張萍心，柴立民，馮桂宇，李東陽，孫 嵩，劉 蔚，張英凱

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院重點實驗室,北京 100700)

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是一種由多種因素導(dǎo)致的骨髓造血功能衰竭,以骨髓中造血細胞減少和外周血細胞減少為特征,臨床以貧血、出血、發(fā)熱以及感染為主要表現(xiàn),發(fā)病原因涉及物理、化學(xué)、生物、環(huán)境以及免疫等因素[1-4]。AA與自身免疫反應(yīng)相關(guān),骨髓微環(huán)境中效應(yīng)性T細胞激活并浸潤,伴隨著大量炎癥因子的產(chǎn)生,導(dǎo)致造血干/祖細胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)免疫損耗[5],而造血干細胞異常是造成全血細胞減少的重要因素。目前造血干細胞移植和免疫抑制治療(immunosuppressive therapy,IST)是AA的主要治療策略[6],但是IST治療后的AA患者中仍有60%無反應(yīng)或復(fù)發(fā),需要進一步治療[7]。因此,本文從調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)減少、凋亡相關(guān)因子(factor-related apoptosis,Fas)/凋亡相關(guān)因子配體(factor-related apoptosis ligand,FasL)信號通路導(dǎo)致造血干細胞減少、炎癥因子刺激微RNAs(microRNAs,miRNAs)誘導(dǎo)靶基因表達異常與AA 患者的Treg 功能缺失等方面綜述其發(fā)病機制,以期為臨床治療提供思路與方法。

1 AA中Treg凋亡與免疫紊亂

Treg在誘導(dǎo)和維持免疫穩(wěn)態(tài)和自身免疫耐受中起著重要作用,是通常所稱的CD4+CD25+Foxp3+T細胞,具有免疫抑制能力,起到平衡免疫系統(tǒng)和抗炎作用[8]。Treg有2個不同表型:Treg A(幼稚的表型,具有低增殖指數(shù))和Treg B(記憶表型,具有中/高增殖指數(shù),與IST的反應(yīng)相關(guān))[9]。Treg B的主要特征是在炎癥微環(huán)境中高表達Fas,以及對FasL介導(dǎo)的細胞凋亡表現(xiàn)出較高的敏感性[10]。AA 患者外周血中 Treg水平降低,但Treg A比例較健康人高,而Treg B比例較健康人低[11]。白細胞介素(interleukin,IL)-2是Treg的關(guān)鍵生存因子,是一種多效能細胞因子,其通過促進叉頭框蛋白p3(forkhead box protein p3,Foxp3)的表達和調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生來維持Treg的功能[12]。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)孢素A聯(lián)合抗胸腺細胞免疫球蛋白治療AA患者后,CD4+CD25+T細胞水平逐步恢復(fù)正常,這可能是通過抑制T細胞表達IL-2受體,并抑制T淋巴細胞構(gòu)成,從而幫助AA患者恢復(fù)造血功能[13]。Foxp3是一種轉(zhuǎn)錄因子,是Treg的重要標(biāo)志物,同時也參與Treg的分化[14]。Foxp3+Treg是CD4+T細胞的一個亞群,對維持和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及自身免疫耐受至關(guān)重要。Treg B中存在IL-2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)5通路相關(guān)基因和細胞周期調(diào)控相關(guān)基因,高水平的IL-2可以刺激Treg B高表達抗凋亡基因B淋巴細胞瘤(B-cell lymphbma,Bcl)-2,Bcl-2磷酸化后被激活,進而拮抗Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而使Treg在炎癥微環(huán)境中保持數(shù)量穩(wěn)定和正常增殖分化,并發(fā)揮免疫調(diào)控作用。有研究采用重組人粒細胞集落刺激因子聯(lián)合免疫抑制劑對AA并發(fā)感染患者進行治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn),患者血漿中Fas mRNA、Bcl-2 mRNA表達水平下降,說明通過抑制Fas、Bcl-2蛋白表達可以達到治療AA的目的[15]。自身免疫性疾病患者體內(nèi)IL-2水平偏低,因此,采用低劑量IL-2治療可以補充患者血漿中IL-2的不足,減少Treg穩(wěn)態(tài)紊亂和耐受性破壞,從而對抗炎癥反應(yīng),因此,Treg的存活和生長與IL-2關(guān)系密切[16]。另有研究報道,AA患者中Treg B細胞數(shù)量減少,CD4+CD25+Foxp3+Treg表達呈降低趨勢,導(dǎo)致免疫調(diào)控功能異常[17]。由此可見,AA患者骨髓病變微環(huán)境存在免疫紊亂,導(dǎo)致自身免疫耐受穩(wěn)態(tài)被破壞,誘發(fā)異常自身免疫應(yīng)答反應(yīng),造成骨髓細胞免疫損傷,抑制骨髓造血功能。在AA患者中,Treg B數(shù)量減少且功能受損,無法有效抑制效應(yīng)性T細胞的活化,因此,增加AA患者中Treg B數(shù)量將有助于維持免疫平衡,以便更好地進行IST治療?？傊?Treg對AA患者的治療至關(guān)重要。

2 炎癥因子與Treg 功能缺失

炎癥因子是重要的造血調(diào)節(jié)因子,促炎細胞因子可以通過激活免疫細胞的功能來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[18]。CD4+細胞包括輔助性T細胞(Thelper cell,Th)1細胞[分泌干擾素(interferon,IFN)-γ、IL-2等]、Th2細胞(分泌IL-6、IL-10等)、Trey(分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β等)和Th17細胞(分泌IL-17等),這些細胞均在自身免疫中起關(guān)鍵作用[19],其中,Treg功能缺失與外周血和骨髓中Treg數(shù)量減少、遷移能力降低以及免疫抑制缺陷有關(guān)。miRNAs可以通過凋控Treg功能、體內(nèi)免疫平衡和表型穩(wěn)態(tài)來干預(yù)自身炎癥免疫應(yīng)答[20],能夠阻礙mRNA的翻譯和穩(wěn)定性,控制炎癥、細胞凋亡等過程[21]。在免疫反應(yīng)中,miRNAs通過靶向不同的炎癥途徑發(fā)揮重要作用[22]。miRNAs 是長度約為22 個核苷酸的非編碼RNA,基因組DNA通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成初級miRNAs,初級miRNAs在細胞質(zhì)中經(jīng)過剪切和加工形成miRNAs;miRNAs與目標(biāo)基因編碼的mRNA結(jié)合形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合物,導(dǎo)致編碼目標(biāo)蛋白的mRNA翻譯受到抑制和降解[23-24]。多種miRNAs簇對Treg抑制的自身免疫應(yīng)答反應(yīng)功能具有調(diào)控作用,其中miR-146a是最早被發(fā)現(xiàn)有免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)作用的miRNAs,廣泛表達于Treg,并與Treg的免疫抑制功能密切相關(guān)。此外,miR-146a作為抗炎介質(zhì),可以負調(diào)控IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的表達[25],阻止CD4+T細胞分泌IL-6向Th17分化,抑制促炎細胞因子IFN-γ的產(chǎn)生。STAT1是IFN-γ受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,也miR-146a的靶基因,參與IFN-γ受體信號通路,并正向調(diào)節(jié)Th1細胞分化。miR-146a缺失會導(dǎo)致STAT1基因的異常高表達和激活,并促進促炎細胞因子的產(chǎn)生(如IFN-γ和IL-17A),抑制抗炎細胞因子(如IL-4)的產(chǎn)生[26]。此外,STAT1激活會選擇性抑制細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)的活化,而SOCS1是IFN-γ受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游銜接分子STAT1磷酸化的重要負調(diào)節(jié)因子,其活化受到抑制會誘發(fā)Th1介導(dǎo)的炎癥免疫應(yīng)答反應(yīng)[27]。miR-10a在Treg中呈現(xiàn)高表達,其靶基因是轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6。Bcl-6活化后可以刺激炎癥因子IL-17A的表達和分泌,從而促進Th17的增殖和分化。miR-10a 靶向抑制Bcl-6基因的翻譯和表達,減緩因炎癥反應(yīng)而激活誘導(dǎo)性Treg向濾泡性Treg表型的轉(zhuǎn)化,抑制Treg向Th17轉(zhuǎn)分化,進而恢復(fù)Treg的免疫調(diào)控功能,延緩或消除炎癥所導(dǎo)致的組織和器官損傷[28]。Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3與嗜酸性粒細胞(eosinophil,EOS)、核基質(zhì)結(jié)合蛋白SATB1、干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4,IRF4)等協(xié)同調(diào)控Treg 的轉(zhuǎn)錄表型和免疫抑制特性。有研究顯示,miR-17表達于Treg的miRNA上,特異性靶向EOS和其他Foxp3共調(diào)節(jié)因子。IL-6通過激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)誘導(dǎo)miR-17轉(zhuǎn)錄。高表達的miR-17特異性靶向Foxp3協(xié)同調(diào)節(jié)因子EOS、IRF-4和SATB1,干擾Foxp3的翻譯和表達,從而抑制Treg的免疫抑制功能,誘導(dǎo)效應(yīng)T細胞分泌炎癥細胞因子,啟動自身免疫應(yīng)答,造成組織和器官的損傷[29]。

以上研究表明,Treg特異性表達的miRNAs對Treg 的免疫調(diào)控具有干預(yù)作用,在維持免疫平衡和抑制炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。AA患者的發(fā)病與miRNAs表達異常有關(guān),通過調(diào)控炎癥因子和免疫細胞的功能,有助于減少免疫損傷和炎癥反應(yīng),為治療AA提供新的方向。

3 炎癥因子與造血干細胞損傷

AA患者骨髓衰竭是由于HSPCs丟失所致,而HSPCs丟失又是由免疫紊亂和炎癥而引起[30]。HSPCs 的損傷與Fas/FasL信號通路介導(dǎo)的細胞凋亡密切相關(guān)性,Fas/FasL信號通路介導(dǎo)的細胞凋亡在AA中起重要作用[31]。Fas是一種細胞表面受體,通過與天然配體FasL相互作用啟動細胞凋亡。在正常情況下,Fas/FasL系統(tǒng)在維持機體代謝平衡中起著重要作用。Fas廣泛存在于多種組織中, 而其配體FasL的表達僅存在于免疫系統(tǒng)內(nèi)的細胞,如活化的T細胞和自然殺傷細胞。在AA患者中,活化的T細胞過度增殖并通過細胞凋亡機制破壞骨髓干細胞,影響造血過程,導(dǎo)致全血細胞減少[32]。細胞毒性T細胞通過IFN-γ和TNF-α增強Fas受體的表達,從而促進造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSCs)的凋亡[33]。研究表明,Fas受體在造血祖細胞的增殖和分化過程中均有表達,并在所有造血祖細胞的遠端分化過程中起負調(diào)節(jié)作用[34]。CD34+是造血祖細胞的表面標(biāo)志,研究顯示,CD34+細胞的功能間接代表了造血干細胞的功能,而AA的特征之一是CD34+細胞凋亡,因此,所有細胞系的成熟造血祖細胞減少或缺失均會導(dǎo)致骨髓細胞減少和全血細胞減少[35]。AA患者的CD8+T細胞中的FasL表達增高,Fas抗原表達在CD34+細胞表面,并通過Fas/FasL協(xié)同誘導(dǎo)CD34+細胞凋亡[35]。研究發(fā)現(xiàn),AA患者的效應(yīng)T細胞增多,骨髓來源的CD8+T細胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β和FasL的表達均增高,表明AA患者的T細胞與HSPC有相關(guān)性[36]。此外,骨髓微環(huán)境中不同炎癥因子在調(diào)節(jié)造血過程中起重要作用,其中IFN-γ和TNF-α在破壞AA患者的骨髓干細胞中起主要作用。研究表明,IFN-γ對造血干細胞具有雙重作用[37]。短期接觸IFN-α和IFN-γ的情況下,HSCs退出靜止?fàn)顟B(tài),開始進入細胞周期進行分裂分化,生成骨髓,這一過程增強了對急性感染的應(yīng)答;而長期暴露于IFN則會導(dǎo)致DNA損傷增加,激活凋亡途徑,損傷造血干細胞功能和自我更新能力。因此,IFN在HSCs中的作用較為復(fù)雜[38]。IFN-γ能促進Fas介導(dǎo)的造血細胞凋亡,在免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭中,活化的攜帶FasL的細胞毒性T細胞在局部骨髓環(huán)境中擴增,驅(qū)動Fas上調(diào)骨髓中的HSCs成分,形成異常免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分,增強HSCs中Fas表達和Fas介導(dǎo)的細胞凋亡,導(dǎo)致HSCs損傷[39]。TNF與抑制HSCs的生長和誘導(dǎo)HSCs的凋亡有關(guān),并可間接改變對HSCs穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的骨髓微環(huán)境[40]。有研究顯示,TNF-α的功能與IFN-γ相似,TNF-α在AA患者骨髓內(nèi)的表達較健康人高,TNF-α通過刺激效應(yīng)T細胞表達IFN-γ來影響T細胞分化或活化,進而導(dǎo)致骨髓被破壞[41]。有研究顯示,在急性與慢性刺激下,IL-6可能對造血產(chǎn)生相反的影響[42]。因此,骨髓微環(huán)境下,不同水平的炎癥因子以及Fas/FasL系統(tǒng)在AA發(fā)病機制中的作用與HSCs凋亡密切相關(guān),可導(dǎo)致AA并引發(fā)骨髓破壞。

4 結(jié)論

AA是一種難治性血液病,其病理生理機制尚不清楚,被廣泛接受的機制是免疫系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致的遺傳易感宿主的HSPCs被自身反應(yīng)性T細胞破壞。炎癥細胞因子激活Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)炎癥微環(huán)境中對FasL敏感的Treg B細胞凋亡,最終導(dǎo)致Treg數(shù)量減少。Treg特異性表達的miRNAs靶向抑制特定靶基因的翻譯和表達,干預(yù)Treg的免疫抑制功能。miRNAs在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥中起著重要作用,影響機體免疫耐受穩(wěn)態(tài)。因此,Treg細胞數(shù)量減少和功能缺失是AA患者對標(biāo)準(zhǔn)IST治療不反應(yīng)的關(guān)鍵病理機制。調(diào)控炎癥因子和miRNAs的表達可減少炎癥反應(yīng)和免疫損傷,為AA患者的治療提供新的方向。然而,目前AA患者的治療仍存在一些問題,如治療效果不穩(wěn)定、治療成本高等。為了提高AA患者臨床治療的有效性,進一步研究AA發(fā)病的效應(yīng)靶點和作用機制具有重要意義。