趙海清 覃玉梅

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院(廣西壯族自治區(qū)第二人民醫(yī)院)藥學(xué)部 (廣西 桂林, 541000)

肝細(xì)胞癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,我國是肝細(xì)胞癌的高發(fā)國,肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第4位和第2位[1,2]。雖然近些年肝細(xì)胞癌的放療、介入治療、靶向治療等治療手段取得了長足進(jìn)步,患者的生命周期得到一定延長,但腫瘤最終會發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,進(jìn)而導(dǎo)致死亡率居高不下。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路激活介導(dǎo)的癌細(xì)胞增殖在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用,PI3K/AKT通路是研究肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌新治療手段的重要靶點(diǎn)[3]。近年來,植物來源的化合物因其潛在的抗腫瘤特性而備受研究者關(guān)注。紫花牡荊素是從馬鞭草科植物的干燥成熟果實(shí)蔓荊子中提取得到的黃酮類化合物,在非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤中均通過抑制PI3K/AKT通路激活的方式發(fā)揮抑癌作用[4,5]。為初步揭示紫花牡荊素在肝細(xì)胞癌中的抑癌作用及機(jī)制,本研究以肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B為對象,分析紫花牡荊素調(diào)控PI3K/AKT通路對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B購自上海通派生物科技公司。

1.2 試劑及儀器 紫花牡荊素購自上海純優(yōu)生物科技公司,SC-79購自上海瀚香生物科技公司,結(jié)晶紫購自美國Sigma公司,CCK8細(xì)胞增殖活力檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技公司,B淋巴細(xì)胞瘤-基因(Bcl-2)、細(xì)胞色素C(CytC)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、裂解型caspase-3(Cleaved caspase-3)、p-PI3K、p-AKT、β-actin特異性一抗購自美國Abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司,倒置顯微鏡購自深圳市西尼科光學(xué)儀器公司,流式細(xì)胞儀購自北京賽泰克生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HepG2、Hep3B細(xì)胞常規(guī)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)、胰蛋白酶消化及傳代。將消化后的細(xì)胞調(diào)節(jié)密度至2.5×106個/ml,按照2 ml/孔接種在6孔培養(yǎng)板中分組處理。對照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理,不同濃度紫花牡荊素組用含有不同濃度(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)紫花牡荊素的培養(yǎng)基處理,溶劑對照組用含有體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO的培養(yǎng)基處理,溶劑+40 μmol/L紫花牡荊素組用含有體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO及40 μmol/L紫花牡荊素的培養(yǎng)基處理,SC-79+40 μmol/L紫花牡荊素組用含有5 μmol/L SC-79(含有體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO)及40 μmol/L紫花牡荊素的培養(yǎng)基處理。每組均連續(xù)處理48 h。

1.3.2 CCK8法檢測細(xì)胞活力 HepG2、Hep3B細(xì)胞按照5×103個/孔接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi),分組處理48 h后采用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞活力,在酶標(biāo)儀中檢測490 nm處的光密度(OD)值。

1.3.3 細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn) 消化收集分組處理48 h的HepG2、Hep3B細(xì)胞,按照1×104個/孔接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)2周,肉眼觀察到克隆形成后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,用0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min,在顯微鏡下觀察克隆數(shù)。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡 消化收集分組處理48 h的HepG2、Hep3B細(xì)胞,取1×105個細(xì)胞,加入500 μl緩沖液沖重懸,采用Annexin V-FITC/PI試劑盒進(jìn)行Annexin V-FITC染色和PI染色15 min,而后在流式細(xì)胞儀上檢測Annexin V-FITC陽性、PI陰性的細(xì)胞早期凋亡比例作為細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 western blot檢測蛋白表達(dá) 采用裂解液提取分組處理48 h的HepG2、Hep3B細(xì)胞中的蛋白,按照20 μg蛋白/孔將樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,而后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,將膜放入5%脫脂牛奶、室溫封閉1 h,洗膜后將膜在Bcl-2一抗(1∶500稀釋)、CytC一抗(1∶1 000稀釋)、Bax一抗(1∶600稀釋)、Cleaved caspase-3一抗(1∶400稀釋)、β-actin一抗(1∶5 000稀釋)中4℃孵育過夜。次日洗膜后將膜放入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶二抗,室溫孵育1 h。最后,洗膜并在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光,得到蛋白條帶,根據(jù)條帶的光密度值、以β-actin為內(nèi)參,計算Bcl-2、CytC、Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,有統(tǒng)計學(xué)差異的計量資料通過LSD-t法兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度紫花牡荊素對HepG2、Hep3B細(xì)胞活力的影響見表1。

表1 不同濃度紫花牡荊素對HepG2、Hep3B細(xì)胞活力的影響

2.2 40 μmol/L紫花牡荊素對HepG2、Hep3B細(xì)胞克隆形成率及凋亡率的影響 見表2。

表2 對照組與40 μmol/L紫花牡荊素組細(xì)胞克隆數(shù)、凋亡率的比較

2.3 40 μmol/L紫花牡荊素對HepG2、Hep3B細(xì)胞中PI3K/AKT通路的影響 見圖3、表3。

圖1 對照組與40 μmol/L紫花牡荊素組細(xì)胞克隆的結(jié)晶紫染色

圖2 對照組與40 μmol/L紫花牡荊素組細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測圖

圖3 對照組與40 μmol/L紫花牡荊素組細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的表達(dá)

表3 對照組與40 μmol/L紫花牡荊素組p-PI3K、p-AKT表達(dá)的比較

2.4 40 μmol/L紫花牡荊素對HepG2、Hep3B細(xì)胞中線粒體增殖相關(guān)蛋白的影響 見圖4、表4。

圖4 對照組與40 μmol/L紫花牡荊素組細(xì)胞中線粒體增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

表4 對照組與40 μmol/L紫花牡荊素組線粒體增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

2.5 AKT激動劑SC-79對40 μmol/L紫花牡荊素抑制HepG2、Hep3B細(xì)胞中PI3K/AKT通路的影響 見圖5、表5。

圖5 3組細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的表達(dá)

表5 3組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT表達(dá)的比較

2.6 AKT激動劑SC-79對40 μmol/L紫花牡荊素抑制HepG2、Hep3B細(xì)胞增殖的影響 見圖6、7及表6。

圖6 3組細(xì)胞克隆的結(jié)晶紫染色

圖7 3組凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測

表6 3組細(xì)胞克隆數(shù)及凋亡率的比較

2.7 AKT激動劑SC-79對40 μmol/L紫花牡荊素調(diào)控HepG2、Hep3B細(xì)胞中線粒體增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見圖8、表7。

圖8 3組細(xì)胞中線粒體增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

表7 3組線粒體增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

3 討論

肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中癌細(xì)胞增殖失控并伴有細(xì)胞凋亡紊亂是重要的生物學(xué)特征,針對癌細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行干預(yù)以抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是治療癌癥、預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的有效途徑。近些年,多種純天然的植物來源化合物在惡性腫瘤治療中的價值受到廣泛關(guān)注,紫花牡荊素是一種黃酮類化合物,來源于蔓荊子,在心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)中發(fā)揮抗炎、抗菌、止痛作用[6,7]。惡性腫瘤相關(guān)的研究證實(shí)紫花牡荊素具有抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的抗癌生物學(xué)活性[8-10]。

本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對紫花牡荊素抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用展開探索,以HepG2和Hep3B兩種肝癌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對象,用不同濃度紫花牡荊素處理后均觀察到紫花牡荊素以濃度依賴性的方式降低兩種肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力,表明紫花牡荊素對肝癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用,其中40 μmol/L紫花牡荊素抑制增殖的作用最明顯,與該藥物在其他惡性腫瘤細(xì)胞中抑制癌細(xì)胞增殖的作用相似[8-10]。癌細(xì)胞的增殖失控多伴有凋亡紊亂,本研究的結(jié)果顯示:40 μmol/L紫花牡荊素抑制兩種肝癌細(xì)胞的克隆形成,增加兩種肝癌細(xì)胞的凋亡率,這一結(jié)果與紫花牡荊素降低肝癌細(xì)胞活力的作用一致,表明紫花牡荊素具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。

線粒體是細(xì)胞中與增殖及凋亡調(diào)控密切相關(guān)的細(xì)胞器,Bax和Bcl-2是一對調(diào)控線粒體膜CytC通透性的分子,前者增加通透性,后者降低通透性,從線粒體進(jìn)入細(xì)胞漿的CytC能夠啟動級聯(lián)反應(yīng)、促進(jìn)pro caspase-3裂解為cleaved caspase-3并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11,12]。已有研究報道,紫花牡荊素調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞中線粒體增殖相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、CytC、Cleaved caspase-3的表達(dá)[4,8]。本研究的結(jié)果顯示40 μmol/L紫花牡荊素使兩種肝癌細(xì)胞中Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)增加,Bcl-2、CytC的表達(dá)降低,提示紫花牡荊素對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用與其調(diào)控線粒體增殖蛋白表達(dá)相關(guān)。

惡性腫瘤的增殖、凋亡等生物學(xué)環(huán)節(jié)受到多樣的生物信號網(wǎng)絡(luò)及信號通路調(diào)控,其中PI3K/AKT是經(jīng)典的促增殖、抗凋亡通路。肝細(xì)胞癌中PI3K/AKT通路顯著激活[13,14],多種抗腫瘤藥物通過抑制PI3K/AKT通路的途徑抑制肝癌細(xì)胞的增殖[15,16]。本研究中,40 μmol/L 紫花牡荊素處理兩種肝癌細(xì)胞后細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平顯著降低,提示紫花牡荊素可能通過抑制PI3K/AKT通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步設(shè)計逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),40 μmol/L 紫花牡荊素處理的同時聯(lián)用AKT激動劑SC-79,SC-79使p-AKT表達(dá)增加并削弱紫花牡荊素抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,表明紫花牡荊素對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用部分由抑制PI3K/AKT通路介導(dǎo)。

綜上所述,本研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫花牡荊素通過抑制PI3K/AKT通路抑制肝癌細(xì)胞增殖。本研究的不足之處是僅僅設(shè)計了離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn),未能通過動物實(shí)驗(yàn)分析紫花牡荊素對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。盡管如此,本研究的以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還是為今后發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌新的治療藥物提供了依據(jù)及思路。