摘 要：本文以梨枝條、果實(shí)以及梨根際土壤為試驗(yàn)材料，運(yùn)用平板對(duì)峙法分離篩選出對(duì)梨黑斑病具有拮抗作用的菌株。結(jié)果表明：根際土壤中分離到可培養(yǎng)細(xì)菌8種，梨枝、梨果內(nèi)分別分離到可培養(yǎng)菌株5種、3種；經(jīng)過初步篩選得出共有7株對(duì)梨黑斑病菌有抑制效果的菌株，再經(jīng)過復(fù)篩得出，7種菌株對(duì)梨黑斑病菌均有一定的抑制作用，但抑制效果不同，LZ d對(duì)梨黑斑病的拮抗作用最強(qiáng)，抑制率高達(dá)87%；其次是LT a和LT e，抑菌率為80.50%和83.25%；LG b和LT f的抑菌率為70.25%和78.50%；LZ e和LT h抑制效果最差，抑菌率僅為49.50%和55%。

關(guān)鍵詞：梨黑斑?。晦卓咕?；生物防治；根際土壤

中圖分類號(hào)：S436.612.1+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.19440/j.cnki.1006-9402.2024.04.003

梨黑斑病菌可以侵染梨樹的果實(shí)、葉片和新梢[1]，給梨產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失。目前常用化學(xué)防治，雖殺菌顯著，但化學(xué)農(nóng)藥破壞生態(tài)，影響生物多樣，危害人體，制約農(nóng)業(yè)發(fā)展。而生物防治優(yōu)勢(shì)突出，能避免病菌產(chǎn)生抗藥性，安全高效經(jīng)濟(jì)。據(jù)研究，梨黑斑病的主要病原種類是交鏈孢和細(xì)極鏈格孢，鏈格孢屬于真菌，寄生在植物上，引起植物發(fā)生病害[2]，郝金輝等人[3]分離篩選到的枯草芽孢桿菌可有效防治梨黑斑病且菌株能在梨果上定殖；王瀚等[4]人篩選得到了對(duì)核桃黑斑病病菌拮抗效果較好的細(xì)菌。本文篩選梨黑斑病菌的內(nèi)生拮抗菌，為梨黑斑病菌生物防治提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 健康雪花梨：購(gòu)自超市。健康梨植株根際土壤，健康梨樹枝條：采自健康梨果園。梨黑斑病菌：衡水學(xué)院生命科學(xué)系園林植物學(xué)試驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物組織微生物的分離 采用常規(guī)組織分離法。于超凈工作臺(tái)上，將新鮮梨樹枝條用75%酒精消毒30 s，20%次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3次，晾干，用無(wú)菌解剖刀和鑷子挑取枝條韌皮部0.1 g，放入無(wú)菌研缽，加1 mL無(wú)菌水研磨后靜置。吸取研磨液上層200 L涂布于NA培養(yǎng)基平板，涂勻，重復(fù)3次，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察記錄菌落生長(zhǎng)狀況[5]。將梨果實(shí)表皮去掉，用無(wú)菌鑷子挑取果肉置于NA培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察記錄菌落生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 土壤微生物的分離 梯度稀釋平板法。在河北衡水市梨園采集健康梨樹根際土壤樣品，先鏟開表層土，取10～15 cm深土壤裝入采集袋帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。稱取5 g土樣，在滅菌超凈臺(tái)加5 mL蒸餾水依次制成10-1 、10-2 、10-3、10-4 、10-5濃度懸液，分別吸取10-3、10-4、10-5各100 L滴加到NA培養(yǎng)基平板，每個(gè)濃度重復(fù)3次，于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)[5]。

1.2.3 拮抗菌的初篩 平板劃線法。于滅菌超凈工作臺(tái)上，將事先活化好的黑斑病菌用無(wú)菌打孔器（直徑8 mm）打取菌塊，取接種環(huán)在酒精燈上高溫消毒，然后在酒精燈旁冷卻，將已冷卻的接種環(huán)挑取菌種倒置于PDA平板中央，將接種環(huán)繼續(xù)灼燒冷卻，沾取純化好的菌落距離中心2 cm處均勻劃3次直線，重復(fù)上述過程完成其他菌種的篩選，并設(shè)置空白對(duì)照，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d后觀察微生物對(duì)病原菌的抑制作用。

在超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌打孔器（直徑8 mm）取活化好的梨黑斑病菌落塊置于PDA平板中央，滅菌接種環(huán)沾取純化菌落距梨黑斑病菌落塊中心2 cm處劃3次直線[4，7]，設(shè)空白對(duì)照，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3～5 d后觀察抑制作用。

1.2.4 拮抗菌復(fù)篩 采用平板對(duì)峙法。用無(wú)菌打孔器打取8 mm梨黑斑病菌菌塊置于PDA平板中心，干熱消毒鑷子夾取無(wú)菌濾紙片放于距菌餅2.5 cm處呈等邊三角形，用移液槍吸取測(cè)定細(xì)菌懸液浸濕濾紙片，每組重復(fù)3次，設(shè)空白對(duì)照（無(wú)菌水浸濕濾紙片）[5]；真菌拮抗性試驗(yàn)用打孔器打取菌塊均勻置于梨黑斑病菌餅周圍，設(shè)3次重復(fù)和對(duì)照，25 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h后開始觀察記錄抑菌帶寬度，直至對(duì)照長(zhǎng)滿平板[3]。

平均抑制率/%=[（對(duì)照菌落直徑 - 處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑]x100%

1.3 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平為5%（p≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物材料及根際土壤微生物分離結(jié)果

2.1.1 分離微生物的群落形態(tài)特征 經(jīng)過3～5 d的培養(yǎng)觀察，初步選出16種菌落用于梨黑斑病拮抗菌的篩選，將菌落進(jìn)行編號(hào)，分別為L(zhǎng)Z a、LZ b、LZ c、LZ d、LZ e、LG a、LG b、LG c、LT a、LT b、LT c、LT d、LT e、LT f、LT g、LT h，其中LT a、LT e、LT f為真菌，其它都為細(xì)菌，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 植物微生物分離結(jié)果 由表1可知，果實(shí)中分離到微生物菌落數(shù)量為28個(gè)，菌種有較多重復(fù)，故根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征的差別，經(jīng)過篩選得出果實(shí)微生物中共有3種菌，并將其分別命名為L(zhǎng)G a、LG b、LG c；枝條分離到微生物菌落數(shù)量為17，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征的差別，經(jīng)篩選得出枝條微生物中共有5種菌，并將其命名為L(zhǎng)Z a、LZ b、LZ c、LZ d、LZ e。

2.1.3 根際土壤微生物分離結(jié)果 由表2可知，根據(jù)不同濃度的土壤的菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地等特征的差別，共得到8種菌落，分別命名為L(zhǎng)T a、LT b、LT c、LT d、LT e、LT f、LT g、LT h。

2.2 拮抗菌初篩結(jié)果 經(jīng)過初篩觀察對(duì)比，共選出7種菌對(duì)梨黑斑病具有抑制效果，分別為L(zhǎng)T a、LT e、LT f、LT h、LG b、LZ d、LZ e，其中LT h、LG b、LZ d、LZ e為細(xì)菌，其它3種為真菌。

2.3 拮抗菌復(fù)篩結(jié)果 對(duì)初篩選出的7株拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，通過測(cè)量第7 d的梨黑斑病菌抑菌帶寬度。

由表3可知，與對(duì)照組相比，7種菌種對(duì)梨黑斑病菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，但抑制效果不同。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析可知，抑制效果最好且穩(wěn)定的是LZ d，抑菌率高達(dá)87%，LZ d與CK、LZ e、LT h之間抑菌率存在顯著性差異，但與LG b、LT a、LT e、LT f之間均無(wú)顯著性差異；其次，抑制效果較好的是LT a、LT e、LT f，它們與CK、LZ e之間存在顯著性差異，但與其他菌種之間均無(wú)顯著性差異； LZ e抑制效果最差，其平均抑菌圈寬度為（2.02±16） cm，抑菌率僅為49.50%，LZ e與LZ d、LT a、LT e、LT f之間均存在顯著性差異，但與CK、LG b、LT h之間無(wú)顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從健康梨果實(shí)、枝條、梨樹根際土壤中分別分離出了3、5、8種菌，經(jīng)過初篩，共選出7種菌對(duì)梨黑斑病菌具有抑制效果，經(jīng)過進(jìn)一步定量篩選和分析，篩選出2種對(duì)梨黑斑病菌抑制效果好的菌，分別是從枝條和梨樹根際土壤中分離出的拮抗菌LZ d和LT e，抑制率高達(dá)87%和83.25%，這為進(jìn)一步篩選梨黑斑病防治奠定了基礎(chǔ)。

后續(xù)可對(duì)拮抗菌的形態(tài)特征、生物學(xué)特性及分子生物學(xué)鑒定進(jìn)行研究，同時(shí)研究可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌和真菌以及根際土壤中微生物對(duì)梨黑斑病有拮抗作用的成分，分析是內(nèi)生菌本身的生物學(xué)特性還是其代謝產(chǎn)物對(duì)梨黑斑病有抑制作用，明確其抑制機(jī)理。梨黑斑病的防治，需要綜合運(yùn)用多種技術(shù)和方法，以減少病害對(duì)梨果產(chǎn)業(yè)的影響。隨著科技的進(jìn)步，相信會(huì)有更多的微生物被分離出來(lái)，為植物病害的生物防治提供更多的選擇，為梨黑斑病綜合防治提供一種新的選擇。

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收稿日期：2024-05-22

項(xiàng)目名稱：河北省濕地保護(hù)與綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心課題（2023XTCX001）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)目（HBCT2024170403）

第一作者簡(jiǎn)介：梁魁景，碩士，講師，主要從事植物病蟲害生物防治工作。