王嘉威，賀永超，喬元明，許蘭彬，王紀亭

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271000；2.青島諾安百特生物技術有限公司，山東 青島）

2017年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃》，明確提出要遏制動物源細菌耐藥，保障養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、食品安全、公共衛(wèi)生安全。無抗飼養(yǎng)可以分為三個層次，一是飼料無抗，即全品種全階段飼料不添加抗生素；二是養(yǎng)殖減抗，即養(yǎng)殖過程中減少使用抗生素；三是畜產(chǎn)品無抗，即肉蛋品中無抗生素殘留或未檢出抗生素。在找尋抗生素的替代方案中，噬菌體是目前備受關注的目標之一。噬菌體作為飼料添加劑在飼料中應用的良好效果得到越來越多地關注和認可。

1 噬菌體的研究歷史概述

噬菌體是一種能特異性殺滅細菌的病毒，個體微小，只有在電鏡下才能觀察到它的存在。和普通的病毒一樣，噬菌體不存在細胞結構，不能自身傳代，必須通過微生物方可進行傳代增殖。典型噬菌體基本特征包括一個衣殼包裹的頭部和一個尾部（圖1）。噬菌體分布較廣，只要存在細菌的地方都會存在，例如：河水、土壤、空氣、下水道、動物腸道，甚至南北極都存在噬菌體的身影[1]。噬菌體的發(fā)現(xiàn)已有百年，1915年，細菌學家Twort在做實驗時發(fā)現(xiàn)細菌培養(yǎng)皿上出現(xiàn)空斑，認為可能是一種細菌病毒造成的，但是由于種種原因，沒有繼續(xù)研究下去。直到1917年，加拿大細菌學家d’Herelle，將這種吃細菌的病毒命名為“噬菌體”[2]。1919年，噬菌體首次用于治療痢疾感染，并表現(xiàn)出了良好的效果。1921年，第一次報道了噬菌體用于人類葡萄球菌感染[3]。由此噬菌體治療細菌感染進入了研究人員的視野當中，隨著噬菌體治療細菌性感染影響的逐漸擴大，噬菌體成功應用在黑死病、霍亂、痢疾等疾病的治療[3]。1923年，Eliava微生物與病毒學噬菌體研究所成立；1924年Oswaldo Cruz研究所在巴西成立；美國的Eli Lilly公司等相繼成立。

圖1 噬菌體模式圖

細菌為了自己的生存繁衍，經(jīng)過了無數(shù)的代次升級，終于在2008年，瑞典“新德里1型”第一例超級耐藥菌感染病例的出現(xiàn)，讓人類意識到，抗生素這一“核彈”級武器已經(jīng)讓細菌產(chǎn)生了嚴重的變異。早在2017年，世界衛(wèi)生組織就指出，目前正在研發(fā)的抗生素遠不足以應對多重耐藥性造成的感染與并發(fā)癥，且耐藥性增強的速度遠超抗生素的研發(fā)速度[4]?！读~刀》報告表明，2019年有127萬人直接死于耐藥菌感染，495萬人的死亡與細菌耐藥性感染有關[5]?？傊?，隨著抗生素的濫用以及抗藥性，噬菌體療法在治療人類、動物中的細菌感染，甚至在食品中的生物防治方面均取得了重要進展。

2 噬菌體分類

自然界存在的噬菌體依據(jù)其裂解特性可分為烈性噬菌體和溫和噬菌體，一般情況下只有烈性噬菌體可以用于治療。烈性噬菌體是指注射遺傳物質(zhì)到細菌細胞內(nèi)，能改變宿主細胞的性質(zhì)，大量形成新的噬菌體，最后導致菌體裂解死亡[6]。溫和噬菌體是指有的噬菌體侵入宿主細胞后，其核酸和宿主細胞同步復制，不引起宿主細胞裂解[7]。在噬菌體自發(fā)的或是某些外界環(huán)境條件（如營養(yǎng)、溫度、pH、細菌濃度等）的誘導下，溫和噬菌體也會進入裂解周期，開始裂解宿主菌[8]。

3 噬菌體的優(yōu)勢

與抗生素治療細菌性疾病相比，噬菌體用于防治疾病具有顯著優(yōu)勢。（1）特異性高?？股鼐哂袕V譜性，在其靶向致病菌的同時，也會破壞機體內(nèi)正常的腸道菌群。噬菌體具有高度特異性，其根據(jù)本身吸附部位以及細菌表面受體結構的不同，使得一種噬菌體只針對單一或同一亞型致病菌，而不破壞動物體的正常菌群。（2）共同進化?？股鼐哂袕V譜性，殺死敏感菌的同時，也篩選出抗性菌，抗性菌會大量增殖，從而導致抗生素失去治療作用。噬菌體是一種“活藥”，噬菌體在與細菌相互作用時，可以實現(xiàn)共同進化[9]，裂解耐性菌株。（3）治療效果好?？股刂委煵粫杏诟腥静课?，經(jīng)體內(nèi)代謝失去活性，排出體外，因而時效性短。噬菌體只在感染細菌的部位增殖，少量的噬菌體就可以在感染部位大規(guī)模增殖，快速殺死致病菌。隨著宿主菌的清除，噬菌體失去目標，逐漸排出體外。（4）成本小?？股赜行ё饔冒悬c基本已被發(fā)現(xiàn)，所以研發(fā)新的抗生素時間長，有效性、安全性試驗需要時間長、成本高。噬菌體則沒有此缺點，其分布廣泛、數(shù)量多，相對來說篩選是一個快速過程，篩選一種新的噬菌體通常僅需數(shù)天或數(shù)周的時間。（5）安全性好。噬菌體對人和動物細胞是安全的，不會產(chǎn)生毒性。（6）噬菌體與抗生素的聯(lián)合應用可增強抗生素的治療效果，也可以增強噬菌體的治療效果[10]。（7）為了克服肉制品中大量抗生素殘留，以及人畜的耐藥菌感染問題，可以考慮在養(yǎng)殖環(huán)境噴灑特定的噬菌體，以控制疫情的發(fā)生，減少耐藥菌產(chǎn)生的機會。

4 噬菌體的應用進展

4.1 噬菌體在人類臨床醫(yī)療中的應用

噬菌體首次用于人類疾病的報告是在1931年，d’Herelle描述了有關利用噬菌體治療金黃色葡萄球菌感染的皮膚病的臨床工作[11]。20世紀30年代有大量關于噬菌體應用于人類疾病的文章和專著發(fā)表[12]，其中描述了噬菌體治療由傷寒、志賀菌屬和沙門菌屬引起結腸炎、腹膜炎、皮膚感染、外科手術感染、尿路感染和耳鼻咽喉感染等。然而，隨著抗生素的出現(xiàn)，嚴重阻礙了噬菌體的研究進展。在美國關于噬菌體第一期臨床試驗是在2009年公開發(fā)表的，該試驗評估了噬菌體雞尾酒針對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌感染引起的慢性靜脈腿部潰爛的治療效果[13]。這項研究并沒有顯示很積極的結果，但是也沒有發(fā)現(xiàn)噬菌體對治療產(chǎn)生不利的影響。另一項隨機試驗是在英國進行的，研究人員利用6種噬菌體的混合溶液治療耳部慢性感染銅綠假單胞菌的病人[14]，其中治療組的菌落數(shù)明顯減少，負責的臨床醫(yī)生表示病人的一些病理反應逐漸減少，如紅斑、炎癥、潰瘍、潰瘍、造粒/息肉和氣味等，噬菌體制劑并沒有引起不良反應。2005年，一個隨機臨床對照試驗即給健康實驗對象口服噬菌體，證明了口服噬菌體的給藥方法具有較高安全性，實驗對象沒有產(chǎn)生任何毒性反應[15]。

近年來，我國也已經(jīng)成立了專門用于噬菌體研究和臨床轉化的噬菌體與耐藥研究所，但是早在20世紀80年代就有應用噬菌體治療的成功案例。1958年，細菌學家余?教授應用噬菌體療法通過噬菌體懸液清洗創(chuàng)面的方式成功治愈了由燒傷而引起抗生素耐藥性綠膿桿菌繼發(fā)感染的病例[16]。2018年上海公共衛(wèi)生中心應用噬菌體療法成功治愈了多重耐藥的肺炎克雷伯菌尿路感染的病例，這是我國首例通過了醫(yī)學倫理委員會審批的噬菌體治療的案例[17]。由國內(nèi)外噬菌體研究成果可見，國內(nèi)外許多臨床病例治愈的成果案例都證實了噬菌體療法應用在人類臨床醫(yī)療領域的安全性和可行性。噬菌體作為有可能替代抗生素的新型抗菌制劑，在人類臨床醫(yī)學領域表現(xiàn)出了很大的應用前景。

4.2 噬菌體在家禽養(yǎng)殖上的應用

盡管抗生素是用于家禽疾病防治的主要藥物，但是由于耐藥菌的不斷增多，給家禽疾病的防治帶來很大的難度。抗生素存在休藥期，需要很長時間才能從動物體內(nèi)代謝出去，時間不夠，會導致抗生素殘留在肉、蛋、奶等食品中，引發(fā)食品安全問題，所以噬菌體的深入研究及其在養(yǎng)殖場的廣泛應用就顯得尤為重要。經(jīng)過百年的發(fā)展，噬菌體用于防治禽細菌感染性疾病也有了廣泛的報道，其既可用于敏感病菌也可用于對抗生素產(chǎn)生耐性的病菌[18]。目前普遍可用于防治禽致病性大腸桿菌、禽金黃色葡萄球菌、禽沙門菌病、禽彎曲桿菌病、梭狀芽孢桿菌病等細菌疾病[19]。噬菌體可以在環(huán)境中保持相對穩(wěn)定，并存活一定的時間，所以除了可以用于畜禽疾病的防治，噬菌體制劑還可以用于環(huán)境改良劑，減少環(huán)境中的細菌，降低動物患病的風險[20]。據(jù)報道，噬菌體在防治禽細菌性疾病的效果不弱于抗生素。將噬菌體制劑用于被大腸桿菌感染且對抗生素耐藥性嚴重的雞場，在使用噬菌體治療7 d后，雛雞死亡率快速降低，第21天后，徹底治愈，且沒有出現(xiàn)復發(fā)情況[21]。噬菌體用于禽大腸桿菌以及沙門菌預防以及治療，分別在3個時間點從肉雞不同器官取樣，發(fā)現(xiàn)噬菌體處理組的各器官中，致病菌含量很低，表明噬菌體對雞場中大腸桿菌病和沙門菌病的治療和預防具有良好的效果[22]。2019年Clavijo首次將噬菌體應用于大型家禽生產(chǎn)系統(tǒng)中，可將禽體內(nèi)沙門菌菌量降低200倍，在肉雞第33天，腸道內(nèi)沙門菌被徹底清除，家禽飼料轉化率提高，死亡率大幅降低[23]。Huang等人（2022年）評估了沙門氏菌噬菌體CKT1對高毒性關節(jié)炎白痢沙門氏菌的治療效果，結果表明，沙門氏菌噬菌體CKT1可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物群，提高雛雞的生長性能[24]。噬菌體療法對于控制畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的細菌感染效果良好，而且在控制機體本身的細菌感染同時又提高了動物性產(chǎn)品的質(zhì)量，降低動物源性產(chǎn)品造成人類食源性細菌感染的可能性。

4.3 噬菌體在飼料添加劑上的應用

噬菌體除了可以用于治療細菌性疾病之外還可以用作飼料添加劑。禁用飼料添加抗生素以來，動物的生長性能受到明顯影響。很多學者認為噬菌體是很好的替代品。作為飼料添加劑，噬菌體具有安全性高，提高生長性能，調(diào)節(jié)腸道菌群保持相對穩(wěn)定，提高畜禽免疫力等優(yōu)勢。Wang等人在日糧中添加0.5 g/kg的噬菌體作為飼料添加劑，發(fā)現(xiàn)可以提高肉雞飼料利用率以及免疫器官指數(shù)，還可以抑制體內(nèi)病原菌[25]。使用噬菌體添加日糧喂養(yǎng)仔豬，噬菌體可以調(diào)節(jié)肉豬腸道菌群，增加腸道內(nèi)有益菌數(shù)量，減少病原菌[26]。噬菌體添加到飲水中，肉雞生長性能顯著提高，促進腸道穩(wěn)態(tài)，改善腸道菌群[27]。唐路遙（2022）研究表明，噬菌體雞尾酒可以提高肉雞生長性能，改善腸黏膜結構，促進腸道菌群平衡，研究證明噬菌體雞尾酒是替代抗生素產(chǎn)品的有效選擇之一[28]。近年來，噬菌體制劑作為安全綠色的替抗產(chǎn)品在畜牧行業(yè)中的應用越來越廣泛。2013年在畜禽養(yǎng)殖方面，美國Intralytix公司研發(fā)的針對產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體制劑INT-401已被FDA授權用于消除活禽養(yǎng)殖中細菌感染。2013年在畜禽產(chǎn)品加工方面，由美國Intralytix公司研發(fā)的針對沙門氏菌的噬菌體制劑SalmoFresh?被FDA認定為公認安全級產(chǎn)品（Generally Regarded As Safe,GRAS），并獲批準上市。伴隨著減抗替抗、無抗時代的到來，諾安百特研發(fā)的諾安益康飼料添加劑產(chǎn)品也已推出市場。

4.4 噬菌體在食品生物控制中的應用

食品作為人類日常生活的必需品，食品衛(wèi)生安全跟人類的健康是息息相關。食品中應杜絕病原微生物的出現(xiàn)，但是目前由病原體引起的幾種食源性病原菌（如沙門菌、大腸桿菌和其他對公共衛(wèi)生有巨大影響的病原菌）引發(fā)的疾病也持續(xù)存在，因為污染細菌可以在屠宰、擠奶、發(fā)酵、加工、儲存或包裝過程中接觸到食物。在過去幾年中，由于抗生素以及消毒劑的廣泛使用導致的耐藥性問題，迫使人們開始探索一些將原料產(chǎn)品的微生物載量降至更低的策略。另一方面，食品工業(yè)中經(jīng)常使用的一些減少食源性病原菌污染的方法并不能直接應用于新鮮水果、蔬菜和即食食品。因此仍需要新的策略來滿足消費者對食品衛(wèi)生的要求。

噬菌體除了適用于防止或減少家畜中的疾病（噬菌體療法），還可以用于凈化胴體和其他原產(chǎn)品，如新鮮水果和蔬菜，以及對設備和接觸面進行消毒（噬菌體生物監(jiān)控和生物控制）和延長易腐加工食品作為天然防腐劑的保質(zhì)期（生物防腐劑）。噬菌體可以減少食品和食品加工環(huán)境中微生物污染，不僅能夠減少經(jīng)濟損失還可以大大減少人類發(fā)生食源性感染的可能性[29]。因此，開發(fā)商品化噬菌體是值得政府大力支持和推廣的。目前，美國FDA已經(jīng)允許多種噬菌體制劑在食品加工中的應用。

5 噬菌體療法的局限性以及未來發(fā)展方向

噬菌體存在很多優(yōu)勢，但也存在一些不足之處。（1）穩(wěn)定性差。由于噬菌體結構的不穩(wěn)定性，所以噬菌體制劑的保存和運輸具有嚴格的要求。（2）噬菌體在作用于細菌后，細菌發(fā)生裂解，引起內(nèi)毒素釋放，且內(nèi)毒素不易被清除。（3）口服給藥時，胃內(nèi)強酸環(huán)境影響噬菌體制劑的穩(wěn)定性，引起噬菌體效價下降，同時用藥之后，噬菌體會進入身體循環(huán)系統(tǒng)，引起機體免疫反應，產(chǎn)生中和抗體，從而抑制噬菌體發(fā)揮作用。（4）使用單一噬菌體后，會很快產(chǎn)生抗性菌株，從而失去作用。

針對噬菌體療法存在一些不足之處，提出了以下具體解決方案。（1）多種噬菌體混合使用制成噬菌體雞尾酒。其可以對多種感染細菌產(chǎn)生裂解作用，擴大裂解譜。宿主菌通過突變等方式對單一噬菌體產(chǎn)生抗性，而雞尾酒中有多種噬菌體，存在不同作用靶點，在一定程度上解決了抗性菌株存在的問題。（2）在噬菌體制劑中添加穩(wěn)定劑，或將噬菌體顆粒凍干，或將噬菌體制成軟膏，便于保存，解決噬菌體穩(wěn)定性差、難保存的問題。（3）口服給藥后胃內(nèi)胃酸會影響噬菌體穩(wěn)定性?？梢栽谑删w制劑中制成膠囊等包裹噬菌體，提高噬菌體制劑的抗酸能力。（4）噬菌體用藥后，引發(fā)機體免疫反應中和噬菌體?？梢栽黾邮删w制劑用藥頻次、用藥濃度以及噬菌體雞尾酒等方式，使噬菌體在機體內(nèi)存在時間延長，濃度增加。綜上所述，噬菌體是一種很有前景的已經(jīng)被廣泛應用于各個領域的抗菌制劑。