摘 要：為研究板栗黃化皺縮病植原體空間分布情況，對(duì)輸液治療和未治療的栗樹進(jìn)行不同部位和不同物候期葉片植原體的檢測，結(jié)果表明：輸液2年栗樹檢出率最低，感病栗樹植原體檢出率最高；在枝條上端葉片和果實(shí)成熟期的葉片植原體檢出率最高，在下端的檢出率最低。治療1年、治療2年以及未治療的栗樹檢出率都隨著物候期的變化而變化，在萌芽期葉片中未檢出植原體，芽軸伸長期開始檢測到植原體的存在，果實(shí)成熟期植原體檢出率最高。

關(guān)鍵詞：黃化皺縮??；植原體；空間分布；檢出率

中圖分類號(hào)：S436.64 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.19440/j.cnki.1006-9402.2024.04.008

自1967年發(fā)現(xiàn)以來，植原體已經(jīng)危害了300多種植物，其傳播速度快、分布范圍廣、寄主種類廣泛，寄主包括糧食作物、油料作物、林果樹以及花卉等植物[1]。目前，對(duì)植原體的檢測使用最多的方法為直接PCR、巢式PCR檢測技術(shù)，與其他方法相比該檢測方法簡單、靈敏[2]。板栗黃化皺縮病是危害板栗的一種重要的植原體病害，植原體在板栗空間分布尚缺乏系統(tǒng)研究，因此本試驗(yàn)利用PCR檢測技術(shù)，通過對(duì)板栗樹枝條不同部位葉片以及不同物候期的葉片植原體的檢測，分析植原體的檢出率，旨在明確板栗黃化皺縮病植原體的空間分布規(guī)律，為病害診斷及防控該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集時(shí)間 試驗(yàn)地點(diǎn)位于河北省秦皇島市青龍滿族自治縣肖營子鎮(zhèn)板栗種植基地，供試板栗樹樹齡為20年，品種為燕麗。試驗(yàn)設(shè)置分為3個(gè)處理感病未輸液治療、感病輸液治療1年和感病輸液治療2年，輸液藥劑為鹽酸四環(huán)素，其它正常管理且管理方式一致。

本試驗(yàn)于2023年4月至2023年10月進(jìn)行采樣，采集感病輸液1年、感病輸液2年以及感病未輸液板栗樹的葉片，以后在每個(gè)不同的物候期采集1次樣品，即按板栗的萌芽期（4月27日）、芽軸伸長期（5月10日）、展葉期（6月18日）、雄花開放期（7月18日）、雌花開放期（8月18日）、成熟期（9月8日）、落葉期（10月12日）進(jìn)行樣品采集。

1.2 樣品采集方法 每個(gè)處理3株樹，每株樹從樹干中部采集4個(gè)主枝（東、南、西、北）上的1年生枝條；將每個(gè)主枝分為上、中、下三部分，從主枝的頂端開始0～≤50 cm為第1部分，＞50～≤100 cm為第2部分，＞100～≤150 cm為第3部分，每個(gè)主枝的上、中、下3個(gè)部分分別采集葉片，每株樹12個(gè)樣品，9棵樹共計(jì)108個(gè)樣品，將采集好的葉片及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室放置于 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因的擴(kuò)增 利用康為試劑盒（CW0531M）提取板栗葉片的總DNA，將采集好葉片的DNA樣品作為直接PCR的模板，對(duì)輸液板栗樹和未輸液板栗樹采用16SrDNA基因通用引物R16mF2/R16mR1進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增。將已經(jīng)進(jìn)行直接PCR過的產(chǎn)物用ddH2O稀釋10倍作為第二輪巢氏PCR的模板，用通用引物R16F2n/R16R2為引物對(duì)輸液板栗樹和未輸液板栗樹進(jìn)行第二輪巢氏PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系以及反應(yīng)條件參考蘭淑慧[3]的檢測方法。對(duì)得到的巢氏PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳液檢測是否獲得與植原體目的片段大小的單一條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物候期病樹葉片植原體檢出情況分析 由表1可知，通過對(duì)發(fā)病樹體植原體的檢測得出不同物候期植原體的檢出率，在休眠期和萌芽期均未檢出植原體。在芽軸伸長期、展葉期、雄花開放期、雌花開放期、果實(shí)成熟期的植原體檢出率是逐步遞增的，檢出率分別為7.41%、24.07%、28.11%、48.15%、50.00%，這表明植原體隨著果實(shí)生長發(fā)育可在體內(nèi)積累。在果實(shí)成熟后，植原體檢出率明顯下降，在落葉期，植原體的檢出率為2.78%。

2.2 病樹不同部位葉片植原體檢出情況分析 不同物候期不同部位葉片植原體的檢測結(jié)果見（表2），在休眠期和萌芽期主枝上、中、下部位葉片均未檢測出植原體，在芽軸伸長期、展葉期、雄花開放期、雌花開放期、果實(shí)成熟期主枝上、中、下部位葉片中植原體的檢出率逐步遞增，檢出率在上部最低為13.89%，最高為86.11%；中部最低為5.56%，最高為66.67%；下部最低為2.78%，最高為16.67%。由數(shù)據(jù)可以看出在枝條頂端葉片的檢出率高于中端和下端，中端的檢出率又高于下端檢出率，在落葉期上、中和下部的檢出率均降低。

2.3 輸液治療后的栗樹葉片植原體檢測情況 在不同物候期對(duì)未經(jīng)過輸液治療的板栗病樹與經(jīng)過輸液治療后的板栗樹進(jìn)行植原體檢測（表3），在休眠期和萌芽期治療和未治療的感病樹均未檢測出植原體的存在；未輸液病樹從芽軸伸長期至落葉期均可以檢出植原體，雌花開放期和果實(shí)成熟期檢出率最高，分別為48.15%、50.00%；輸液1年板栗樹從芽軸伸長期至果實(shí)成熟期均可以檢出植原體，雌花開放期和果實(shí)成熟期檢出率也是最高，但只有12.04%和12.96%；輸液2年栗樹從芽軸伸長期到果實(shí)成熟期均檢出植原體，但檢出率都很低，最高的檢出率只有1.86%，而在落葉期治療1年和2年的栗樹葉片中均未檢出植原體。

3 結(jié)論與討論

截止到目前，對(duì)板栗黃化皺縮病植原體分布的研究還未見報(bào)道，本研究結(jié)果表明，植原體在不同物候期的檢出率不同，果實(shí)成熟期最易檢出。在果實(shí)成熟后，植原體檢出率明顯下降。在萌芽期對(duì)主枝上、中、下部位葉片均未檢測出植原體，在枝條頂端葉片的檢出率最高，其次為中端和下端。落葉期枝條上、中和下部位葉片植原體的檢出率比其它物候期的檢出率降低明顯。感病未輸液的栗樹檢出率最高，其次為輸液1年板栗樹，輸液2年板栗樹檢出率最低，對(duì)發(fā)病板栗樹輸液2年后，植原體病害得到很大程度改善，這一結(jié)果表明鹽酸四環(huán)素的輸液治療可有效治療板栗黃化皺縮病，從而使栗樹達(dá)到應(yīng)有的產(chǎn)量和質(zhì)量。

20世紀(jì)90年代初人們首次利用PCR技術(shù)檢測植原體病害[4]，PCR檢測技術(shù)操作簡便、快捷、靈敏度高。介大偉等[5]通過植原體在毛泡桐不同發(fā)病程度的部位研究分布特點(diǎn)。趙錦等[6]研究棗瘋植原體周年消長規(guī)律發(fā)現(xiàn)植原體7、8月處于發(fā)病高峰期，病原濃度最高，隨物候期的變化有所下降，本文與其研究結(jié)果一致。

參考文獻(xiàn)

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