李 倩,寧 波,易 航,鐘 立

(1.重慶市第六人民醫(yī)院消化內(nèi)科,重慶 400064;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科,重慶 400010)

膽管癌(CCA)是膽道系統(tǒng)的惡性腫瘤,主要起源于膽管上皮細(xì)胞;胰腺癌(PCC)是起源于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤[1],二者病程中常常因侵犯膽道系統(tǒng)造成梗阻性黃疸而被診斷,但多數(shù)發(fā)現(xiàn)時已是腫瘤晚期,往往失去了最佳的手術(shù)機(jī)會,因此病死率極高。在過去 30 年,包括手術(shù)切除的全部CCA患者5年生存率僅為5%,而PCC患者5年生存率甚至低于5%[2-4]。因此,盡早診斷CCA及PCC對人類的生命健康至關(guān)重要。由于位置隱匿,影像學(xué)常常難以發(fā)現(xiàn)早期病灶,雖然目前已將包括糖抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)在內(nèi)的血清學(xué)指標(biāo)作為診斷膽胰系統(tǒng)惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物,但患良性膽道疾病(BBD),如膽管炎、胰腺炎等疾病的部分患者也合并CEA和CA19-9升高,因此其缺乏一定特異性,難以將良性及惡性疾病區(qū)分開來[5-6]。近年來,越來越多研究證明,對腫瘤及正常組織的代謝物進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)存在一定差異,這可用來鑒別診斷惡性腫瘤。臨床上常常利用經(jīng)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影(ERCP)術(shù)抽取一定量膽汁進(jìn)行分析,有助于疾病的診斷及治療。膽汁由肝細(xì)胞產(chǎn)生,分泌進(jìn)入膽道系統(tǒng)中,而膽胰系統(tǒng)位置鄰近,因此膽胰系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的代謝及吸收將導(dǎo)致膽汁酸構(gòu)成存在差異,因此可能從膽汁酸中檢測出特殊生物學(xué)標(biāo)志物用以診斷腫瘤[7]。此前有研究表明,與BBD導(dǎo)致的膽管梗阻相比,CCA及PCC等導(dǎo)致的膽管梗阻患者膽汁具有不同的膽汁酸代謝譜[7-10]。然而,大部分研究僅僅分析了常見的15種膽汁酸,且不同研究獲取膽汁樣本的方法及膽汁酸檢測分析方法均存在差異,因此不同研究結(jié)果也存在差異,不能選出有代表性的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究通過ERCP方法采集BBD、CCA和PCC患者的膽汁,并對膽汁中40種膽汁酸進(jìn)行定性及定量分析,并尋找對CCA及PCC診斷有意義的膽汁酸。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年10月至2021年10月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科收治的膽管結(jié)石患者34例,其中男8例,女26例;年齡20～87歲,平均(60.88±18.58)歲,經(jīng)超聲、腹部 CT和(或)磁共振檢查診斷,并排除其他消化道疾病。另選取同期收治的CCA患者20例、PCC患者8例。CCA組中男16例,女4例;年齡52～87歲,平均(70.00±9.46)歲,經(jīng)組織病理學(xué)診斷,并排除其他消化道腫瘤。PCC組中男6例,女2例;年齡62～86歲,平均(70.75±9.63)歲,經(jīng)組織病理學(xué)檢查診斷,并排除其他消化道腫瘤。納入研究的患者均未合并其他肝臟疾病,且近期未使用影響膽汁酸代謝的藥物。

1.2膽汁獲取與分析方法 納入研究的患者行ERCP術(shù),成功插入膽總管后,在注射造影劑前從膽管中抽取3～5 mL膽汁,并凍存放置于-80 ℃冰箱中。利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS,美國AB Sciex公司,AB ExionLC,AB Sciex Qtrap 6500+)對膽汁中的膽汁酸進(jìn)行定性及定量分析,首先對樣本進(jìn)行預(yù)處理,將-80 ℃下保存的樣本取出,在室溫下解凍,移取100 μL樣本,加入400 μL蛋白沉淀劑[V(甲醇)∶V(乙腈)=2∶1,含同位素內(nèi)標(biāo)CA-d4],渦旋振蕩1 min,接著在冰水浴中超聲提取10 min,在-20 ℃下靜置30 min,離心10 min(13 000 r/min,4 ℃),取400 μL上清液揮干。再用200 μL甲醇水[V(甲醇)∶V(水)=1∶1,含內(nèi)標(biāo) Lyso PC17和GCA-C13]溶液復(fù)溶,渦旋30 s,超聲2 min,最后將樣本液離心10 min(13 000 r/min,4 ℃),用注射器吸取200 μL的上清液,使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過濾器過濾后,稀釋100倍,轉(zhuǎn)移到棕色進(jìn)樣瓶,-80 ℃下保存,直到上機(jī)分析。使用Phenomenex Kinetex C18色譜柱(2.1 mm×100.0 mm,2.6 μm)對樣本梯度洗脫,然后利用AB Sciex Qtrap 6500+質(zhì)譜儀對樣本進(jìn)行定量分析,獲得質(zhì)譜分析數(shù)據(jù),對所有的色譜峰進(jìn)行峰面積積分,并對其中同一物質(zhì)在不同樣本中的色譜峰進(jìn)行積分校正。膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品包括膽酸(CA)、鵝去氧膽酸(CDCA)、去氧膽酸(DCA)、牛磺膽酸(TCA)、牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA)、?；敲撗跄懰?TDCA)、甘氨膽酸(GCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)、甘氨石膽酸(GLCA)、?；切苋パ跄懰?TUDCA)、?；鞘懰?TLCA)、牛磺豬膽酸(THCA)、23-脫甲膽酸(23-NorCA)、甘氨豬膽酸(GHCA)共16種膽汁酸。

2 結(jié) 果

2.13組血清指標(biāo)比較 與BBD組相比,CCA組血清中膽汁酸、總膽紅素(T-BILI)、堿性磷酸酶(ALP)和直接膽紅素(D-BILI)的水平顯著更高,而PCC組ALP、T-BILI、D-BILI和CEA水平顯著高于BBD組,PCC組球蛋白(Glb)和CEA水平高于CCA組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組患者血清指標(biāo)水平比較

2.23組膽汁酸譜比較 利用LC-MS/MS方法定量檢測了3組患者膽汁中的40種膽汁酸,其中包括了16種可檢測及24種無法檢測出的膽汁酸亞型。

2.2.13組總膽汁酸、初級及次級膽汁酸、?；羌案拾苯Y(jié)合膽汁酸、總結(jié)合及非結(jié)合膽汁酸比較 與BBD組比較,CCA組甘氨結(jié)合膽汁酸、總結(jié)合及非結(jié)合膽汁酸、次級膽汁酸和總膽汁酸水平明顯更低,PCC組初級膽汁酸水平較BBD組更高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外,與CCA組相比,PCC組初級膽汁酸、總結(jié)合及非結(jié)合膽汁酸、總膽汁酸水平更高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 3組總膽汁酸、初級及次級膽汁酸、總結(jié)合及非結(jié)合膽汁酸、?；羌案拾苯Y(jié)合膽汁酸比較

2.2.23組16種膽汁酸亞型比較 CCA組CDCA、23-NorCA、GLCA、GDCA、GCDCA和TDCA水平顯著低于BBD組,而PCC組TCA水平明顯高于BBD組,PCC組CDCA、CA、GHCA、TCA、GCDCA、GCA和THCA水平明顯高于CCA組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 3組可檢測的16種膽汁酸水平比較

3 討 論

近年來不少研究發(fā)現(xiàn),組織器官長期暴露于高水平膽汁酸環(huán)境中發(fā)生腫瘤的風(fēng)險更高,如肝惡性腫瘤、結(jié)直腸惡性腫瘤、CCA和PCC等的發(fā)生發(fā)展都與膽汁酸密切相關(guān)[11]。細(xì)胞與膽汁酸相互作用,腫瘤細(xì)胞的代謝導(dǎo)致了膽汁酸成分及含量的改變,膽汁酸促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-14]。本研究對BBD、CCA和PCC患者膽總管中的膽汁酸成分進(jìn)行了定性及定量分析,進(jìn)一步對比分析,以尋找對腫瘤診斷有臨床意義的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與BBD組及PCC組相比,CCA組總膽汁酸水平明顯更低,分析可能與膽汁酸導(dǎo)致膽管細(xì)胞炎性損傷,進(jìn)而引起膽汁酸分泌減少有關(guān),此前已有研究證實這一點[10]。在人體中,法尼醇X受體(FXR)為膽汁酸的核受體,可被其激活,并作用于膽汁酸和脂質(zhì)代謝過程,CCA發(fā)生時導(dǎo)致膽道梗阻,膽汁淤積使得FXR被膽汁酸激活,通過一系列信號通路作用于肝細(xì)胞,減少膽汁酸的合成,進(jìn)而減輕膽汁淤積及膽管細(xì)胞的毒性損傷[15]。然而JUSAKUL等[9]研究表明,CCA組患者較BBD組有更高水平的總膽汁酸,這與本研究結(jié)果相反,推測原因是不同的膽汁酸獲取方式導(dǎo)致結(jié)果存在差異,與膽囊穿刺獲取膽汁不同,本研究利用ERCP插管抽取膽汁進(jìn)行分析,而膽囊對膽汁酸有濃縮儲存作用,因此會導(dǎo)致不同研究的分析結(jié)果有差異。此外,本研究結(jié)果表明,CCA組較BBD組的次級膽汁酸水平更低,初級膽汁酸通過膽道系統(tǒng)分泌進(jìn)入腸道,通過腸道菌群的酶解作用產(chǎn)生次級膽汁酸,而CCA導(dǎo)致膽道梗阻,初級膽汁酸進(jìn)入腸道受阻,因此次級膽汁酸生成障礙,進(jìn)而水平降低,并且有研究發(fā)現(xiàn),部分次級膽汁酸可減輕膽管細(xì)胞的炎性損傷,如UDCA可增加膽管細(xì)胞鈣離子表達(dá),激活鈣離子依賴的蛋白激酶C-α(PKC-α)信號通路,進(jìn)而抑制膽管細(xì)胞的增殖和分泌,因此次級膽汁酸水平降低將對膽管細(xì)胞的保護(hù)作用也降低[16]。本研究發(fā)現(xiàn),CCA組患者較BBD組膽管中的甘氨結(jié)合膽汁酸、總結(jié)合及非結(jié)合膽汁酸水平更低,這與既往的研究結(jié)果不一致[7-9]。通過體外實驗,發(fā)現(xiàn)結(jié)合膽汁酸可通過激活一系列細(xì)胞信號通路,上調(diào)人CCA細(xì)胞中環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達(dá),增加了前列腺素E2(PGE2)的合成,進(jìn)而加劇膽管細(xì)胞的炎性損傷,并對CCA的發(fā)生發(fā)展起重要作用[17-18]。另有研究表明,結(jié)合膽汁酸可作用于核因子-κB(NF-κB),通過激活相關(guān)信號通路阻斷膽管細(xì)胞凋亡,這增加了腫瘤的發(fā)生風(fēng)險[10]。DAI等[19]在體外試驗中利用結(jié)合膽汁酸作用于膽管細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞中FXR的mRNA和蛋白表達(dá)水平較未處理的膽管細(xì)胞更低,FXR對減少膽汁酸分泌的反向調(diào)節(jié)作用減弱,加劇膽汁淤積,增加了膽管細(xì)胞的炎性損傷,促進(jìn)CCA的發(fā)生發(fā)展。這些研究說明CCA組應(yīng)含有更高水平的結(jié)合膽汁酸,這與本研究的結(jié)論不相符,分析這可能與不同研究納入不同地區(qū)人群有關(guān)。此外,本研究通過定性及定量分析各組之間的膽汁酸亞型,發(fā)現(xiàn)CCA組患者的CDCA和TDCA水平較BBD組明顯更低。CDCA可通過激活FXR對NF-κB信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生抑制作用,進(jìn)而減輕膽汁酸對膽管細(xì)胞的炎性損傷[15]。另有研究發(fā)現(xiàn),TDCA可通過鈣PKC-α和絲裂原激活的PKC依賴信號通路抑制人CCA細(xì)胞的生長,不利于CCA的發(fā)生[20],這能解釋CCA組的CDCA和TDCA水平顯著更低。體外細(xì)胞研究表明,GDCA和GCDCA作用于膽管細(xì)胞,激活NF-κB信號通路、降低FXR的mRNA和蛋白表達(dá),加重膽汁淤積,進(jìn)而促進(jìn)CCA細(xì)胞生長[19-21]。本研究數(shù)據(jù)卻表明,CCA組患者膽管中GCDCA、GLCA和GDCA的水平較BBD組顯著降低。此外,本研究還表明,與BBD組相比,CCA組23-NorCA水平更低,但導(dǎo)致這種差異的機(jī)制尚不清楚,推測這可能與23-NorCA具有更低的疏水性相關(guān)。

本研究通過對PCC組膽汁中膽汁酸進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)PCC組較BBD組有更高水平的初級膽汁酸和TCA。CA、CDCA均屬于初級膽汁酸,與次級膽汁酸相比,初級膽汁酸的疏水性更高,膽汁淤積時細(xì)胞長時間暴露于高水平膽汁酸中,導(dǎo)致細(xì)胞炎性損傷,反復(fù)地炎性刺激將導(dǎo)致細(xì)胞癌變,增加腫瘤發(fā)生的可能。有研究表明,TCA可激活PKC-α細(xì)胞通路誘導(dǎo)頂端鈉離子依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運體表達(dá),增加細(xì)胞對膽汁酸攝取,進(jìn)一步加重膽汁淤積,導(dǎo)致膽汁反流進(jìn)入胰管中,對胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性損傷,增加了細(xì)胞癌變風(fēng)險[22]。而CCA組與PCC組之間的膽汁酸差異可能與細(xì)胞組織學(xué)差異有關(guān),這需要更多研究探討其中的原因。

總之,本研究對CCA、PCC和BBD患者膽管中總膽汁酸、初級及次級膽汁酸、結(jié)合及非結(jié)合膽汁酸、甘氨及牛磺結(jié)合膽汁酸和可檢測出的16種膽汁酸亞型進(jìn)行了定性及定量分析,并對比各組之間膽汁酸成分及水平差異。膽管梗阻導(dǎo)致膽汁淤積,影響膽汁酸的分泌及排泄,高水平膽汁酸長期作用于膽管細(xì)胞和胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞,正常細(xì)胞在反復(fù)炎性刺激下發(fā)生惡變的風(fēng)險極高。本研究發(fā)現(xiàn),CCA組總膽汁酸、次級膽汁酸、CDCA、TDCA和23-NorCA水平顯著低于BBD組,而PCC組初級膽汁酸和TCA水平較BBD組更高。因此,本研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組與BBD組膽汁酸的組成及水平存在明顯差異,其中23-NorCA、TDCA、CDCA、次級膽汁酸、總膽汁酸可作為輔助診斷CCA的潛在生物學(xué)標(biāo)志物,初級膽汁酸、TCA對PCC的輔助診斷有一定參考價值。但與既往研究結(jié)果存在一定差異,且本研究為單中心研究,納入的樣本量較小,因此有待進(jìn)一步的研究分析探討膽汁酸在CCA及PCC中的相關(guān)作用機(jī)制。