王 洋,牛五層,張曉煜,張 麗△

(1.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院檢驗科,廣東 深圳 518116;2.邯鄲市第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,河北 邯鄲 056000)

肺部感染是臨床常見的呼吸道疾病,發(fā)病率高,是導(dǎo)致生命死亡的主要原因之一[1]。尤其在老年人和免疫功能低下的個體中,準(zhǔn)確、快速地診斷感染的原因是實現(xiàn)肺部感染治療和改善預(yù)后的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法耗時長,陽性檢出率低,不能完全滿足臨床需求[2]。其他的檢測方法,如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和免疫學(xué)等技術(shù),只能識別特定的病原體。此外,多種病原體的感染和多重耐藥菌的出現(xiàn)使病原體的鑒定更加困難。宏基因組二代測序(mNGS)是一種新興的病原體檢測方法,可以對目前已知的所有病原體的總DNA或RNA含量進(jìn)行無偏倚、詳細(xì)地檢測[3],尤其在用于檢測復(fù)雜、罕見、非典型的感染性疾病時,顯示出比傳統(tǒng)方法更好的診斷性能[4]。近年來,mNGS應(yīng)用于診斷肺部感染的研究逐漸增多,但其診斷性能尚未達(dá)成共識。本研究采用meta分析方法,合并目前經(jīng)公開發(fā)表的相關(guān)研究結(jié)果,評估m(xù)NGS在肺部感染中的應(yīng)用價值及準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1文獻(xiàn)檢索策略 計算機(jī)檢索 PubMed、Embase、the Cochrane Library、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫,檢索時限均為建庫至2022年5月30日,語種為英文或中文。選取國內(nèi)外發(fā)表的通過mNGS技術(shù)應(yīng)用于肺部感染診斷的文獻(xiàn),并對納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)進(jìn)行擴(kuò)大檢索。英文檢索詞為“metagenomic next-generation sequencing”“mNGS”“next-generation sequencing”“pneumonia”“l(fā)ung infection”等,中文檢索詞為“宏基因組二代測序”“二代測序”“肺部感染”“肺炎”等。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)采用 mNGS 技術(shù)應(yīng)用于肺部感染診斷的研究,能從文中獲取診斷實驗的四格表數(shù)據(jù),包括真陽性值(TP)、假陽性值(FP)、假陰性值(FN)、真陰性值(TN)。(2)研究對象為疑似肺部感染的患者,且有明確的診斷標(biāo)準(zhǔn),診斷標(biāo)準(zhǔn)主要包括影像學(xué)資料、臨床癥狀和實驗室檢測結(jié)果,最終判斷由臨床醫(yī)生進(jìn)行。研究組為確診肺部感染的患者,對照組為最終診斷非肺部感染的患者。(3)病例數(shù)超過10 例。(4)英文和中文文獻(xiàn)。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)動物實驗、會議摘要、病例報告、系統(tǒng)評價類文獻(xiàn)。(2)重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)或無法獲取四格表數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)。

1.3文獻(xiàn)的篩選和資料提取 由2位研究員對所有納入的文獻(xiàn)全文進(jìn)行系統(tǒng)回顧,并提取相應(yīng)的數(shù)據(jù),包括文獻(xiàn)作者、發(fā)表時間、國家或地區(qū)、研究設(shè)計類型、納入的病例數(shù)、診斷肺部感染的參考標(biāo)準(zhǔn)、四格表數(shù)據(jù)等。有異議時通過討論解決。如果未達(dá)成一致,則由第三位評價者做出最終決定。

1.4納入研究的質(zhì)量評價 由2位研究員使用RevMan5.3軟件根據(jù)QUADAS-2條目[5]逐條按“是”“否”“不清楚”對納入文獻(xiàn)的質(zhì)量進(jìn)行偏倚風(fēng)險和適用性評價。QUADAS-2表單包含4個部分:(1)病例的選擇;(2)待評價試驗;(3)參考標(biāo)準(zhǔn);(4)病例流程和進(jìn)展情況。如遇分歧則通過查閱相關(guān)資料、內(nèi)部討論或咨詢專家解決。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用Meta-Disc1.4、STATA15.0軟件進(jìn)行meta分析。納入研究通過Cochran-Q檢驗判斷是否存在異質(zhì)性,檢驗水準(zhǔn)設(shè)為0.05,結(jié)合I2判斷異質(zhì)性的大小。若P>0.05或I2≤50%,說明納入研究間異質(zhì)性較小,可以采用固定效應(yīng)模型;若P≤0.05或I2>50%,說明納入研究間異質(zhì)性較顯著,則運用隨機(jī)效應(yīng)模型,并分析異質(zhì)性來源。通過Spearman 相關(guān)系數(shù)確定納入研究之間是否存在閾值效應(yīng)。若Spearman 相關(guān)分析顯示P>0.05,說明不存在閾值效應(yīng)。通過亞組分析探索異質(zhì)性來源。計算納入文獻(xiàn)的合并敏感度、特異度、陽性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)及診斷比值比(DOR)等指標(biāo),并繪制總受試者操作特征曲線(SROC),計算曲線下面積(AUC)。發(fā)表偏倚通過Deeks 漏斗圖評估。

2 結(jié) 果

2.1文獻(xiàn)檢索結(jié)果 初步檢索到相關(guān)文獻(xiàn)1 613篇,根據(jù)文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn),其中1 571篇在瀏覽標(biāo)題和摘要后被排除在外。全文閱讀后,另外30篇被排除在外,剩下12篇文獻(xiàn)被納入研究[6-17]。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選過程

2.2納入研究的基本特征與質(zhì)量評價 本研究納入8篇[6-13]英文文獻(xiàn)和4篇[14-17]中文文獻(xiàn),均來源于國內(nèi)相關(guān)研究。納入的12篇文獻(xiàn)共包括1 154例患者,其中794例被確診為肺部感染,360例最終確診為非肺部感染性疾病。納入研究的基本特征見表1,利用QUADAS-2所作出的文獻(xiàn)質(zhì)量評價結(jié)果見圖2。

表1 納入研究的基本特征

圖2 文獻(xiàn)質(zhì)量評價偏倚風(fēng)險圖

2.3meta分析結(jié)果

2.3.1mNGS技術(shù)應(yīng)用肺部感染診斷準(zhǔn)確性 Spearman相關(guān)系數(shù)結(jié)果顯示,r=0.175,P=0.587,提示納入文獻(xiàn)不存在閾值效應(yīng)。異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示,敏感度(χ2=100.68,P<0.000 1,I2=89.1%),特異度(χ2=75.27,P<0.000 1,I2=85.4%),PLR(Cochran-Q=58.83,P<0.000 1,I2=81.3%),NLR(Cochran-Q=67.16,P<0.000 1,I2=83.6%),DOR(Cochran-Q=54.07,P<0.000 1,I2=79.7%)。見圖3～8。各研究間異質(zhì)性較大,采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行meta分析。結(jié)果顯示,合并敏感度為0.82[95%可信區(qū)間(95%CI)0.79～0.84],合并特異度為0.73(95%CI0.68～0.78),PLR為2.39(95%CI1.62～3.50),NLR為0.24(95%CI0.15～0.39),DOR為12.66(95%CI5.53～28.99),SROC的AUC為0.850,Q指數(shù)為0.782。

圖3 納入研究的敏感度森林圖

圖4 納入研究的特異度森林圖

圖5 納入研究的PLR森林圖

圖6 納入研究的NLR森林圖

圖7 納入研究的DOR森林圖

圖8 納入研究的SROC

2.3.2亞組分析 所納入的文獻(xiàn)之間具有較高的異質(zhì)性,利用亞組分析探索異質(zhì)性來源。按病例組標(biāo)本量、標(biāo)本預(yù)處理方式、測序方式等進(jìn)行亞組分析,分析結(jié)果見表2。

2.3.3發(fā)表偏倚 Deeks 漏斗圖大致對稱,P=0.63(P>0.05),見圖9。提示納入研究無明顯發(fā)表偏倚。

3 討 論

肺部感染是由臨床中常見的多種病原微生物引起的感染性疾病之一,發(fā)病率及病死率較高[18]。細(xì)菌、病毒或真菌等多種病原體與肺部感染相關(guān),對肺部感染的快速微生物學(xué)診斷有助于抗菌藥物治療的及時應(yīng)用。測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展使mNGS成為臨床診斷發(fā)展的重要領(lǐng)域。

mNGS理論上可以檢測臨床樣本中的所有病原體,現(xiàn)已應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液、呼吸系統(tǒng)及局部組織感染等的病原體檢測中[19]。mNGS具有非靶向性及相對較短的檢測周期,能夠快速檢測到病原體。作為現(xiàn)有傳統(tǒng)常規(guī)培養(yǎng)及涂片的補充方法,可改善復(fù)雜感染患者的病原體檢測和疾病管理[20]。此外,在流行病學(xué)分析方面,mNGS能夠提供病原體的遺傳和基因組信息,用于新發(fā)和罕見病原體的識別已得到廣泛認(rèn)可[21]。

關(guān)于mNGS在診斷肺部感染方面的性能和價值的綜合研究逐漸增多,但診斷性能尚未達(dá)成共識。因此,本文對mNGS技術(shù)在肺部感染診斷的應(yīng)用價值進(jìn)行meta分析。

本次最終納入12篇研究,借助Meta-Disc1.4與STATA15.0軟件,選用隨機(jī)效應(yīng)模型,評估了mNGS技術(shù)在肺部感染診斷的診斷效能。分析結(jié)果顯示,合并敏感度為0.82(95%CI0.79～0.84),特異度為0.73(95%CI0.68～0.78)。對于肺部感染的研究,敏感度應(yīng)被特別關(guān)注,mNGS通常于常規(guī)微生物實驗室診斷不明時開展。抗菌藥物的使用對mNGS診斷率的影響小于傳統(tǒng)培養(yǎng)[22],mNGS在免疫抑制或危重癥患者中診斷的敏感度更高[23]。DOR可反映檢驗項目的結(jié)果與疾病之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度,DOR>1時,其值越大說明判別效果越好[24]。本研究DOR為12.66(95%CI5.53～28.99),似然比為反映敏感度和特異度的復(fù)合指標(biāo),PLR>10.0或NLR<0.1,可認(rèn)為診斷精度高[23]。本研究PLR值為2.39(95%CI1.62～3.50),NLR值為0.24(95%CI0.15～0.39),AUC為0.850,Q指數(shù)為0.782,總體診斷價值尚可。

本研究亞組分析提示,標(biāo)本預(yù)處理方式、測序方法、病例組標(biāo)本量大小等亞組均存在較大異質(zhì)性。由于納入文獻(xiàn)的不足,尚未對研究類型、標(biāo)本來源、人群免疫狀態(tài)做進(jìn)一步分析探索其異質(zhì)性來源。臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)因研究而異,可能導(dǎo)致病例分類的變化,影響敏感度和特異度,成為異質(zhì)性的來源之一。mNGS作為一種無偏倚的檢測方法,可以檢測環(huán)境中的所有病原體,這種測試方法本身并不能區(qū)分病原微生物與定植微生物、背景微生物和受污染微生物[24]。檢測結(jié)果中的大量信息可能會干擾醫(yī)生做出臨床決策。在解釋mNGS結(jié)果時,應(yīng)根據(jù)臨床癥狀、微生物毒力、病原體reads數(shù)量、基因組覆蓋率等來區(qū)分真正的病原體與定植及污染。不同標(biāo)本類別下的結(jié)果可能存在差異,標(biāo)本的采集方法和部位的缺乏標(biāo)準(zhǔn)化也可能影響mNGS的結(jié)果。有研究指出,由于肺活檢樣本中存在惡性腫瘤、肺結(jié)節(jié)或肺陰影等并發(fā)癥,支氣管肺泡灌洗液樣本比肺活檢樣本更容易診斷感染[24];血液樣本中的病原體DNA可能反映了肺部感染,也有可能由其他器官感染所致[25];痰液樣本極易受到污染,使得背景微生物的識別和測序結(jié)果的解讀變得困難。此外,mNGS陽性閾值標(biāo)準(zhǔn)尚未確立。在納入的12項研究中,有7項[6-9,11-12,15]研究對確定mNGS陽性閾值有明確要求,盡管各個要求不完全一致。目前,還沒有權(quán)威的指南來解釋mNGS報告[26],不同解讀方式可能對檢測結(jié)果造成偏倚。因此,制訂統(tǒng)一的mNGS陽性閾值標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要。需要更多的研究來盡可能統(tǒng)一定義mNGS陽性的閾值標(biāo)準(zhǔn)。

此外,本研究尚存在以下不足:(1)納入文獻(xiàn)來源僅為中國地區(qū),缺乏地區(qū)代表性。(2)納入文獻(xiàn)語種僅包括英文、中文,可能存在語言偏倚。(3)納入文獻(xiàn)較少,且大多為回顧性研究。納入的部分研究樣本量小,評估診斷準(zhǔn)確性的能力不足。(4)在亞組分析中存在顯著異質(zhì)性。

綜上所述,mNGS在確立肺部感染病因方面表現(xiàn)出的敏感度和特異度尚可,具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。但目前mNGS技術(shù)的應(yīng)用仍有一些局限性,如測序成本高、陽性閾值的確立、病原體的報告解讀等,尚不能取代傳統(tǒng)病原體檢測方法。本研究納入文獻(xiàn)數(shù)量較少,各個研究間的異質(zhì)性高,尚需進(jìn)一步大規(guī)模高質(zhì)量的研究,更客觀準(zhǔn)確地評估m(xù)NGS在肺部感染中的診斷價值。