戴悅 彭金菊 張騰月 謝星朋 羅帥帥 譚綺梅 文嬌 馬驛

摘要 從廣東湛江紅樹林自然保護(hù)區(qū)的紅樹植物根際土壤中分離篩選出一株廣譜抑菌效果的菌株蠟樣芽孢桿菌M15，對(duì)菌株M15進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，采用特定發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，控制單一變量，對(duì)裝液量、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其抑菌活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和蛋白酶耐受性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：菌株M15的發(fā)酵條件為裝液量30 mL、接種量2%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間120 h時(shí)，發(fā)酵液的抑菌效果最佳，對(duì)大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌抑菌圈直徑均為17 mm，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為15 mm；發(fā)酵培養(yǎng)基pH小于5.0或者大于6.0時(shí)，抑菌活性喪失；菌株M15的發(fā)酵液抑菌活性在30 ～60 ℃較穩(wěn)定，但≥80 ℃時(shí)，發(fā)酵液抑菌物質(zhì)失去活性；抑菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶不敏感，對(duì)木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感。

關(guān)鍵詞 蠟樣芽孢桿菌；抑菌物質(zhì)；發(fā)酵條件優(yōu)化；抑菌效果

中圖分類號(hào) TQ 920? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）06-0006-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.002

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of Fermentation Conditions and Inhibition Effect of a Strain of Bacillus cereus Producing Inhibitory Substances

DAI Yue，PENG Jin-ju，ZHANG Teng-yue et al

（Department of Veterinary Medicine，College of Coastal Agricultural Sciences，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524000）

Abstract A broad-spectrum antibacterial strain，Bacillus cereus M15，was isolated and screened from the rhizosphere soil of mangrove plants in Zhanjiang Mangrove Nature Reserve，Guangdong，the fermentation culture conditions were optimized for strain M15，using a specific fermentation medium based on the control of a single variable，the loading volume，inoculum，fermentation temperature and fermentation time.And its bacterial inhibitory active substances were measured for acid-base stability，heat stability and protease tolerance.The results showed that the fermentation conditions were 30 mL，2% inoculum，30 °C fermentation temperature and 120 h fermentation time，the fermentation solution had the best bacterial inhibition effect，and the circle diameter of inhibition for Escherichia coli，Streptococcus and Salmonella were 17 mm，and the circle diameter of inhibition for Staphylococcus aureus was 15 mm.When the pH of fermentation medium was less than 5.0 or more than 6.0，the antibacterial activity was lost;the antibacterial activity of fermentation broth of strain M15 was stable at 30-60 ℃，and the antibacterial substance of it loses activity when ≥80 ℃;the antibacterial activity was not sensitive to trypsin，but sensitive to papain，streptomycin E and proteinase K.

Key words Bacillus cereus;Bacteriostatic substances;Optimization of fermentation conditions;Inhibition effect

抗生素作為抗菌藥物廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域，但抗生素的濫用導(dǎo)致很多致病菌對(duì)其耐藥性增加，甚至出現(xiàn)超級(jí)細(xì)菌［1-2］。因此，急需研究和開發(fā)有抗菌活性的藥物來(lái)治療細(xì)菌性疾病。細(xì)菌素是一類由細(xì)菌核糖體合成的抗微生物蛋白質(zhì)或多肽，其具有無(wú)耐藥性、不殘留、能夠抑制或殺死某些致病菌等特點(diǎn)，可用于臨床預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病［3-5］。

作為一種動(dòng)植物微生態(tài)中的優(yōu)勢(shì)菌種，芽孢桿菌具有豐富的種類和廣泛的來(lái)源，它們可以在土壤、水體、空氣以及動(dòng)物腸道等環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)，具有多樣性和普遍性［6-7］。研究表明，芽孢桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素比乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素抗菌譜更廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑菌作用，能更加適應(yīng)環(huán)境和應(yīng)用生產(chǎn)中酸堿度和高溫等影響因素，這些優(yōu)良特性提示芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和類細(xì)菌素具有廣泛的應(yīng)用前景［8］。其中，蠟樣芽孢桿菌可以分泌多種細(xì)菌素，分泌的細(xì)菌素有cerein 7、cerein 7B、cerein 8A、cerein MRX1等［9-11］。該研究從紅樹植物根際土壤中分離具有廣譜抑菌效果的菌株M15，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，并對(duì)其抑菌活性物質(zhì)的酸堿度穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和蛋白酶耐受性進(jìn)行測(cè)定，確定該菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

從廣東湛江紅樹林自然保護(hù)區(qū)的紅樹植物根際土壤中分離具有廣譜抑菌效果的菌株，篩選一株對(duì)病原菌拮抗作用最好的菌株，通過(guò)全基因測(cè)序分析，菌株被鑒定為蠟樣芽孢桿菌，命名為蠟樣芽孢桿菌M15。

1.2 指示菌株

大腸桿菌（批號(hào)為D0028B）、金黃色葡萄球菌（批號(hào)為F0009B）、沙門氏菌（批號(hào)為F0014B）、鏈球菌（批號(hào)為G0041DX），均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：每100 mL培養(yǎng)基中含葡萄糖 4.00 g、牛肉膏0.50%、酵母提取物0.50 g、蛋白胨1.50 g、NaH2PO4·2H2O 0.02 g、Na2HPO4·2H2O 0.05 g、Mg2SO4·7H2O 0.05 g、CaCl2 0.02 g、MnSO4 0.02 g。

LB液體培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.4 菌株的發(fā)酵液培養(yǎng)及抑菌活性測(cè)定

蠟樣芽孢桿菌M15在28 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，將發(fā)酵液置于離心機(jī)離心以獲得上清液，4 ℃、8 000 r/min 離心30 min。上清液的無(wú)菌處理：離心獲得的上清液采用濾膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌處理，濾膜孔徑為0.22 μm。采用固體瓊脂打孔法分別測(cè)定無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌效果，每組重復(fù)3次，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.5 菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.5.1 裝液量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。

以2%的接種量分別將培養(yǎng)過(guò)夜的蠟樣芽孢桿菌M15接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，4個(gè)不同的培養(yǎng)基裝液量（30、50、70 和100 mL）置于恒溫振蕩器中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h后，重復(fù)3次測(cè)量不同裝液量對(duì)發(fā)酵液抑菌物質(zhì)活性的影響。

1.5.2 接種量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。

將培養(yǎng)過(guò)夜的蠟樣芽孢桿菌M15分別以6個(gè)不同的接種量（1%、2%、4%、6%、8%和10%）至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于恒溫振蕩器中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h后，重復(fù)3次測(cè)量不同接種量對(duì)發(fā)酵液抑菌物質(zhì)活性的影響。

1.5.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。

以2%的接種量將培養(yǎng)過(guò)夜的蠟樣芽孢桿菌M15接種至30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，5個(gè)不同的溫度（28、30、34、37和40 ℃）置于恒溫振蕩器中，180 r/min培養(yǎng)72 h后，重復(fù)3次測(cè)量不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌物質(zhì)活性的影響。

1.5.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。

以2%的接種量將培養(yǎng)過(guò)夜的蠟樣芽孢桿菌M15接種至30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，7個(gè)不同時(shí)間（24、48、72、96、120、144和168 h）置于恒溫振蕩器中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)，重復(fù)3次測(cè)量不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌物質(zhì)活性的影響。

1.6 抑菌物質(zhì)酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定

采用孔徑為0.22 μm濾膜，對(duì)離心獲得的蠟樣芽孢桿菌M15上清液進(jìn)行無(wú)菌處理后，分別用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)6個(gè)不同的pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），室溫放置1 h，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)指示菌的抑菌效果，每組重復(fù)3次，比較抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性，將未處理組設(shè)定為對(duì)照組。

1.7 抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性的測(cè)定

采用孔徑為0.22 μm 濾膜，對(duì)離心獲得的蠟樣芽孢桿菌M15上清液進(jìn)行無(wú)菌處理后，在4個(gè)溫度（40、60、80、100 ℃）的水浴鍋中放置30 min，待溫度降低至室溫后，測(cè)定熱處理后的發(fā)酵液對(duì)指示菌的抑菌效果，比較抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性，每組重復(fù)3次，將未處理組設(shè)定為對(duì)照組。

1.8 抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶耐受性的測(cè)定

采用孔徑為0.22 μm 濾膜，對(duì)離心獲得的蠟樣芽孢桿菌M15上清液進(jìn)行無(wú)菌處理后，在上清液中分別加入濃度均為1 mg/mL的4個(gè)蛋白酶（木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、胰蛋白酶、蛋白酶K），37 ℃水浴鍋中放置1 h，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)指示菌的抑菌效果，比較抑菌物質(zhì)對(duì)不同蛋白酶的耐受性，每組重復(fù)3次，將未處理組設(shè)定為對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

由圖1可知，M15全基因組與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已知芽孢桿菌全基因組對(duì)比，運(yùn)用PGAP1.2.1軟件，構(gòu)建Neighbor-joining物種間系統(tǒng)進(jìn)化樹，菌株M15和蠟樣芽孢桿菌BAG5X12-1親緣關(guān)系最近，菌株M15被鑒定為一株蠟樣芽孢桿菌，命名為蠟樣芽孢桿菌M15。

2.2 菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 裝液量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。

由表1可知，裝液量≥70 mL時(shí)，發(fā)酵液對(duì)4種指示菌均無(wú)抑菌活性；裝液量在30 mL時(shí)，發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最佳，故選擇30 mL的裝液量。

2.2.2 接種量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。

由表2可知，6個(gè)不同接種量的發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑差異不明顯，其中接種量為2%時(shí)發(fā)酵液抑菌圈直徑最大，故選擇2%的接種量。

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。

由表3可知，發(fā)酵溫度在40 ℃時(shí)，發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑最?。话l(fā)酵溫度在30 ℃時(shí)，發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最佳，故選擇30 ℃的發(fā)酵溫度。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。

由表4可知，發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑最?。辉?20 h時(shí)，發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最佳，故選擇120 h的發(fā)酵時(shí)間。

2.3 抑菌物質(zhì)酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定

由表5可知，與對(duì)照組比較（對(duì)照組pH與細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵液的pH一致，為5.5），不同酸堿度對(duì)抑菌活性物質(zhì)影響差異較大，發(fā)酵培養(yǎng)基pH小于5.0或者大于6.0時(shí)，抑菌物質(zhì)活性喪失，pH為5.5時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性最強(qiáng)。

2.4 抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性的測(cè)定

由表6可知，與對(duì)照組比較（對(duì)照組溫度與細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)的最佳溫度一致，為30 ℃），發(fā)酵液經(jīng)過(guò)不同溫度處理后，在40～60 ℃抑菌效果有所下降，但是抑菌活性依舊接近90%，故發(fā)酵液抑菌物質(zhì)活性在30～60 ℃較穩(wěn)定，但≥80 ℃時(shí)，發(fā)酵液抑菌物質(zhì)失去活性。

2.5 抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶耐受性的測(cè)定

由表7可知，與對(duì)照組比較（對(duì)照組不加酶），胰蛋白酶處理后的發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌活性無(wú)變化；木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K處理后的發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌活性下降。故抑菌物質(zhì)對(duì)木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感，對(duì)胰蛋白酶不敏感。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)從紅樹植物根際土壤中分離具有廣譜抑菌效果的蠟樣芽孢桿菌M15，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的發(fā)酵條件：裝液量30 mL、接種量2%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間120 h時(shí)，發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)效果最佳。劉瑾等［12］對(duì)芽孢桿菌P9培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化，得到發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h，抑菌物質(zhì)抑菌圈比初始抑菌圈直徑擴(kuò)大1.7倍。解麗娟等［13］研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)條件在裝液量為40 mL、接種量為2%時(shí)，發(fā)酵后菌液濃度最高，得到的抑菌物質(zhì)也是最高。與文獻(xiàn)相比，該試驗(yàn)的芽孢桿菌M15發(fā)酵條件與上述文獻(xiàn)報(bào)道的芽孢桿菌發(fā)酵條件相近時(shí)，所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的抑菌效果最佳。

在對(duì)蠟樣芽孢桿菌M15的抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液的pH在5.0～6.0時(shí)，抑菌物質(zhì)活性較高，說(shuō)明該菌在偏酸性條件下培養(yǎng)可以增加抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢生長(zhǎng)最適合的pH在5.5～6.5［14-15］。蠟樣芽孢桿菌M15的發(fā)酵液溫度在30～60 ℃抑菌物質(zhì)活性較穩(wěn)定，但溫度≥80 ℃時(shí)，發(fā)酵液抑菌物質(zhì)失去活性。姚佳明［16］研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌B815-1發(fā)酵上清的抑菌物質(zhì)在30～60 ℃上清液的抑菌活性維持較高水平，但是>80 ℃抑菌活性顯著下降。劉佳慧等［17］對(duì)一株蕈狀芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果表明最佳的溫度為30 ℃。蠟樣芽孢桿菌M15的抑菌物質(zhì)對(duì)木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感，對(duì)胰蛋白酶不敏感。張毅等［18］研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物對(duì)蛋白酶K水解作用敏感。于秀菊等［19］對(duì)來(lái)自羊駝腸道中的地衣芽孢桿菌AF08發(fā)酵上清液抑菌物質(zhì)是否耐受蛋白酶的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鏈霉蛋白酶E處理組中，抑菌活性完全喪失。說(shuō)明不同的芽孢桿菌代謝產(chǎn)物都可能是蛋白類產(chǎn)物。

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