GM-CSF水平升高[26]。此外,免疫系統(tǒng)也會隨著年齡的增長而發(fā)生著各種變化,導(dǎo)致全身各個系統(tǒng)慢性低水平炎癥狀態(tài)和自身免疫的風(fēng)險增加[27]。由于DE在中老年患者中更為普遍和嚴(yán)重。因此可以推測Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)的發(fā)生和衰老之間具有密切的聯(lián)系。同時有研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長,Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)增強[28]。Th17細(xì)胞一方面從淋巴組織遷移到眼表發(fā)揮致病作用,另一方面通過參與角膜淋巴管生成促進(jìn)APCs從眼表運輸?shù)揭髁馨徒M織激活免疫反應(yīng),同時還可以促進(jìn)生發(fā)中心的形成,誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖,因此具有高度致病性。

圖1 天然免疫在DE病理發(fā)展中的作用(本圖由Figdraw繪制)。

圖2 獲得性免疫在DE病理發(fā)展中的作用(本圖由Figdraw繪制)。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg細(xì)胞)作為眼表微環(huán)境的重要組成部分,可以通過多種機制抑制免疫炎癥反應(yīng)的形成。Treg細(xì)胞在誘導(dǎo)機體免疫耐受,調(diào)節(jié)機體免疫平衡方面起著重要作用。Treg細(xì)胞免疫防御功能受損或數(shù)量減少會破壞眼表免疫穩(wěn)態(tài)進(jìn)而引起多種眼表疾病。近年來,越來越多的研究證據(jù)表明,Treg細(xì)胞相關(guān)免疫療法在DE治療中具有潛力。有研究發(fā)現(xiàn),增加淚腺中趨化因子CCL22的局部釋放來誘導(dǎo)內(nèi)源性Treg細(xì)胞聚集可以有效減少淋巴組織中CD4+T細(xì)胞的浸潤,減少角膜上皮熒光素鈉染色,增加淚液分泌和結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量。局部增加功能正常的Treg細(xì)胞數(shù)量改善免疫失衡可以有效減輕實驗性動物干眼模型中免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生,從而緩解DE相關(guān)眼表癥狀[29]。此外,靜脈注射色素上皮衍生因子(PEDF)和間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體療法可以抑制Th17細(xì)胞并促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖,增強免疫抑制功能,減輕DE嚴(yán)重程度[30]。由此可見,Treg細(xì)胞參與了獲得性免疫反應(yīng),并在DE病理進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

2.2TCRγδT細(xì)胞γδT細(xì)胞是T細(xì)胞的一個亞群,占外周血液T細(xì)胞總數(shù)的5%以下,主要分布在皮膚、小腸、食管、肺、生殖器及皮下組織,是皮膚表皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和黏膜組織上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的主要成分之一[31-33]。γδT細(xì)胞雖然具有T細(xì)胞表面受體,但在功能上主要參與天然免疫反應(yīng),可以不受MHC限制而識別多肽抗原和磷酸鹽抗原[34]。研究表明,γδT細(xì)胞是病毒感染早期受累器官中的重要細(xì)胞因素,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦膜炎)和腸道(結(jié)膜炎)等自身免疫性疾病的炎癥中扮演重要角色[35]。γδT細(xì)胞作為重要的效應(yīng)性T細(xì)胞,目前對其生物學(xué)意義的認(rèn)識尚處于起始階段。既往研究表明：Th17細(xì)胞在IL-17A介導(dǎo)的干眼免疫發(fā)病機制中發(fā)揮主要作用。陳蔚教授團(tuán)隊近期研究發(fā)現(xiàn),正常小鼠結(jié)膜中分泌IL-17A的細(xì)胞分群中,高達(dá)近60%的細(xì)胞是γδT細(xì)胞;同時結(jié)膜中γδT細(xì)胞比例與干眼的嚴(yán)重程度呈正相關(guān);消除γδT細(xì)胞后,干眼小鼠眼表癥狀減輕[36]。該研究評估了人類和實驗性小鼠DE中γδT細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并強調(diào)了靶向IL-17和γδT細(xì)胞在DE治療中的潛在協(xié)同作用。

2.3B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞簡稱B細(xì)胞,是由骨髓中的造血干細(xì)胞分化發(fā)育而來。B細(xì)胞在抗原刺激下可分化為漿細(xì)胞,在免疫監(jiān)控和應(yīng)對病原體入侵中扮演著核心角色[37]。為了維持眼表穩(wěn)態(tài),位于眼表的漿細(xì)胞可以不斷地釋放分泌性IgA,成為黏膜保護(hù)中最重要的體液成分之一。同時IgA還可以限制眼部微生物群侵入到深層組織。B細(xì)胞已被用于研究自身免疫性來源的眼部疾病,包括干燥綜合征[38]和葡萄膜炎[39]。使用抗CD20抗體耗竭B細(xì)胞已被用于眼部疾病的治療,這表明B細(xì)胞參與了自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展,但在DE免疫調(diào)節(jié)機制中的具體作用目前還沒有明確的共識。

3小結(jié)與展望

眼部組織中包含了大量的免疫細(xì)胞,分布在眼表的免疫細(xì)胞維持了微環(huán)境的穩(wěn)態(tài),從而避免了不必要的組織損傷。近期有研究探討了免疫炎癥反應(yīng)在DE中的作用,并重點討論了DE、炎癥和瞼板腺功能障礙之間的惡性循環(huán)關(guān)系[40]。另外有針對DE發(fā)生的早期階段進(jìn)行的研究,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽在DE炎癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,通過抑制神經(jīng)肽可能防止DE的惡化和進(jìn)展[41]。上述研究對于DE的發(fā)病機制提出了新見解,但均沒有對DE發(fā)生發(fā)展的全過程進(jìn)行詳細(xì)的描述。在本篇綜述,我們描述了DE發(fā)生時眼表免疫反應(yīng)的激活過程：當(dāng)眼表的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞時,按照發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)的時間順序,角膜上皮細(xì)胞首先啟動天然免疫反應(yīng),隨后激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞參與眼表損傷。當(dāng)刺激因素持續(xù)存在或再次發(fā)生時,便開始啟動獲得性免疫引起T細(xì)胞和B細(xì)胞的聚集以及大量炎癥因子的產(chǎn)生最終導(dǎo)致DE。在DE診療中,區(qū)分DE所處的免疫反應(yīng)階段對于DE的用藥方案具有指導(dǎo)意義。對于輕度DE患者,主要采用物理治療改善環(huán)境條件以減少天然免疫反應(yīng)的發(fā)生,如減少屏幕使用時間、停止使用高氣流風(fēng)扇以及滴加人工淚液等。中度至重度DE患者則需要進(jìn)行抗炎和免疫抑制等多靶點聯(lián)合治療減輕獲得性免疫反應(yīng)引起的眼表損傷。此外,免疫反應(yīng)在DE病理進(jìn)展的分子基礎(chǔ)、標(biāo)記物發(fā)掘、診斷試劑盒開發(fā)及相應(yīng)階段的治療藥物靶點研究是未來具有前景的研究方向。