摘 要：采用平板對峙法和離體葉片防效法，測定從深州蜜桃果園發(fā)病植株的健康桃果實(shí)中分離篩選出生防菌株枯草芽孢桿菌SF-29對桃樹黑星病病原菌嗜果枝孢菌的抑制作用。結(jié)果表明：菌株SF-29能夠分泌胞外抑菌物質(zhì)，對嗜果枝孢菌孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到93.28%。

關(guān)鍵詞：桃樹黑星病；生防細(xì)菌篩選；病原菌抑制

中圖分類號：S436.621 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.19440/j.cnki.1006-9402.2024.04.005

深州蜜桃鮮嫩多汁，汁甜如蜜，在國內(nèi)外享有盛譽(yù)[1]。桃黑星病是桃樹常見的主要病害之一，我國各桃產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。前期果實(shí)小，病斑不易被發(fā)現(xiàn)。由于該病的危害，常使果品質(zhì)量變劣，嚴(yán)重影響桃的經(jīng)濟(jì)效益。除侵染桃外，還能侵害李、杏等核果類果樹。

細(xì)菌是一種重要的生防物質(zhì)，也是一種極具應(yīng)用前景的生防劑[2]。本研究以深州蜜桃為對象，進(jìn)行了黑星病生防菌的篩選及生防效果評價(jià)，以期為深州蜜桃的生物防治提供理論依據(jù)和生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料 供試菌株：桃樹黑星病病菌（嗜果枝孢菌）分離自深州蜜桃病害果實(shí)，并保存于衡水學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；生防菌分離自蜜桃園發(fā)病植株的健康桃果實(shí)。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基。

儀器：生化培養(yǎng)箱SPX-150B-Z，高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-50A，超凈工作臺BJ-2CD，紫外分光光度計(jì)T9CS；冰箱BCD-226TX，TS-211B臥式振蕩培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 生防細(xì)菌分離與純化 生防菌分離與純化參照劉旭等[3]的方法進(jìn)行。2021年10月從染病植株上隨機(jī)選取健康桃果，用自來水清洗，然后在消毒工作臺上用消毒過的濾紙吸干；再用70%乙醇沖洗40 s，0.9%次氯酸鈉沖洗10 min，最后用無菌水沖洗4～5遍。用最后1次的清洗液作為對照組（200 ul），涂于NA板上，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，如果沒有菌生長，則說明組織表面已無菌。將5 g已完全消毒的桃果原料放置在裝有少許石英沙的滅菌研缽中，碾磨直到成漿狀，添加1 mL無菌水，放置15 min，將上清物稀釋到3個(gè)濃度梯度10-1，10-3，10-5，每濃度取1 mL涂布于NA平板上，重復(fù)3次，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。選取單個(gè)菌種進(jìn)行純化，以作試驗(yàn)用菌種。

1.2.2 生防細(xì)菌篩選

1.2.2.1 平板對峙法 取28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d的病原菌，打取菌落邊緣菌盤（d=5 mm），放置于PDA平板中心，以待測微生物為接種物，置于病原菌兩側(cè)3 cm處平行劃線培養(yǎng)，28 ℃，培養(yǎng)4 d，測定抑菌圈的寬度，篩選抑菌效果較好的菌株進(jìn)行后續(xù)研究[3]。

1.2.2.2 離體葉片防效試驗(yàn) 嗜果枝孢菌孢子懸浮液的制備[4]：以桃果園為材料，收集受病菌侵染的新葉片，送至實(shí)驗(yàn)室，用水漂洗，用無塵棉包好葉柄，放入裝有潮濕濾紙的平板上，20 ℃保濕培養(yǎng)2 d。用無菌刷子把病斑上的分生孢子刷到無菌水里制成孢懸液，然后以2 000 r/min，離心15 min，離心3次，然后用去離子水進(jìn)行稀釋，得到8€？05 cfu/mL的孢懸液，待用。

生防菌發(fā)酵液配制：將生防菌接種于100 mL滅菌的 NA培養(yǎng)液中，28 ℃，120 r/min，培養(yǎng)48 h。得到的發(fā)酵液用無離子水稀釋至108 cfu/mL孢懸液，備用。

選擇健康、長勢均勻的桃葉，無菌水清洗后，用無菌棉花蓋上葉柄，葉背向上，放在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中。1個(gè)培養(yǎng)皿放1片葉子，1片葉子為1重復(fù)，10次重復(fù)。葉片接種嗜果枝孢菌懸液（8€？05 cfu/mL），24 h后葉片噴1種待測生防菌懸浮液（108 cfu/mL），以無菌清水為對照，用一種封閉的薄膜將培養(yǎng)皿密封。光照和黑暗12 h交替，28 ℃保濕培養(yǎng)7 d。統(tǒng)計(jì)葉片發(fā)病情況，篩選出防治桃瘡痂病害效果較好的生防菌。

病情指數(shù)=Σ（各級別發(fā)病葉數(shù)×相應(yīng)等級）/（調(diào)查 葉片總數(shù)×9）×100;防治效果/%=（對照病情指數(shù)-處理 病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

0級表示，不帶病斑；1級，發(fā)病范圍不超過全葉5%；3級，發(fā)病范圍為全葉的6%～25%；5級，發(fā)病范圍可達(dá)26%～50%；7級時(shí)，發(fā)病區(qū)域達(dá)51%～75%；9級時(shí)，發(fā)病范圍超過76%，發(fā)生在全葉。

1.2.3 生防細(xì)菌鑒定 對所篩選到的生防菌進(jìn)行革蘭染色和顯微鏡下的形態(tài)學(xué)分析[5]。

1.2.4 生防菌株SF-29抑制嗜果枝孢菌分生孢子萌發(fā)的試驗(yàn) 生防菌株SF-29無菌發(fā)酵濾液的制備：按1%、3%、5%、7%、9%的接種量分別接種于LB培養(yǎng)液中制備發(fā)酵液。用0.22 €祄的濾膜過濾發(fā)酵液，獲得無菌發(fā)酵液，待用。將該菌株制成菌懸液（在500倍顯微鏡下可見25個(gè)孢子）與嗜果枝孢菌孢懸液配制成生防菌發(fā)酵液濃度為0、50、100、300、500 mL/L的混懸液，3次重復(fù)，以清水作對照，28 ℃，保濕培養(yǎng)8～10 h。觀察嗜果枝孢菌分生孢子萌發(fā)情況（芽管大于孢子的最小直徑，判定為萌發(fā)）［6］。

1.2.5 生防菌株SF-29抑菌物質(zhì)的提取及對嗜果枝孢菌的抑菌活性 生防菌SF-29接種于LB培養(yǎng)液中，28 ℃，150 r/min震蕩24 h，發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心20 min，除去菌體，上清液添加不同的硫酸銨，硫酸銨飽和度分別為10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，在4 ℃，放置24 h，棄上清，沉淀用25 mmol/L磷酸緩沖液溶解，分析脫鹽后，用濾紙片法[7]測定對嗜果枝孢菌的抑菌圈大小。以LB培養(yǎng)液為對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS18.0軟件、Duncan＇s方法及One-Way ANOVA 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防細(xì)菌分離與篩選 從深州蜜桃果實(shí)中共分離得到48株細(xì)菌。通過平板對峙法和離體葉片測定分離到的細(xì)菌。結(jié)果表明：篩選到7株細(xì)菌能有效地抑制桃瘡痂病菌（見表1）。平板對峙法測定SF-29的抑菌帶寬度最大，為25.31 mm，SF-29離體葉片防治效果最好，達(dá)到98.46%，因此，所篩選到的細(xì)菌SF-29為最優(yōu)生防細(xì)菌。

2.2 生防細(xì)菌SF-29的鑒定 生防細(xì)菌SF-297菌落形狀橢圓形、表面紋狀皺褶、凸起、有黏液不整齊，不透明、顏色為白色。SF-29菌株革蘭氏反應(yīng)陽性，直、小短桿，芽孢橢圓形。

生防細(xì)菌SF-297生理生化性質(zhì)由表2可知，甘露醇、木糖、檸檬酸鹽等為陽性反應(yīng)；纖維二塘、葡萄糖等為陰性反應(yīng)。

2.3 生防細(xì)菌與化學(xué)藥劑抑制嗜果枝孢菌孢子萌發(fā)的對比效果

2.3.1 生防細(xì)菌SF-29抑制嗜果枝孢菌孢子萌發(fā)的效果 生防細(xì)菌SF-29抑制嗜果枝孢菌孢子的萌發(fā)（如圖1）。不同接種量對嗜果枝孢菌孢子萌發(fā)的效果不同，接種量3%、SF-29無菌懸液與嗜果枝孢菌孢子懸液配比為500 mL/L時(shí)，嗜果枝孢菌孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到93.28%。依次增加接種量分別為4%、5%時(shí)，嗜果枝孢菌孢子萌發(fā)抑制率略有提高，分別為95.72%、96.39%。綜合考慮，采用3%的接種量。

2.4 生防細(xì)菌SF-29抑菌物質(zhì)的提取及對嗜果枝孢菌的抑菌活性 從表3可以看出，在硫酸銨濃度為10%～35%時(shí)，對嗜果枝孢菌都有抑制作用，硫酸銨濃度為30%時(shí)，所提取的化合物具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑達(dá)46.23 mm。

3 結(jié)論與討論

本研究采用平板對峙法和離體葉片法，測定從深州蜜桃果園發(fā)病植株的健康桃果實(shí)中分離篩選出的48株細(xì)菌對桃樹黑星病的防治效果。結(jié)果表明：SF-29在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了大量的外源抑菌物質(zhì)，硫酸銨濃度為30%時(shí)，所提取到的物質(zhì)對嗜果枝孢菌的抑菌圈直徑達(dá)46.23 mm，接種量3%、SF-29無菌懸液與嗜果枝孢菌孢子懸液配比為500 mL/L時(shí)，對嗜果枝孢菌孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到93.28%。

生防菌枯草芽孢桿菌是一類普遍分布于自然環(huán)境中的無病原微生物，可分泌大量具有抑菌活性的多肽，對革蘭氏陽性微生物具有抑制作用，對霉菌，革蘭氏陰性微生物及酵母等也具有抑制作用［8］。

本研究所篩選到的SF-29對桃樹黑星病菌嗜果枝孢菌具有較強(qiáng)的抑制作用，為桃黑星病的生物防治提供理論依據(jù)和生防菌資源。

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