郜晨靜 羅亞萍△ 張 寧 郝夢桃

(1.河北中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科,河北 石家莊 050011;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)2021級博士研究生,北京 100105;3.河北中醫(yī)藥大學(xué)研究生院2020級碩士研究生,河北 石家莊 050091)

白塞病(Behcet's disease,BD)又稱貝赫切特綜合征,臨床缺乏特異性實(shí)驗(yàn)室檢查,主要以反復(fù)口腔和生殖器潰瘍、眼部無菌性葡萄膜炎、皮膚病變等臨床表現(xiàn)及皮膚針刺試驗(yàn)陽性為依據(jù)進(jìn)行診斷。BD是一種慢性、反復(fù)發(fā)作性疾病,隨著疾病的進(jìn)展,可損害全身多個器官及系統(tǒng),最常見的有血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸。除外眼部、全身大血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累者預(yù)后較差,BD患者大多預(yù)后良好。目前尚無治愈BD的特效藥物及方法,臨床主要以減輕癥狀,減少復(fù)發(fā),預(yù)防并發(fā)癥發(fā)生,延緩病情進(jìn)展作為治療目的。BD的主要臨床表現(xiàn)為口腔潰瘍及陰部潰瘍,與中醫(yī)學(xué)“狐惑病”的臨床癥狀相符[1],正如張仲景《金匱要略·百合狐惑陰陽毒病脈證治》所載:“狐惑之為病……蝕于喉為惑,蝕于陰為狐……甘草瀉心湯主之?！备什轂a心湯口服治療BD已在臨床廣泛應(yīng)用[2],名老中醫(yī)李發(fā)枝使用甘草瀉心湯治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍也取得較好療效[3]。但目前對其機(jī)制的研究較少,臨床缺乏有力的證據(jù)。本研究依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多種途徑探索的理念,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)研究分析甘草瀉心湯治療BD的作用機(jī)制,為甘草瀉心湯的臨床應(yīng)用和研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php),UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/),GeneCard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),PharmGkb數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/),TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/),OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/),DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/),STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/),PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),PDB數(shù)據(jù)庫(http://www1.rcsb.org),Cytoscape 3.8.0 軟件,R×64 4.0.5軟件,AutoDock Tools 1.5.6軟件,ChemOffice軟件,AutoDock-vina 1.2軟件,PERL軟件。

1.2 方法

1.2.1 甘草瀉心湯化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)篩選 將甘草瀉心湯所有藥物(甘草、干姜、半夏、黃芩、黃連、人參、大棗)名稱輸入TCMSP,設(shè)置生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為篩選條件,得出此方劑的化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫及“PERL”軟件,將化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)的蛋白基因進(jìn)行注釋、篩選。通過篩選條件“homo sapiens”“reviewed”,得到藥物靶點(diǎn)。

1.2.2 BD疾病靶點(diǎn)篩選 以“Behcet's disease”為關(guān)鍵詞,分別在GeneCard數(shù)據(jù)庫、PharmGkb數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索,獲得BD疾病靶點(diǎn)。

1.2.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲取 利用R×64 4.0.5軟件獲取藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn),為甘草瀉心湯治療BD的潛在靶點(diǎn)。

1.2.4 藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將交集靶點(diǎn)輸入 Cytoscape 3.8.0 軟件中,得到藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。其中四周圓圈代表藥物的成分,不同顏色代表不同藥物,中心方形代表疾病靶點(diǎn)基因,連線代表兩者之間聯(lián)系度,根據(jù)度 (Degree) 值進(jìn)行分類,Degree值越大,兩者聯(lián)系越緊密,據(jù)此得出甘草瀉心湯作用于BD的核心成分。

1.2.5 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將交集靶點(diǎn)上傳到STRING數(shù)據(jù)庫,選定物種為“人”,設(shè)置最高置信度≥0.9,獲得PPI信息。使用Cytoscape 3.8.0軟件建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖,下載對應(yīng)格式文件,并進(jìn)行拓?fù)浞治?。根?jù)節(jié)點(diǎn)連接Degree值、半局域中心性(semi-local centrality)等參數(shù)連續(xù)篩選3次后得到核心靶點(diǎn)。Degree值、半局域中心性數(shù)值越高,相互聯(lián)系越緊密,關(guān)聯(lián)性越高。

1.2.6 基因本體(GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 使用R×64 4.0.5軟件和腳本對交集靶點(diǎn)文件進(jìn)行id轉(zhuǎn)換后,進(jìn)行GO功能富集以及KEGG通路富集分析。選取功能富集程度前10位的條目制成柱狀圖,富集程度前30的通路制成氣泡圖進(jìn)行可視化。

1.2.7 分子對接驗(yàn)證 在PDB數(shù)據(jù)庫下載甘草瀉心湯的核心成分(配體)的2D結(jié)構(gòu),使用ChemOffice軟件將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)。在PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)基因(受體)的3D結(jié)構(gòu),去除其內(nèi)部小分子配體和水分子結(jié)構(gòu),儲存后錄入到AutoDock Tools 1.5.6軟件中,上傳加氫之后的受體文件,設(shè)置其原子種類后,將其轉(zhuǎn)化為“pdbqt”格式。使用AutoDock-vina 1.2軟件將受體及配體進(jìn)行對接,得出對接圖。

2 結(jié)果

2.1 甘草瀉心湯化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 在 TCMSP數(shù)據(jù)庫中共得到236個化學(xué)成分、3480個作用靶點(diǎn),化學(xué)成分中甘草102個,黃芩46個,大棗29個,人參6個,半夏19個,黃連24個,干姜10個。使用UniProt數(shù)據(jù)庫及“PERL”軟件將化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)文件合并腳本后進(jìn)行規(guī)范化標(biāo)注,篩選保留有效靶點(diǎn),共得到247個作用靶點(diǎn)。

2.2 BD疾病靶點(diǎn)篩選 通過GeneCard數(shù)據(jù)庫、PharmGkb數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫分別獲得BD疾病靶點(diǎn)615個、205個、344個、12個、1個,經(jīng)整理、去重后共獲得986個BD疾病靶點(diǎn)。

2.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲取 應(yīng)用R×64 4.0.5軟件將247個藥物作用靶點(diǎn)與986個BD疾病靶點(diǎn)取交集,得到交集靶點(diǎn)63個。

2.4 藥物-疾病成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖及分析結(jié)果 對藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),共有208個結(jié)合位點(diǎn)。匯總其Degree值,數(shù)值越大,代表相應(yīng)的活性成分對BD的治療作用越強(qiáng)。選取Degree值≥40的有效成分進(jìn)行分析,篩選出7個核心成分,即槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、黃芩甙元(baicalein)、富馬堿(fumarine)、漢黃芩素(wogonin)。見圖1。

圖1 藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)預(yù)測 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,生成PPI網(wǎng)絡(luò)。分別用不同節(jié)點(diǎn)和顏色表示不同基因和連接。運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)篩選,重復(fù)篩選3次后得到7個核心靶點(diǎn),分別是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、白細(xì)胞介素18(IL-18)、CC趨化因子配體2(CCL2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、CXC 趨化因子配體 8(CXCL8)。見圖2、3。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊诵陌悬c(diǎn)圖

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 GO功能富集分析共得到1804個條目,其中生物過程(biological process,BP)1675個,涉及對脂多糖、生物刺激的反應(yīng)、對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、對氧化代謝、氧化應(yīng)激的過程等;細(xì)胞組成(cellular component,CC)23個,涉及細(xì)胞器外膜、胞質(zhì)囊腔、質(zhì)膜筏等;分子功能(molecular function,MF)106個,涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合等方面。KEGG通路富集共得到106條通路,涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號通路、IL-17信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、輔助性T淋巴細(xì)胞(Th17)細(xì)胞分化通路、核因子κB(NF-κB)信號通路、Toll樣受體信號通路以及松弛素信號通路等。見圖4、5。

圖4 GO功能富集分析圖(排名前10)

圖5 KEGG通路富集分析圖(排名前30)

2.7 分子對接驗(yàn)證結(jié)果 將篩選得到的7個核心有效成分及7個核心靶基因通過Auto Dock-vina 1.2軟件進(jìn)行分子對接。根據(jù)其結(jié)合能數(shù)值判斷其結(jié)合能力,結(jié)合能數(shù)值越高表示結(jié)合能越差。結(jié)果顯示,各結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能均<-6.8 kcal/mol,證明藥物核心成分(配體)與核心靶基因(受體)之間結(jié)合能力較強(qiáng),分子對接良好,兩者之間有較高的關(guān)聯(lián)性。其中槲皮素與STAT3、槲皮素與CXCL8的對接結(jié)合最強(qiáng)。見圖6。

圖6 分子對接圖(部分)

3 討論

目前BD病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,可能與遺傳、免疫、感染等因素相關(guān)。早期有研究發(fā)現(xiàn),HLA-B51基因與BD密切相關(guān)[4],此后STAT3、IL-18等相關(guān)基因及分子與BD發(fā)病的研究越來越多。臨床常用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑(如秋水仙堿、沙利度胺、環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺等)及生物制劑(如腫瘤壞死因子拮抗劑等)等治療BD,存在副作用較多的問題。張志瑞等[5]研究顯示,中西醫(yī)結(jié)合治療BD臨床癥狀改善率、疾病復(fù)發(fā)率及總有效率等均優(yōu)于西醫(yī)組。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,BD與古代“狐惑”相似,發(fā)病與“蟲”“毒”有關(guān)?！夺t(yī)宗金鑒》認(rèn)為狐惑謂:“孤惑、牙疳、下疳等瘡之古名也,……下疳即狐也,蝕爛肛陰;牙疳即惑也,蝕咽腐齦,脫牙穿腮破唇,因傷寒病后,余毒與濕之為害也?！睂O思邈《備急千金要方》提出本病“濕毒氣所為”?！额愖C活人書》提出“狐惑與濕匿皆蟲證”,認(rèn)為其治療應(yīng)驅(qū)蟲為主。綜合各醫(yī)家觀點(diǎn)并結(jié)合現(xiàn)代臨床分析認(rèn)為,BD為濕熱內(nèi)蘊(yùn),上蒸下注,或循經(jīng)上沿,或下注二陰所致,若疾病日久,或失治誤治,則可出現(xiàn)陰虛內(nèi)熱、脾腎陽虛、痰濕內(nèi)蘊(yùn)之證。甘草瀉心湯治療狐惑病流傳至今,且多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)其治療BD確實(shí)有較好的效果[6]。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析,得到甘草瀉心湯治療BD的核心靶點(diǎn)為PTGS2、IL-18、STAT3、VEGFA等。PTGS2表達(dá)上調(diào)可催化花生四烯酸,生成各種類型的前列腺素,促進(jìn)炎癥反應(yīng)及疼痛的產(chǎn)生。XU Y等[7]提出,抗原提呈細(xì)胞對活化的Th1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),生成過多的干擾素γ(IFN-γ),誘導(dǎo)IL-18的產(chǎn)生,IL-18通過基因多態(tài)性促使BD的發(fā)生。鮑華芳等[8]認(rèn)為STAT3通路激活能夠介導(dǎo)Th1、Th17因子活化,活化的Th1、Th17因子與BD活動性存在較強(qiáng)相關(guān)性。

GO富集分析結(jié)果顯示,甘草瀉心湯治療BD主要涉及對脂多糖、對生物刺激的反應(yīng)、對氧化代謝、氧化應(yīng)激的過程、細(xì)胞凋亡過程調(diào)節(jié)等BP。在革蘭陰性菌外膜中,脂多糖作為其重要的成分之一,可引發(fā)炎癥免疫反應(yīng)[9]。氧化應(yīng)激也是BD發(fā)病的重要機(jī)制。在自身免疫性疾病中,免疫應(yīng)答與內(nèi)源性或外源性抗原相互作用導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生,氧化應(yīng)激可能與炎癥呈正相關(guān)[10]。BD的發(fā)病還與內(nèi)皮損傷和功能紊亂有關(guān),尤其是血管型BD。BD的發(fā)病可能與中性粒細(xì)胞受到刺激后與血管內(nèi)皮的黏附性增強(qiáng),活性氧生成增加,導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷,從而誘發(fā)血管炎,最后出現(xiàn)BD病理改變有關(guān)[11]。鄔銳等[12]證實(shí),BD患者動脈硬化指數(shù)和頸動脈內(nèi)膜中層厚度均高于正常人。此外,BD的發(fā)病與病毒和細(xì)菌感染存在相關(guān)性[13]。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡密不可分,BD發(fā)病可能與腫瘤的發(fā)生存在某種關(guān)聯(lián),且兩者容易合并發(fā)生,以血液系統(tǒng)惡性腫瘤居多,但二者的關(guān)聯(lián)性尚待進(jìn)一步研究。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,甘草瀉心湯治療BD的通路主要包括AGE - RAGE信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、Th17通路等。研究發(fā)現(xiàn),BD患者血清中IL-17、Th17水平升高,可能通過這兩種因子介導(dǎo)的通路調(diào)控疾病的發(fā)生[14]。Th1、Th17與多種風(fēng)濕性疾病活動相關(guān)[15],STAT3為BD的核心基因,Th1、Th17可活化激活STAT3,影響B(tài)D的進(jìn)程,與BD疾病活動性相關(guān)。IL-17信號通路在一定程度上影響動脈粥樣硬化的進(jìn)程[16-17],而血管型BD通常有動脈粥樣硬化的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明,甘草瀉心湯治療BD的核心成分為槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、黃芩甙元、富馬堿、漢黃芩素。黃芩的主要成分有漢黃芩素、黃芩甙元及β-谷甾醇等,可通過AGE-RAGE、IL-17等信號通路調(diào)控VEGFA蛋白等發(fā)揮作用[18]。漢黃芩素具有抗病毒、抗炎、抗血小板聚集等多種藥理作用,其對炎癥引發(fā)的多種疾病具有治療效果[19]。謝苗苗等[20]研究證實(shí)漢黃芩素有抗炎、抗腫瘤等藥理作用。胡青等[21]通過小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芩甙元通過調(diào)控NF-κB /STAT3/細(xì)胞外信號調(diào)控激酶(ERK)信號通路,抑制NF-κB p65、STAT3、ERK等蛋白磷酸化,從而減少炎癥細(xì)胞聚集,減輕炎癥反應(yīng)。槲皮素通過抑制瘦素(LP)調(diào)節(jié)免疫、抗炎[22],還能通過NF-κB和活化蛋白-1(AP-1)信號通路來抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥[23]。LEE J等[24]認(rèn)為槲皮素可通過抑制TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的形成而發(fā)揮抗炎作用。褚小磊等[25]研究顯示槲皮素能抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血中TNF-α、IL-17等因子的表達(dá)而發(fā)揮治療效果。β-谷甾醇和豆甾醇是常見的植物甾醇,均有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等生物活性[26-27]。山奈酚有抗氧化和抗炎的特性[28],有研究表明山奈酚可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,從而減少炎癥因子如IL-1β、TNF-α的分泌從而發(fā)揮抗炎作用[29]。富馬堿可延緩細(xì)胞凋亡,能通過減少炎癥因子的生成達(dá)到抗炎作用[30]。

綜上,甘草瀉心湯中的有效成分可通過不同的通路和靶點(diǎn)治療BD。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法初步預(yù)測出甘草瀉心湯治療BD的核心藥物成分、核心靶點(diǎn)及主要通路和機(jī)制,為甘草瀉心湯治療BD提供了理論依據(jù)。本研究尚未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,存在一定局限性,有待進(jìn)一步完善。