吳亞男,楊一涵,杜麗平,莊以彬*,劉濤*

1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

2(中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所,天津,300308)

糖基化反應是天然產物結構修飾中最常見和最重要的反應之一[1]。所連接的糖部分對其母體化合物的生物學性質具有深遠影響,并可顯著調節(jié)其生物利用度、生物活性和藥物性[2]。糖基化天然產物已成為一種廣泛應用于食品工業(yè)的天然化合物。例如,紅景天活性成分紅景天苷因其具有抗氧化等活性廣泛應用于食品和保健品領域[3];甜葉菊葉片中提取的甜菊糖苷因其高甜度、零熱量可用作甜味劑廣泛應用于食品領域[4]。從植物中直接分離提取或使用化學合成的方式獲取糖苷具有產率低、成本高等缺點[5]。相比之下,生物催化因其高效溫和的反應條件具有廣泛的應用空間。

苯乙醇苷類化合物(phenylethanoid glycosides,PhGs)是存在于植物界的具有抗炎、抗氧化和神經保護等多種生理活性的天然產物,廣泛應用于醫(yī)藥及保健食品領域[6]。其中松果菊苷和毛蕊花糖苷是最具代表的苯乙醇苷類化合物,在紅花釣鐘柳(Penstemonbarbatus)葉中的含量較為豐富[7]。

糖基化反應通常由UDP-糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferases,UGTs)催化,該類酶將糖基殘基從活化的核苷酸糖轉移到受體分子[8]。在過去的研究中,已經從多種植物中鑒定出大量的UGTs可催化黃酮類[9],萜類[10]以及苯丙素類[11]等多種化合物。然而,用于催化PhGs糖基化的酶僅有少量報道。YANG等[12]鑒定了3個來源于粗壯女貞的糖基轉移酶,它們參與了紫莖女貞苷B的生物合成。因此,從植物中進一步挖掘用于苯乙醇苷類化合物糖基化的UGTs具有非常大的意義。

為了尋找更多樣的催化苯乙醇苷類糖基化的糖基轉移酶,對富含該類化合物的紅花釣鐘柳轉錄組數據進行不同組織基因差異表達分析,得到了7條糖基轉移酶候選基因,經過異源表達及酶活性分析發(fā)現了一個具有催化桂葉苷B能力的糖基轉移酶?；诎被嵝蛄幸恢滦栽瓌t,UGT命名委員會(https://labs.wsu.edu/ugt/)將其歸為UGT712亞家族,這個新型糖基轉移酶可以催化桂葉苷B的苯乙醇部分C-4位置的糖基化形成一種新的糖苷產物。此外,通過底物譜分析發(fā)現UGT712A2對黃酮類、香豆素類等多種化合物都具備催化活性。因此,UGT712A2可能是一種潛在的新型多功能糖基轉移酶,用于苯乙醇苷類化合物和其他多種化合物的糖基化反應,從而催化生成新的糖苷化合物可應用于食品、醫(yī)藥等領域。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 分子克隆相關實驗材料

高保真DNA聚合酶、一步克隆試劑盒等,南京諾唯贊生物科技有限公司;PCR產物回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等,北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 蛋白表達和純化相關實驗材料

用于誘導蛋白表達的異丙基硫代半乳糖(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)母液濃度為1 mol/L;SDS-PAGE凝膠電泳預制膠和緩沖液以及用于蛋白純化的重力鎳柱,天地人和生物科技有限公司。

1.1.3 體外酶反應相關實驗材料

利用本實驗室大腸桿菌底盤細胞OB-4制備底物桂葉苷B[13];UDP-葡萄糖、胡黃連苷Ⅱ、東莨菪內酯,上海源葉生物科技有限公司;毛蕊花糖苷,四川省維克奇生物科技有限公司;槲皮素天津百倍生物科技有限公司;蘆丁,上海吉至生化科技有限公司;7-去甲基軟木花椒素,廣州市文?？茖W儀器有限公司。

1.1.4 儀器與設備

PCR儀,德國Eppendorf公司;核酸/垂直電泳儀,Bio-Red公司;超聲波細胞破碎儀,寧波新芝生物科技有限公司;JN3000PLΜS細胞破碎機,Jnbio公司;高效液相色譜儀,島津儀器有限公司;液質色譜聯(lián)用儀,安捷倫科技有限公司;600M核磁,Bruker Daltonics公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖基轉移酶的篩選

為了篩選編碼苯乙醇苷類化合物糖基化的UDP-糖基轉移酶的特定基因,首先以擬南芥88條糖基轉移酶基因作為檢索序列,對紅花釣鐘柳轉錄組數據進行本地BLAST,E值設置為1e-5[14]。使用CD-HIT以0.9的閾值對序列進行聚類以去除冗余序列。在去除短序列(<400個氨基酸)后,從轉錄組數據中挖掘出總共66個糖基轉移酶候選序列。

XIE等[7]發(fā)現紅花釣鐘柳葉中松果菊苷含量最多,莖中次之,根中最少?？紤]到參與苯乙醇苷類化合物糖基化的基因與苯乙醇苷類化合物含量表現出相似的表達模式,進行了不同組織中基因差異表達分析鑒定與松果菊苷含量共表達的糖基轉移酶候選基因。使用TBtools軟件進行聚類分析[15],基于皮爾遜相關系數(Pearson′s correlation coefficient,PCC)選取候選基因。

1.2.2 候選糖基轉移酶的分子克隆

PCR擴增目的片段,用Snapgene設計擴增引物如表1所示。擴增后的目的片段與載體pET-MBP進行無縫克隆;重組質粒轉化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞中。菌落PCR方法篩選陽性克隆進行DNA測序驗證。

表1 本研究所使用的引物

1.2.3 候選糖基轉移酶的異源表達

將測序正確的重組質粒轉入E.coliTransetta (DE3)中。轉化后的單克隆挑取至含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL氯霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中,在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)過夜;再按照1%的接種量轉接至含有50 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8,加入10 μL IPTG母液,且在16 ℃下培養(yǎng)18～22 h。收集菌體后用5 mL Buffer C(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,100 mmol/L NaCl)重懸,并使用超聲破碎儀破碎15 min,離心取上清液可進行體外粗酶反應。并使用SDS-PAGE檢測7個重組蛋白的表達情況。

1.2.4 酶活分析

在含有90 μL粗酶上清液、1 mmol/L UDP-葡萄糖、0.1 mmol/L桂葉苷B或者毛蕊花糖苷的100 μL反應體系中進行粗酶反應。將反應物在30 ℃下孵育5 h后加入100 μL甲醇終止。隨后,經離心收集上清液,然后通過HPLC和液相色譜高分辨質譜(liquid chromatography high-resolution mass spectrometry,LC-HRMS)進行分析。陰性對照實驗用100 ℃煮沸10 min的粗酶蛋白代替活性酶。

1.2.5 糖基化產物制備和純化

為了獲得足夠的糖基化產物以鑒定其催化位置和立體化學,首先對重組蛋白使用重力鎳柱進行純化。為了純化帶有6 × His標簽的重組蛋白,將細菌細胞重懸于緩沖液A(50 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L咪唑,100 mmol/L NaCl,pH 7.5)中。細胞破碎機3次破碎混懸液,離心后將上清液上樣至預平衡好的親和色譜柱。然后用30 mL Buffer A洗滌具有目的蛋白的色譜柱,并用15 mL Buffer B(50 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L咪唑,100 mmol/L NaCl,pH 7.5)洗脫。通過SDS-PAGE驗證重組蛋白純度。

使用純化后的MBP-UGT712A2蛋白1 mL、10 mmol UDP-葡萄糖和1 mmol桂葉苷B在30 ℃下孵育5 h,并用1 mL甲醇終止離心后在35 ℃下通過旋轉蒸發(fā)儀濃縮上清液,并溶于50%甲醇中。隨后,使用配有SPD-20 A檢測器的Shimadzu LC-6 AD系統(tǒng)和Shim-pack PREP-ODS(H)色譜柱(10 mm×250 mm,5 μm)進行半制備HPLC分離。乙腈(B)和甲酸(0.1%)(A)作為流動相,流速為4 mL/min。梯度條件如下:18% B,5 min;18%～23.5% B,55 min;100% B,8 min;18% B,8 min。321 nm波長下收集新峰產物。

將純化后的糖苷產物溶于600 μL CD3OD,使用600 MHz Bruker Advance Ⅲ光譜儀進行核磁(nuclear magnetic resonance,NMR)分析,通過1H NMR、13C NMR、異核多鍵相關譜(heteronuclear multiple bond correlation,HMBC)和異核單量子相關譜(heteronuclear single quantum coherence,HSQC)來判斷產物結構,從而確定UGT712A2對于桂葉苷B的催化功能。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹構建和底物譜分析

將UGT712A2與其他29條已鑒定功能的不同植物來源的糖基轉移酶一起構建系統(tǒng)進化樹。使用MEGA7軟件,ClustalW方法進行序列比對,并使用鄰近樹法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

為研究UGT712A2的底物混雜性,使用UDP-葡萄糖作為糖供體檢測了不同的糖受體底物,在100 μL含50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L氯化鈉的緩沖液中加入100 μg純的MBP-UGT712A2,0.5 mmol/L受體底物和5 mmol/L供體底物UDP-葡萄糖進行反應。將所有反應物在30 ℃下孵育5 h,并用100 μL甲醇終止。然后將混合物離心取上清液用于HPLC/LC-HRMS分析。

1.2.7 HPLC和LC-HRMS分析

反應上清液使用配有SPD-M40 PDA檢測器的Shimadzu LC-20AD HPLC系統(tǒng)和SilGreen C18 column 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)進行HPLC分析,乙腈(B)和甲酸(0.1%)(A)作為流動相,流速為1 mL/min。其中,桂葉苷B以及毛蕊花糖苷做糖基受體時的分析梯度是:5% B,5 min;5%～13.2% B,13 min;18%～21.6% B,25 min;其余化合物的酶反應分析梯度是:5% B,5 min;5%～25% B,20 min。

對于樣品的LC-HRMS分析在Agilent 1200 HPLC系統(tǒng)上進行,該系統(tǒng)與配備有電噴霧電離裝置的Bruker-MicrOTOF-II質譜儀偶聯(lián)。正離子模式下進行檢測,其檢測條件與HPLC分析相同。

2 結果與分析

2.1 候選基因的篩選結果

結合使用聚類分析和皮爾遜相關系數分析,從紅花釣鐘柳中提取了7個候選糖基轉移酶的開放閱讀框,其表達量與相關性如圖1所示。

圖1 紅花釣鐘柳中與松果菊苷含量共表達的糖基轉移酶候選基因的表達譜

2.2 蛋白表達情況

SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況如圖2所示,通過分析重組蛋白在全細胞(C),上清液(S)以及沉淀(P)中的表達,可以看出7個候選基因的重組蛋白在Transetta(DE3)均有表達。

圖2 重組蛋白MBP-PbUGTs的SDS-PAGE電泳分析圖

2.3 體外酶促反應結果

以UDP-葡萄糖為糖基供體,以桂葉苷B(1)和毛蕊花糖苷(2)為糖基受體底物,分別與7個候選糖基轉移酶的粗酶上清液進行體外酶反應。HPLC和LC-HRMS檢測結果發(fā)現c32938對桂葉苷B和毛蕊花糖苷有催化活性。本文通過UGT命名委員會將c32938命名為UGT712A2。HPLC檢測結果如圖3-a所示,UGT712A2的可以催化桂葉苷B和毛蕊花糖苷分別產生新峰1a和2a。LC-HRMS結果如圖3-b和圖3-c所示,新峰產物1a和2a都是在受體底物分子基礎上加了一分子的葡萄糖。表明UGT712A2具有催化其葡萄糖基化反應的能力。

a-酶催化反應HPLC分析;b-糖基化產物1a的LC-HRMS分析;c-糖基化產物2a的LC-HRMS分析

2.4 體外酶促反應結果

為進一步確定UGT712A2對苯乙醇苷類化合物的催化位點,首先獲得了較純的重組蛋白MBP-UGT712A2,其SDS-PAGE檢測結果如圖4-a所示。通過擴大體外酶反應制備產物1a,最終獲得1.6 mg 1a(HPLC>98%)。最終獲得糖苷產物1a核磁數據:1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ7.68 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7″),7.49 (2H,d,J=8.7 Hz,H-2″/6″),7.22 (2H,d,J=8.6 Hz,H-2/6),7.04 (2H,d,J=8.6 Hz,H-3/5),6.83 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3″/5″),6.36 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8″),5.21 (1H,d,J=1.8 Hz,H-1″′),4.93 (1H,t,J=9.5 Hz,H-4′),4.88 (1H,d,J=7.4 Hz,H-1″″),4.40(1H,d,J=7.9 Hz,H-1′),4.10 (1H,m,H-8α),3.93 (1H,m,H-5′),3.91 (1H,dd,J=12.0,2.1 Hz,H-6″′α),3.83 (1H,t,J=9.2 Hz,H-3′),3.78 (1H,m,H-8β),3.72 (1H,dd,J=12.0,5.4 Hz,H-6″′β),3.64-3.29 (protons in rhamnose and glucoses),2.92 (2H,td,J=7.2,1.7 Hz,H-7),1.10 (3H,d,J=6.2 Hz,H-6″′);13C NMR (100 MHz,CD3OD)δ168.1 (C-9″),161.3 (C-4″),157.5 (C-4),147.4 (C-7″),133.8 (C-1),131.1 (C-2″,6″),130.8 (C-2,6),126.9 (C-1″),117.6 (C-3,5),116.7 (C-3″,5″),114.6 (C-8″),104.0 (C-1′),102.8 (C-1″′),102.3 (C-1″″),81.4 (C-3′),77.9-70.4 (carbons in rhamnose and glucoses),72.2 (C-5″′),71.8 (C-8),62.3/62.2 (C-6′/6″″),36.2 (C-7),18.2 (C-6″′)。通過HMBC分析發(fā)現,UGT712A2催化桂葉苷B形成新的苯乙醇苷類化合物桂葉苷B-4-O-葡萄糖苷。其糖基化反應結構式如圖4-b所示。

a-重組蛋白MBP-UGT712A2的SDS-PAGE電泳分析圖;b-UGT712A2催化桂葉苷B(1)的糖基化反應

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹與底物譜分析

本文將UGT712A2與已鑒定功能的植物UGTs進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,結果如圖5-a所示。UGT712A2和來源于蘋果的MdUGT83L3(MD09G1064900)在同一分支上。其可以催化花青素、槲皮素以及山奈酚3種黃酮類化合物的葡萄糖基化反應[16];梔子來源的糖基轉移酶UGT85A24(F8 WKW1.1),特異性催化環(huán)烯醚萜類糖苷的葡萄糖基化反應[17];與UGT712A2進化關系較近的糖基轉移酶,可以催化不同類型化合物的葡萄糖基化反應[18-19]?；诖?本文對UGT712A2的底物譜進行探究。

a-系統(tǒng)發(fā)育樹分析;b-UGT712A2酶催化反應HPLC分析

本文以UDP-葡萄糖為糖基供體底物,以黃酮類化合物3、4,香豆素類化合物5、6,以及環(huán)烯醚萜類化合物7為糖基受體底物,用MBP-UGT712A2進行體外純酶反應。HPLC結果如圖5-b所示,UGT712A2可以催化不同的化合物產生多個新峰。同時,為了確定新峰產物的分子質量,對每個反應進行LC-HRMS檢測,結果如圖6所示,UGT712A2可以催化不同類型化合物加上一分子或者兩分子葡萄糖形成不同類型的糖苷產物3a、4a、4b、5a、6a、7a。

a-3a;b-4a;c-4b;d-5a;e-6a;f-7a

3 結論與討論

本研究以紅花釣鐘柳轉錄組為研究對象,基于不同組織中基因差異表達分析篩選到7條糖基轉移酶候選基因。通過酶活分析、產物制備、核磁分析等發(fā)現糖基轉移酶UGT712A2可以催化桂葉苷B苯乙醇部分C-4位置的葡萄糖基化反應生成桂葉苷B-4-葡萄糖苷。同時對UGT712A2進行了底物譜分析發(fā)現,它還可以催化毛蕊花糖苷,黃酮類化合物蘆丁和槲皮素,香豆素類化合物7-去甲基軟木花椒素和東莨菪內酯以及環(huán)烯醚萜類化合物胡黃連苷Ⅱ的酚羥基的葡萄糖基化反應,是一種具有功能多樣性的糖基轉移酶。

隨著合成生物學技術以及轉錄組高通量測序技術的發(fā)展,越來越多的糖基轉移酶被鑒定出來用于黃酮類、萜類等化合物的糖基化反應,但目前對于催化苯乙醇苷類化合物的糖基轉移酶的研究報道較少。YAN等[20]從管花肉蓯蓉轉錄組數據中分析獲得一個糖基轉移酶UGT71BD1可以催化毛蕊花糖苷等苯乙醇苷類化合物C-3″位的糖基化反應,同時也可以催化蘆丁等黃酮類化合物酚羥基的糖基化反應,通過水溶性和藥理活性檢測發(fā)現,其糖苷產物相對于糖基受體底物的水溶性和藥理活性都有所增加。體現了糖基轉移酶在提高天然產物的生理活性、溶解性以及穩(wěn)定性等方面的重要的作用。本研究組前期鑒定了來自粗壯女貞的3個參與紫莖女貞苷B生物合成的糖基轉移酶,UGT85AF8催化酪醇加上一分子葡萄糖生成紅景天苷;UGT79G7催化桂葉苷A加上一分子鼠李糖生成桂葉苷B;UGT79A19催化桂葉苷B加上一分子的鼠李糖生成紫莖女貞苷B。豐富了苯乙醇苷類化合物糖基轉移酶類型,并為苯乙醇苷類化合物生物合成途徑的解析奠定了基礎[12]。

為了豐富苯乙醇苷類化合物糖基轉移酶類型,本研究從紅花釣鐘柳轉錄組中篩選得到一個新型糖基轉移酶UGT712A2,該酶不僅可以催化苯乙醇苷類化合物C-4-OH位的糖基化反應,豐富苯乙醇苷類化合物的糖苷類型,還可以催化其他類型化合物,如蘆丁、槲皮素、7-去甲基軟木花椒素、東莨菪內酯以及胡黃連苷Ⅱ的葡萄糖基化反應,為后續(xù)醫(yī)藥及食品等領域新品研發(fā)提供重要候選物,也為植物糖苷類天然產物的異源微生物合成提供基本元件。