阮永海 許騰龍 錢森和

（1安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000；2蕪湖野樹林生物科技有限公司，安徽 蕪湖 241111）

羊肚菌（Morchella esculenta）又稱羊肚菜、羊肚蘑和編笠菌，在真菌學分類中屬于子囊菌亞門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科和羊肚菌屬[1]。羊肚菌是一種珍稀名貴的野生食用菌，具有“菌中之王”“蘑菇皇后”等美譽[2]。作為藥食兩用菌，羊肚菌富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、多糖以及多酚等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫、保護腎臟與肝臟等藥理活性[3]。其中，羊肚菌多糖是羊肚菌中一種重要的活性物質(zhì)，其對羊肚菌的品質(zhì)具有重要影響。研究表明，羊肚菌多糖具有抗菌、抗病毒和增強免疫力等功效，在保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要的應用價值[4-5]。

目前，生產(chǎn)上種植的羊肚菌菌株主要來源于野生種的人工篩選和馴化，菌種質(zhì)量有待進一步提升。通過人工育種技術(shù)可以獲得優(yōu)良菌株，常見的食用菌育種方法有雜交育種、誘變育種和基因工程育種等。其中，誘變育種是一種簡單、高效的育種方法，在食用菌育種過程中發(fā)揮了重要作用[6]。紫外誘變是一種使用較早、應用較廣的誘變技術(shù)，其產(chǎn)生的突變率高，且操作簡單安全。實踐中已通過紫外誘變技術(shù)獲得多種植物和微生物等新品種[7]。本研究采用紫外誘變處理羊肚菌菌絲體，通過探究誘變后的菌絲體生長勢與多糖含量，篩選菌絲生長速度快、多糖含量高的突變菌株，并對突變菌株的菌絲多糖形貌特征、紅外光譜、抗氧化活性以及菌絲的生長溫度進行分析，為羊肚菌品種的創(chuàng)新提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羊肚菌由安徽蕪湖野樹林生物科技有限公司提供。

1.2 試驗儀器

SW-CJ-ZFD超凈工作臺（蘇州杰諾凈化科技有限公司）；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；ZQZY-78BN震蕩培養(yǎng)箱（知楚儀器有限公司）；DHG-9000 電熱恒溫鼓風干燥箱（無錫市翼搏凡環(huán)境試驗設備有限公司）；LGJ-12 真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；80 L 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊儀器有限公司）；IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；S-4800掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.3 菌絲體制備

將羊肚菌子實體切小塊，取菌蓋與菌柄連接處，放入75%乙醇浸泡消毒3 min 后取出，在超凈臺中用無菌水清洗2～3 遍，放到PDA 固體培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d。

1.4 紫外誘變與篩選

1.4.1 菌絲體的紫外誘變在超凈工作臺中將上述制備的羊肚菌菌絲接入固體培養(yǎng)皿中，每個平板中央接入相同大小的菌絲圓片，于25 ℃培養(yǎng)48 h后在紫外燈正下方30 cm 處進行紫外照射20 s；25 ℃暗培養(yǎng)24 h后再次紫外照射40 s；再次25 ℃暗培養(yǎng)24 h 后紫外照射60 s，并置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)[8]；之后挑取生長較為旺盛的菌落尖端菌絲于斜面培養(yǎng)基中，直至長滿斜面。用生理鹽水沖洗斜面，制備菌絲懸液，稀釋一定倍數(shù)后涂布平板，并培養(yǎng)36 h。

1.4.2 突變株的平板培養(yǎng)篩選從上述平皿中挑選長勢較好的菌落菌絲接種于PDA 平板中培養(yǎng)48 h，觀察每個誘變株的菌落顏色、長勢和疏密度，測量菌落的直徑，計算菌絲生長速率，并繼續(xù)培養(yǎng)，記錄菌絲生長情況，以此進行初步篩選[9]。菌絲生長速度計算公式如下。

將初步篩選的誘變株菌絲與出發(fā)菌株菌絲體接種于同一PDA培養(yǎng)皿中，25 ℃培養(yǎng)4～5 d后，觀察相互之間的拮抗情況，進一步篩選發(fā)生突變的菌株。

1.4.3 遺傳穩(wěn)定性分析將出發(fā)菌株和篩選的誘變株菌絲接種于PDA 培養(yǎng)皿中，共培養(yǎng)6 代，測定第2 代、第3 代和第6 代菌絲的生長速度，分析各菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.5 液體培養(yǎng)篩選

在超凈臺里將上述篩選的誘變株菌絲分別接種到液體培養(yǎng)基中，放入搖床25 ℃、140 r/min 培養(yǎng)5 d 后取出，用紗布過濾出菌絲球，蒸餾水清洗2～3 次，放入培養(yǎng)皿中計算菌絲球的數(shù)量；然后放入烘箱中烘干，稱量菌絲球的干重[10]，由此分析誘變株在液體培養(yǎng)中的生物量。

1.6 多糖提取及含量測定

參照陳盛宇等[11]的方法提取菌絲多糖。將誘變菌株接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，之后以4 000 r/min離心培養(yǎng)液20 min，收集菌絲體，用去離子水清洗，放入烘箱烘干后打碎，即得到羊肚菌菌絲干粉，并采用水提醇沉法得到羊肚菌菌絲多糖。

將羊肚菌干重記為M1，凍干后多糖粉末重量記為M2，多糖含量計算公式如下。

1.7 多糖表征提取

1.7.1 掃描電鏡表征采用掃描電子顯微鏡對菌絲體多糖進行表面形貌的觀察。測試前對多糖樣品噴金以提高其導電性，電壓為5 kV。

1.7.2 紅外光譜表征挑取少量凍干的菌絲體多糖與溴化鉀固體在瑪瑙研缽中進行混合研磨，充分混勻后用壓片機壓成薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀對菌絲體多糖紅外光譜掃描，波長范圍為500～4 000 cm-1。

1.8 多糖抗氧化活性測定

1.8.1 DPPH 自由基清除率測定DPPH 自由基清除能力測定參照Xiao等[12]的方法并在其基礎上適當改進。分別配制濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mg/mL 的羊肚菌多糖樣品溶液，將100 μL 樣品溶液與100 μL 0.4 mg/mL DPPH 乙醇溶液、100 μL樣品溶液與100 μL 無水乙醇、100 μL 0.4 mg/mL的DPPH乙醇溶液與100 μL無水乙醇等量混合加入酶標板中，室溫下暗處反應30 min 后，在517 nm 下測定吸光值，分別記為A0、A1和A2；同時以相同方法測定Vc的自由基清除率作為陽性對照。DPPH自由基清除率公式如下。

1.8.2 ABTS自由基清除率測定根據(jù)景年華等[13]的方法測定ABTS自由基清除活性。分別將100 μL樣品與100 μL 提前配好的ABTS 溶液（等體積的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液）、100 μL 樣品與100 μL 無水乙醇、100 μL 提前配好的ABTS溶液與100 μL無水乙醇等量混合加入酶標板中，室溫下暗處反應6 min后，在734 nm下測定吸光值，分別記為B0、B1和B2；同時以相同方法測定Vc的自由基清除率作為陽性對照。ABTS 自由基清除率計算公式如下。

1.8.3 羥自由基清除率測定參考Zhang等[14]的方法并略作修改。將50 μL樣品與50 μL 0.250 2 mg/mL FeSO4、50 μL 0.124 3 mg/mL 水楊酸乙醇溶液以及50 μL 0.3%的過氧化氫混勻，置于37 ℃恒溫避光反應15 min，在510 nm下測定吸光值，記為C1；用蒸餾水代替過氧化氫，在510 nm下測定吸光值，記為C2；用蒸餾水代替樣品，在510 nm 下測定吸光值，記為C0；以相同方法測定Vc 的自由基清除率，并作為陽性對照。羥自由基清除率計算公式如下。

1.9 誘變株菌絲體的生長溫度篩選

在超凈工作臺中將每個平板中央接入相同大小的菌絲圓片，設置20、22、24和26 ℃4個溫度梯度進行培養(yǎng)試驗。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察菌絲萌發(fā)速度、生長速度以及菌絲的顏色變化。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件整理試驗數(shù)據(jù)，使用Origin 2018軟件作圖，SAS 8.1軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變平皿培養(yǎng)篩選

從誘變后的菌株中挑選45 株生長較好的菌落于PDA 平板培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)4 d 后，根據(jù)菌絲生長速率和拮抗分析結(jié)果，進一步篩選出6株菌株，并分別命名為YY-1、YY-2、YY-3、YY-4、YY-5 和YY-6。由出發(fā)菌株（CK）和6株誘變株菌絲生長情況（表1）可以看出，CK 菌絲較為稀疏，其滿皿時間為6 d；YY-1 菌絲生長較出發(fā)菌株濃密，菌絲滿皿時間為6 d；YY-2 和YY-6 菌絲生長稀疏，滿皿時間分別為5 d 和4 d；YY-3、YY-4 和YY-5 菌絲較為濃密，滿皿時間均為5 d，其中YY-3和YY-4菌絲顏色為淺黃色。各誘變株與出發(fā)菌株均產(chǎn)生了不同程度的拮抗，表明各誘變株與出發(fā)菌株相比發(fā)生了遺傳變異，其中YY-3 菌株與出發(fā)菌株之間的拮抗作用如圖1所示。

圖1 誘變菌株菌絲的平皿生長情況與拮抗作用

2.2 誘變株的遺傳穩(wěn)定性分析

對不同誘變株的遺傳穩(wěn)定性進行分析，其結(jié)果如表2 所示。YY-6 的第2 代菌絲體生長速率明顯降低，可能是誘變時間過長導致遺傳物質(zhì)發(fā)生較大的改變；其他誘變株菌絲在不同代數(shù)間的生長速率差異不明顯，表明其均有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表2 誘變株的遺傳穩(wěn)定性分析

2.3 誘變株在液體培養(yǎng)中的生物量分析

由圖2可知，在25 ℃、140 r/min 的培養(yǎng)條件下，YY-1、YY-3、YY-4 和YY-5 的菌絲球個數(shù)分別為46.6、49.5、47.4 和46.2 個，多于出發(fā)菌株（37.5 個）；而YY-2 和YY-6 的菌絲球個數(shù)與出發(fā)菌株差異不存在統(tǒng)計學意義。YY-2、YY-3、YY-4和YY-5的菌絲球干重分別31.3、37.5、33.8和34.6 mg，高于出發(fā)菌株（23.6 mg）；而YY-1和YY-6菌絲球干重與出發(fā)菌株差異不存在統(tǒng)計學意義。

圖2 誘變株在液體培養(yǎng)中的生物量分析

2.4 菌絲體多糖含量分析

多糖是羊肚菌中一種重要的活性成分，對羊肚菌的品質(zhì)有著重要的影響。不同誘變株菌絲體多糖含量的影響如圖3所示。YY-1、YY-2和YY-6菌株菌絲體多糖含量與出發(fā)菌株相比，差異不存在統(tǒng)計學意義；YY-3、YY-4 和YY-5 菌株菌絲體多糖含量高于出發(fā)菌株。

圖3 羊肚菌菌絲體多糖含量

2.5 菌絲多糖表征分析

通過上述分析，選取綜合性能較好的YY-3 菌株，對其多糖表征進行分析。其菌絲體多糖的掃描電鏡和紅外表征如圖4 所示。從圖4（A）可以看出，羊肚菌菌絲體多糖呈扁平狀，顆粒大小約為0.5 μm，且顆粒之間結(jié)合比較緊密。從圖4（B）菌絲體多糖的紅外光譜可以看出，羊肚菌菌絲體多糖的紅外光譜在3 380 cm-1處出現(xiàn)了一個寬的特征吸收峰，可能是分子間氫鍵O-H 伸縮振動產(chǎn)生的；在2 950 cm-1處產(chǎn)生的吸收峰，可能是由C-H伸縮振動引起的；1 660 cm-1處產(chǎn)生的吸收峰可能是由于C=C 雙鍵的伸縮振動產(chǎn)生的；在1 420 cm-1處的吸收峰是C-H 彎曲振動或伸縮振動引起；在1 120 cm-1處具有吸收峰，則表明有吡喃糖環(huán)的存在。因此，羊肚菌菌絲體多糖具有一般多糖的紅外光譜特征。

圖4 羊肚菌菌絲體多糖的掃描電鏡和紅外表征

2.6 菌絲體多糖的抗氧化活性分析

YY-3 菌株菌絲體多糖的抗氧化活性分析結(jié)果如圖5 所示。從圖5（A）可以看出，羊肚菌菌絲體多糖的DPPH 自由基清除率隨濃度增大而增大，但增大的趨勢較為平緩，當多糖濃度為2.5 mg/mL 時，其清除率為45.5%，低于Vc。由圖5（B）可以看出，當多糖濃度在0.5～2.0 mg/mL，隨著多糖濃度的增大，ABTS自由基的清除率增加較為明顯，之后其清除率增加較少；當多糖濃度為2.5 mg/mL 時，其ABTS 自由基清除率為90.64%。由圖5（C）可以看出，多糖的羥自由基清除率隨著多糖濃度的增大而明顯升高，當多糖濃度為2.5 mg/mL 時，其羥自由基清除率為79.41%。可見，羊肚菌菌絲體多糖對ABTS 自由基和羥自由基具有較好的清除能力。

圖5 羊肚菌菌絲體多糖抗氧化活性分析

2.7 菌絲體生長的溫度分析

溫度對羊肚菌菌絲的生長有著重要的影響。由表3 可以看出，隨著溫度從20 ℃上升到24 ℃，菌絲萌發(fā)和生長速度較快，菌絲顏色變化不明顯。當溫度為24 ℃時，菌絲萌發(fā)和生長速度最快；當溫度為26 ℃時，其萌發(fā)和生長速度明顯變慢，且菌絲顏色由微黃變?yōu)辄S色。

表3 不同溫度對YY-3菌株菌絲生長的影響

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的誘變方法包括化學誘變、物理誘變和生物誘變，其中物理誘變簡單易行，且高效安全。紫外誘變是物理誘變中常用的一種方法，在微生物、蔬菜和農(nóng)作物新品種的選育中發(fā)揮重要作用[15]。紫外誘變的主要原理是使DNA能夠形成嘧啶二聚體，阻止堿基之間的正常配對，使生物體產(chǎn)生突變[16]。本研究采用紫外線照射處理羊肚菌菌絲體，根據(jù)菌絲平皿生長速度及拮抗作用篩選得到了6 株正突變株；其中，YY-1、YY-2、YY-3、YY-4 和YY-5 菌株菌絲具有較好的遺傳穩(wěn)定性，而YY-6 突變株的遺傳穩(wěn)定性較差；另外，YY-3、YY-4和YY-5突變株的菌絲球個數(shù)和菌絲干重優(yōu)于出發(fā)菌株；而YY-6 突變株無論是菌絲球個數(shù)還是菌絲球干重與出發(fā)菌株的差異均不存在統(tǒng)計學意義。

多糖是羊肚菌食藥用的主要活性成分之一，具有抗氧化等生物學功能。篩選高產(chǎn)多糖的羊肚菌菌株，對提高羊肚菌的品質(zhì)具有重要作用[2]。本研究篩選得到的YY-3、YY-4 和YY-5 突變株菌絲體多糖含量高于出發(fā)菌株，而YY-1、YY-2 和YY-6 突變株菌絲體多糖含量與出發(fā)菌株差異不存在統(tǒng)計學意義。另外，羊肚菌菌絲體多糖具有一般多糖的紅外光譜特征，其對DPPH 自由基清除能力稍差，但對ABTS 自由基和羥自由基均具有較好的清除作用。

溫度是食用菌菌絲生長的重要影響因素之一，適宜的溫度能夠促進菌絲快速生長。較低的溫度導致菌絲萌發(fā)和生長受到限制；同樣，超過菌絲生長的最適溫度，菌絲顏色發(fā)生變化，生長速度會急劇下降，甚至導致菌株死亡[17]。當溫度低于或超過24 ℃時，羊肚菌菌絲體的萌發(fā)和生長均受到抑制，且在26 ℃時菌絲顏色變成了黃色。

為篩選優(yōu)良的羊肚菌菌株，采用紫外誘變處理羊肚菌菌絲體，本研究通過探究誘變后的菌絲體生長勢與多糖含量，篩選菌絲生長速度快、多糖含量高的突變菌株，并對突變菌株的菌絲多糖形貌特征、紅外光譜、抗氧化活性以及菌絲的生長溫度進行了分析。結(jié)果表明，在挑選的45 株誘變后菌株中，篩選得到6 株生長勢較好的菌株，其與出發(fā)菌株均有一定的拮抗作用。其中，YY-1、YY-2、YY-3、YY-4 和YY-5菌株菌絲具有較好的遺傳穩(wěn)定性；YY-3、YY-4和YY-5 菌株菌絲體具有較高的生物量和多糖含量。YY-3菌株菌絲體多糖呈扁平狀，具有一般多糖的紅外光譜特征，且具有較好的ABTS自由基和羥自由基清除能力。YY-3 菌株菌絲的適宜生長溫度為24 ℃。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)通過紫外誘變可以篩選得到生長勢較好、多糖含量較高的羊肚菌菌株，篩選得到的YY-3、YY-4 和YY-5 突變株菌絲具有較好的生長勢與多糖含量，這些突變株的出菇性能及其子實體中的多糖含量將有待于進一步研究。