朱青永,張鑫,鄧紫菱,扎西多杰,余佳莉,陳啟和,劉政捷*

1(浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 舟山,316000)

2(浙江大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)系,浙江 杭州,310058)

蛋氨酸,又稱甲硫氨酸,有D型和L型2種存在形式,均具有生物活性[1]。蛋氨酸被MUELLER首次從酪蛋白中分離出來,被認(rèn)為是α-氨基-N-丁酸的γ-甲硫基衍生物,是人和動物體中唯一的含硫必需氨基酸,在機體中具有非常重要的生理功能[2]。目前,蛋氨酸已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)生產(chǎn)中,如飼料、預(yù)防肝損傷藥物、運動補充劑和嬰幼兒制劑等眾多食品藥品中[3]?，F(xiàn)行的蛋氨酸合成方法主要為化學(xué)合成法,但是化學(xué)合成法的產(chǎn)物為D型和L型外消旋混合物,分離十分困難,不能滿足一些高精尖行業(yè)的需求,而且對環(huán)境污染嚴(yán)重[4-5]。所以迫使人們使用微生物發(fā)酵法替代化學(xué)合成法[6],但由于蛋氨酸生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機制較為復(fù)雜,給蛋氨酸產(chǎn)生菌的選育帶來了很大困難。蛋氨酸生物合成常用菌有大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌,HUANG等[7]通過優(yōu)化絲氨酸合成途徑和使用優(yōu)化過的大腸桿菌W3110,經(jīng)過補料分批發(fā)酵,在48 h內(nèi)蛋氨酸產(chǎn)量可達到16.86 g/L,使用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)蛋氨酸產(chǎn)量最高約為9.88 g/L[8],該產(chǎn)量對于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用還有一定差距,因此對于蛋氨酸高產(chǎn)菌株的選育仍然有待深入研究。

內(nèi)生菌一般包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌,研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌廣泛存在,自VOGL從黑麥草種子內(nèi)分離出第一株內(nèi)生真菌以來,植物內(nèi)生菌就作為一種新的微生物資源受到了廣泛關(guān)注[9]。因為內(nèi)生菌和宿主之間可能存在水平基因轉(zhuǎn)移的作用,使得內(nèi)生菌具有合成其宿主產(chǎn)生的活性化學(xué)成分類似物的潛力,是重要次生代謝物的儲存庫[10]。據(jù)報道,鹽膚木為眾多亞熱帶常見森林植物種子中蛋氨酸含量較高的一種植物,酸水解法處理測得的蛋氨酸含量高達36.89 mg/g,是開發(fā)新型高產(chǎn)蛋氨酸蛋白基因資源的優(yōu)良選擇[11]。因此,本研究嘗試從鹽膚木種子中挖掘具有產(chǎn)蛋氨酸能力的內(nèi)生菌,將其應(yīng)用于蛋氨酸的生物合成領(lǐng)域。

首先從蛋氨酸含量較高的鹽膚木種子中分離出內(nèi)生菌,再利用不同的培養(yǎng)基篩選出高產(chǎn)蛋氨酸的菌株。然后以篩選出的菌株為出發(fā)菌株,對出發(fā)菌株進行蛋氨酸結(jié)構(gòu)類似物和60Co-γ射線誘變育種,再采用傳統(tǒng)方式優(yōu)化培養(yǎng)基,為實現(xiàn)蛋氨酸的工業(yè)生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù),有益于下一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽膚木當(dāng)年新鮮種子,購于淘寶;蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、法尼醇、亮氨酸,上海源葉生物科技有限公司;LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇、二甲基亞砜、結(jié)晶紫,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇、乙腈、三乙胺,武漢弗頓控股有限公司;Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒,生工生物工程股份有限公司;DL2000 Plus DNA Marker,南京諾唯贊生物科技股份有限公司。所有分離用有機溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-100B臺式恒溫振蕩器,上海天呈實驗儀器制造有限公司;Agilent1100高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;SJB-CJ-1FX生物超凈工作臺,蘇州佳寶凈化設(shè)備有限公司;Thermo酶標(biāo)儀,美國賽摩飛世爾科技公司;智能生化培養(yǎng)箱SPX-1000,寧波賽福實驗儀器有限公司;Olympus光學(xué)顯微鏡,奧林巴斯有限公司;

1.3 實驗方法

1.3.1 鹽膚木種子中高產(chǎn)蛋氨酸內(nèi)生菌的篩選

取新鮮的鹽膚木種子,在75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中浸泡l min,無菌水漂洗3次后用5%(體積分?jǐn)?shù))NaClO消毒2 min,再用無菌水沖洗3～4次,無菌濾紙吸干[12]。在無菌工作臺中用研缽研磨種子,將研磨獲得的液體,按照1、10、100、1 000倍稀釋,取100 μL,分別在LB、YPD、PDA固態(tài)培養(yǎng)基上涂板。LB平板置于37 ℃培養(yǎng),YPD和PDA平板置于28 ℃培養(yǎng)。將從培養(yǎng)基上獲取獲得的內(nèi)生菌菌株,挑取單克隆,分別接種于5 mL的LB、YPD和PDB液體培養(yǎng)基,120 r/min,培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后,取種子液1 mL,分別接種于對應(yīng)的100 mL液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)72 h,之后通過蛋氨酸含量測定,篩選出高產(chǎn)蛋氨酸的菌株。

1.3.2 鹽膚木種子中高產(chǎn)蛋氨酸內(nèi)生菌菌種鑒定

將篩選出的高產(chǎn)蛋氨酸菌株進行細(xì)胞學(xué)鑒定。從種子內(nèi)部取內(nèi)生菌,在培養(yǎng)72 h左右時進行革蘭氏染色,確定該菌株為革蘭氏陽性菌?；驕y序:使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進行DNA提取。用于16S rRNA的PCR反應(yīng)的引物為一對通引物,一般細(xì)菌鑒定選擇通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系為:5×SF Buffer 4 μL,dNTPs(0.02 mol/L)1 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL,DNA模板2 μL,Phanta酶(1 U/50 μL)0.4 μL,ddH2O 11.8 μL。PCR擴增程序如下:94 ℃ 5 min→(94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min)×30個循環(huán)→72 ℃ 10 min→4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物的純化和測序由上海生工生物技術(shù)公司完成,將菌株LB-2序列在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg)上進行BLAST比對分析,在GenBank中下載相近典型菌株的16S rRNA基因序列,利用MEGA X軟件,采用鄰接法(neighbor-joining)進行1 000次自展分析(bootstrap analysis),構(gòu)建基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。

1.3.3 生物量的測定

量取40 mL的發(fā)酵液,離心,向沉淀中加入少量的蒸餾水使得菌體懸浮,倒入已記錄過質(zhì)量的玻璃培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放在烘箱中烘干,直到前后2次稱量質(zhì)量不再發(fā)生變化,記錄質(zhì)量。比較前后2次的質(zhì)量差,即為40 mL發(fā)酵液中生物體的質(zhì)量。

1.3.4 蛋氨酸含量的檢測

用高效液相色譜法測定蛋氨酸含量。Agilent 1200色譜儀,色譜柱C18,流動相A相(1 L):無水乙酸鈉5 g,四氫呋喃5 mL,三乙胺200 μL,pH為7.2。流動相B相(1 L):無水乙酸鈉5 g,超純水200 mL,甲醇400 mL,乙腈400 mL,pH為7.2。紫外檢測器檢測波長338 nm,柱溫40 ℃,流速1.0 mL/min。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,使用前稀釋成濃度為1、10、20、50、100、200、500、1 000 μg/mL等8個梯度,0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣測定。得到回歸方程y=1.594 1x+0.289 9,R2=0.999 6。將發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾,加入液相小瓶,樣品準(zhǔn)備完畢。樣品采用自動衍生化程序,衍生試劑包括:1 μL樣品+5 μL硼酸+1 μL OPA+32 μL水。梯度洗脫程序見表1,洗脫時間為38 min。

表1 梯度洗脫程序

1.3.5 亮氨酸抑制濃度確定

據(jù)報道,閔偉紅等[14]和林小秋等[15]以亮氨酸作為蛋氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,進行蛋氨酸抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選,使蛋氨酸產(chǎn)量得到明顯提高。本研究以高產(chǎn)蛋氨酸菌株LB-2為出發(fā)菌株,用亮氨酸篩選抗蛋氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株。配制亮氨酸質(zhì)量濃度分別為0、2、4、6、8 g/L的LB培養(yǎng)基平板,從LB培養(yǎng)基斜面上挑取菌落到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)期。稀釋104倍,取200 μL涂板,37 ℃培養(yǎng)48 h。比較LB-2菌株在不同濃度下的亮氨酸的生長狀況,由此確定篩選培養(yǎng)基中應(yīng)該添加的亮氨酸的質(zhì)量濃度。

1.3.660Co-γ射線誘變及誘變菌株的篩選

取5 mL對數(shù)期的LB-2菌液離心,棄上清液,生理鹽水洗滌3次,最后懸浮于生理鹽水中,使得OD600為0.5左右。采用200雷姆劑量的60Co-γ射線對其進行照射誘變,將經(jīng)過輻照后的菌液分別用生理鹽水稀釋105、106、107倍,并涂布在含有一定質(zhì)量濃度亮氨酸的篩選培養(yǎng)基平板中,挑選菌落直徑比較大的單克隆菌體,采用點菌的方式分別點植在LB固體培養(yǎng)基和含有亮氨酸的篩選培養(yǎng)基上進行發(fā)酵,37 ℃、220 r/min,培養(yǎng)48 h。選擇對亮氨酸抑制作用不敏感的突變菌株,測定發(fā)酵液中蛋氨酸的含量,挑選出蛋氨酸產(chǎn)量最高的菌株。

1.3.7 單因素試驗

固定單因素試驗條件為葡萄糖15 g/L、硫酸鈉1.5 g/L、法尼醇75 μmol/L,研究向培養(yǎng)基中加入不同含量的葡萄糖(5、10、15、20、25 g/L)、硫酸鈉(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)和法尼醇(25、50、75、100、125 μmol/L)對LB-2-13菌株蛋氨酸產(chǎn)量的影響。

1.3.8 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

通過單因素試驗確定選取葡萄糖、硫酸鈉、法尼醇3個因素進行編碼,得出各因素的交互作用,并求出各因素的最佳水平,實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素及水平

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗和相關(guān)性分析,Origin 2021軟件作圖,利用軟件Design-Expert 10進行試驗設(shè)計和分析,每個試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽膚木種子中高產(chǎn)蛋氨酸內(nèi)生菌的篩選和鑒定

植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物非常豐富,是許多生物活性代謝物的重要來源,這些代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出了抗菌、抗糖尿病、殺蟲和抗關(guān)節(jié)炎等活性[16]。在以往研究中,蛋氨酸生產(chǎn)常用菌株有大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌和百合棒桿菌等[17]。本研究從先前的研究報道中得到啟發(fā)[18],首次使用鹽膚木內(nèi)生菌作為蛋氨酸的生產(chǎn)菌株。從圖1可以看出鹽膚木種子中培養(yǎng)篩選出的11種菌株在LB、PDA、YPD 3種平板中單克隆呈現(xiàn)出不同顏色和形態(tài),LB平板上呈現(xiàn)黃綠色,PDA平板上呈現(xiàn)白色或者褐色,YPD平板上呈現(xiàn)淺褐色或棕褐色。對篩選出的11種菌株進行命名,根據(jù)所使用培養(yǎng)基的不同,分別命名為LB-1、LB-2、LB-3、LB-4、LB-5、YPD-1、YPD-2、YPD-3、PDA-1、PDA-2、PDA-3。從圖2可以看出這11株內(nèi)生菌均可產(chǎn)生蛋氨酸,LB平板上的菌株生產(chǎn)蛋氨酸的能力更高,LB-2產(chǎn)蛋氨酸的能力最強,可達0.92 g/L。

圖1 分離的菌株在不同平板上的形態(tài)特征

圖2 鹽膚木種子內(nèi)生菌株發(fā)酵液蛋氨酸含量

用瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增產(chǎn)物。如圖3-a所示,菌株ITS序列擴增產(chǎn)物在約1 600 bp的位置有明顯的條帶,且無其他雜質(zhì)存在。

a-PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果;b-基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

將所得16S rRNA 基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對,與菌株LB-2相似度最高的菌株為Micrococcusluteusstrain NCTC 2665(NR 075062.2,相似度為99%)、Micrococcusaloeveraestrain AE-6(NR 134088.1,相似度為99%)。圖3-b為LB-2菌株的系統(tǒng)進化樹,由圖可知,LB-2與Micrococcusyunnanensis(MT033093.1)的同源性最高,達到了100%。結(jié)合形態(tài)特征和16S rRNA 基因序列同源性,確定LB-2菌株為微球菌屬。

2.2 亮氨酸抑制濃度的確定

篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變株是使相關(guān)酶的調(diào)節(jié)基因或變構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變,使結(jié)構(gòu)類似物不能再與阻遏物或變構(gòu)酶結(jié)合,即結(jié)構(gòu)類似物不再抑制突變株的生長,從而解除反饋調(diào)節(jié)[19]。從圖4可以看出,菌株在加入了6 g/L亮氨酸的平板中的菌落大小為空白對照平板中的一半,且數(shù)量上也要少很多,說明含有6 g/L亮氨酸的LB培養(yǎng)基對菌體的生長有一定的抑制作用,可以選用為篩選培養(yǎng)基。

圖4 不同質(zhì)量濃度的亮氨酸對菌落生長的影響

2.3 60Co-γ射線誘變菌株的篩選

60Co-γ射線是一種高能電磁波,它產(chǎn)生的電離輻射可以直接或間接改變DNA的結(jié)構(gòu)[20]。有研究表明,通過對阿庫曲霉G1-3進行60Co-γ射線照射,葡萄糖苷酶的產(chǎn)量從1.94 U/mL增加到7.02 U/mL[21]。據(jù)報道,黑曲霉DSM 26641中的β-1,4-endoxylanase酶活性因60Co-γ輻射而大大提升[22]。實驗標(biāo)號0和33為原始菌株,如圖5所示,13和25號菌株無論是蛋氨酸產(chǎn)量還是生物量都明顯高于其他菌株,尤其是13號菌株,蛋氨酸產(chǎn)量達到了1.52 g/L。經(jīng)過60Co-γ射線誘變和6 g/L亮氨酸篩選之后,一些突變菌株產(chǎn)蛋氨酸的能力得到明顯提升。

a-誘變菌株不同菌株的蛋氨酸產(chǎn)量;b-誘變菌株不同菌株的生物量

2.4 單因素試驗結(jié)果

2.4.1 葡萄糖添加量對LB-2-13蛋氨酸產(chǎn)量的影響

葡萄糖在蛋氨酸生物合成過程中具有非常重要的作用,不僅為微生物的生長提供能量,還作為原料直接參與蛋氨酸的合成。葡萄糖通過糖酵解等途徑轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,進入TCA循環(huán),生成草酰乙酸鹽,通過天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶將代謝通量導(dǎo)向天冬氨酸。利用一系列酶,連續(xù)還原天冬氨酸末端羧基合成高絲氨酸,最終得到蛋氨酸[23]。如圖6-a所示,當(dāng)葡萄糖添加量超過10 g/L時,發(fā)酵液中的生物量開始明顯降低,可能是因為隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的提升,發(fā)酵液中的滲透壓也隨之提升,滲透壓過高會導(dǎo)致微生物失水而發(fā)生質(zhì)壁分離,從而導(dǎo)致生物量降低。隨著葡萄糖添加量的增加,發(fā)酵液中蛋氨酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)添加量為15 g/L時蛋氨酸含量達到最高。最終確定最適葡萄糖添加量為15 g/L。

a-葡萄糖添加量對蛋氨酸參量的影響;b-硫酸鈉添加量對蛋氨酸參量的影響;c-法尼醇添加量對蛋氨酸參量的影響

2.4.2 硫酸鈉添加量對LB-2-13蛋氨酸產(chǎn)量的影響

2.4.3 法尼醇添加量對LB-2-13蛋氨酸產(chǎn)量的影響

法尼醇是由真菌物種白色念珠菌分泌的一種群體感應(yīng)分子,主要在白色念珠菌生物膜生長期間起到生理作用,它還可以對其他細(xì)菌的生理活動起到一定的調(diào)控作用,例如調(diào)節(jié)細(xì)胞生理特征、形態(tài)、抗菌性等[27]。LOPES等[28]研究發(fā)現(xiàn)法尼醇同樣能夠影響耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等細(xì)菌生物膜的形成,與生物膜中重要蛋白質(zhì)具有顯著的結(jié)合親和力。本研究利用法尼醇對細(xì)菌生物膜的影響,找到促進微球菌中蛋氨酸高產(chǎn)的一種創(chuàng)新方式。從圖6-c可以看出,加入100 μmol/L法尼醇時蛋氨酸含量最高,因此確定最適法尼醇添加量為100 μmol/L。適量的法尼醇顯著提高了微球菌中蛋氨酸的產(chǎn)量,具體原因可以從以下幾個方面考慮:首先,有研究顯示,適量的法尼醇可以增加金黃色葡萄球菌中的溶氧量[29],微球菌是需氧菌,法尼醇通過增加微球菌中的溶氧量,產(chǎn)生足夠的能量用于蛋氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶的合成以及蛋氨酸的運輸。其次,法尼醇可以通過影響微球菌生物膜的形成,改變生物膜的蛋白成分,從而影響蛋氨酸的轉(zhuǎn)運過程。另外,最直接的影響就是法尼醇對微球菌中蛋氨酸合成途徑的調(diào)控,法尼醇在培養(yǎng)基中隨著發(fā)酵過程的進行被微球菌慢慢積累,從而改變合成途徑中關(guān)鍵酶的基因表達,以實現(xiàn)蛋氨酸的高產(chǎn)。

2.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果

為了進一步提高LB-2-13菌株的蛋氨酸產(chǎn)量,利用Box-Behnken設(shè)計法對篩選出的3個因素進行優(yōu)化,試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

各因素經(jīng)過回歸擬合,得到回歸方程:Y=2.80-0.066A+0.013B-0.13C-7.50AB+5.00AC+0.25BC-0.55A2-0.37B2-0.48C2。從表4可以看出,響應(yīng)值模型P值小于0.05,該二次項方程模型顯著;同時該模型失擬項P值大于0.05,說明模型失擬項不顯著,可以較好地擬合實驗數(shù)據(jù)。響應(yīng)值可信度分析的模型相關(guān)系數(shù)R2為0.96,表示該模型相關(guān)度很好;變異系數(shù)為6.66%,表示該模型置信度較高,可以反映試驗的真實性。綜上所述,該回歸模型對響應(yīng)值的擬合程度較高,方程能夠較好地反映響應(yīng)值與自變量的關(guān)系。

表4 回歸方程的方差分析

為了更直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響,對回歸模型進行響應(yīng)面圖分析。當(dāng)多種因素交互作用時,三維曲面圖可直觀反映響應(yīng)值的變化趨勢。從圖7可知,隨著葡萄糖、硫酸鈉和法尼醇添加量的增加,蛋氨酸含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,通過比較3因素的P值可知,各因素對蛋氨酸產(chǎn)量的影響大小為:C>A>B,即法尼醇添加量>葡萄糖添加量>硫酸鈉添加量。通過試驗優(yōu)化得到的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖14.70 g/L,硫酸鈉0.98 g/L,法尼醇96.35 μmol/L,預(yù)測得到的最高蛋氨酸含量為2.81 g/L。在此條件下進行最佳工藝驗證試驗,測定發(fā)酵液中蛋氨酸含量,平行測定3次試驗結(jié)果為2.85 g/L,與預(yù)測值接近,證明此模型可以用于LB-2-13菌株生產(chǎn)蛋氨酸培養(yǎng)基條件的優(yōu)化。

a-葡萄糖-硫酸鈉交互作用;b-葡萄糖-法尼醇交互作用;c-硫酸鈉-法尼醇交互作用

3 結(jié)論

本文從鹽膚木種子中分離內(nèi)生菌進行蛋氨酸發(fā)酵培養(yǎng),篩選出高產(chǎn)菌株LB-2。之后選擇LB-2菌株為出發(fā)菌株,采用60Co-γ射線、蛋氨酸結(jié)構(gòu)類似物進行誘變篩選,最終得到高產(chǎn)菌株LB-2-13。實驗結(jié)果表明,同等發(fā)酵條件下,突變菌株比野生菌株的蛋氨酸產(chǎn)量增加了162.72%。培養(yǎng)基的優(yōu)化,是微生物發(fā)酵中最常見的優(yōu)化方式,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,使用響應(yīng)面優(yōu)化LB-2-13菌蛋氨酸合成的培養(yǎng)條件,得出在葡萄糖14.70 g/L,硫酸鈉0.98 g/L,法尼醇96.35 μmol/L的條件下,蛋氨酸的產(chǎn)值最高,產(chǎn)值可以達到2.85 g/L,比未優(yōu)化前增長了約88%。為早日實現(xiàn)蛋氨酸生物合成工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

但在不同的微生物中,蛋氨酸的合成途徑存在一定差異,如高絲氨酸在大腸桿菌中被高絲氨酸-O-琥珀酰基轉(zhuǎn)移酶(homoserine succinyltransderase,metA)和高絲氨酸激酶(homoserine kinase,HK)催化形成O-琥珀酰-L-高絲氨酸和O-磷酸-L-高絲氨酸,而在谷氨酸棒桿菌中則被高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(homoserine acetyltransferase,HAT)催化形成O-乙酰-L-高絲氨酸[30]。蛋氨酸在微球菌中也應(yīng)有獨特的合成途徑,但目前對其合成途徑?jīng)]有深入了解,并且蛋氨酸生物合成過程中還受到硫同化內(nèi)部途徑關(guān)鍵酶、轉(zhuǎn)運體、反饋抑制、阻遏蛋白、NADPH和ATP等多種物質(zhì)及機制的調(diào)控。此外,在發(fā)酵過程中,還受到營養(yǎng)元素和培養(yǎng)條件的影響。在后續(xù)研究中,研究者可以從蛋氨酸在微球菌內(nèi)的合成途徑著手,掌握合成途徑中關(guān)鍵酶和重要前體物質(zhì),使用RT-PCR檢測合成途徑中關(guān)鍵酶的基因表達水平。通過基因改造的方式解除關(guān)鍵物質(zhì)的反饋調(diào)節(jié),提高關(guān)鍵酶的酶活,實現(xiàn)對各個前體物質(zhì)的綜合調(diào)控,進一步提高微球菌中蛋氨酸的產(chǎn)量。