張 婷 裴曉華 蔡 虹 吳劍華 徐振興 王 敏,△

1.福建中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 (福建 福州, 350100) 2.北京中醫(yī)藥大學廈門醫(yī)院

全球約有2.96億乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者,死于HBV相關肝硬化、肝衰竭或肝癌等疾病的患者達82萬人[1]。我國HBV相關肝硬化和肝細胞癌患者約占其總數(shù)的77%[2]和84%[2,3]。慢性乙型肝炎(CHB)是目前重要的傳染性疾病,控制和切斷HBV感染相關不良結局仍是研究的熱點和難點。

HBV感染的恢復依賴于多細胞介導的免疫應答[4,5],尤其是CHB患者輔助性T淋巴細胞(Th)和細胞因子的異常與CHB抗病毒療效密切相關[5,7]。本課題組前期臨床研究結果證實了復方梔子根顆粒治療CHB的臨床療效[8,9],本次研究在此基礎上,采用復方梔子根顆粒聯(lián)合TDF治療肝膽濕熱型CHB患者,致力于研究對CHB患者血清細胞因子的影響,探索中藥復方作用靶點。

1 資料及方法

1.1 一般資料 納入2020年1月至2022年6月就診于廈門市中醫(yī)院住院及門診的初治CHB患者80例,按照1∶1的比例隨機分組,去除脫落、剔除病例共5例,最終有75例(治療組35例,對照組40例)完成臨床觀察并納入分析。本研究已獲得廈門市中醫(yī)院倫理委員會批準(批準號: 2019-K014-01)。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準[10]兼?zhèn)洧佗冖刍颌佗冖茼椪呖稍\斷為CHB:①血清HBsAg持續(xù)陽性>6個月;②血清HBV DNA陽性;③近3個月血清ALT反復升高(大于正常值上限);④若肝功能正常,則肝穿刺活檢證實為慢性肝炎且纖維化程度分期S≥2或G≥2。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準[11](1)具備所有主癥(2+0);(2)具備主癥①及3項次癥中的任意2項(①+2);(3)兼具主癥②及次癥①、②(②+①②)。滿足(1)(2)(3)中1項即可診斷為肝膽濕熱證。主癥:①脅肋脹痛;②舌苔黃膩;次癥:①納呆嘔惡,厭油膩;②尿黃;③身目發(fā)黃。

1.3 納入及排除標準 納入標準:①符合診斷標準者;②未抗HBV治療、未服用其他保肝藥,具有抗病毒治療指征;③排除合并其他可能導致肝功能異常原因;④患者知情并簽署知情同意書。排除標準:①合并其他肝炎病毒、HIV、梅毒、肝硬化、肝癌及其他慢性肝病者;②合并呼吸、循環(huán)及其他系統(tǒng)嚴重原發(fā)病者;④近12周有參加其他實驗者;⑤妊娠及哺乳期婦女;⑥不同意進入該臨床研究者;⑦依從性差者。

1.4 治療方案 對照組患者予口服富馬酸替諾福韋二吡呋酯(300 mg/片,成都倍特藥業(yè),國藥準字H20163436),1次/日,1片/次,觀察24周后繼續(xù)服用。治療組在此基礎上加用復方梔子根顆粒(中藥免煎劑),組成:茵陳、梔子根各30 g, 黃芪、佛手、鱉甲、丹參、太子參、龜板、敗醬草、郁金、延胡索各12 g,茜草、丹皮、柴胡各6 g,三七3 g;規(guī)格:每包15 g。沖服,每日2次,每次1包,治療24周。

1.5 觀察指標

1.5.1 中醫(yī)癥狀評分標準[12]治療前后觀察到的患者癥狀、體征分為正常及輕、中、重度異常4個級別,計分方式按其嚴重程度,計主癥:0、3、6、9分,次癥:0、2、4、6分,計各項評分之和為最終中醫(yī)癥狀積分。見表1。

表1 主、次癥分級量化表

1.5.2 實驗室指標 分別于治療前及治療4周、24周采集2組患者清晨空腹靜脈血,采用速率法運用美國貝克曼AU5800全自動生化分析儀檢測血清ALT(正常值7～40 U/L)、AST(正常值13～35 U/L)、GGT(正常值7～45 U/L)水平。HBV DNA定量采用熒光PCR法經ANADAS9850全自動核酸提純及熒光PCR分析系統(tǒng)(試劑盒購自廈門安普利公司,定量下限為20 IU/ml);血清HBsAg、HBeAg定量采用磁微?；瘜W發(fā)光法經AutoLumo全自動化學發(fā)光測定儀檢測(試劑盒購自鄭州安圖公司,定量下限為0.05 IU/ml、0.1 IU/ml);血清IL-23、IL-17、IL-10、IL-6水平采用96孔ELISA試劑盒(購自南京森貝伽公司)檢測。

1.5.3 安全性觀察 常規(guī)檢查:治療前后血、尿、大便常規(guī),尿NAG,腎功能,采用全自動生化儀。物理檢查:治療前后心電圖。

1.6 臨床證候療效評定標準[12]臨床痊愈:患者主要癥狀及體征消失或基本消失,療效指數(shù)≥95%;顯效:主要癥狀及體征明顯改善,療效指數(shù)為70%～94%;有效:主要癥狀、體征改善,療效指數(shù)為30%～69%;無效:主要癥狀及體征無明顯改善甚或加重,療效指數(shù)<30%。備注:療效指數(shù)(%)=[(治療前證候積分-治療后證候積分)/治療前證候積分]×100%(尼莫地平法)?？傆行?(總有效例數(shù)/總例數(shù))×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料不符合正態(tài)分布者,采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,計數(shù)資料以例(%)表示。計量資料組間比較均采用Wilcoxon Mann-WhitneyU檢驗,治療前后比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗;無序分類變量的2×C表采用Pearson χ2或Fisher′s確切概率法進行檢驗。P<0.05,表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病例流程 本研究共納入肝膽濕熱型初治CHB患者80例進入臨床觀察,按照隨機數(shù)字表以1∶1隨機分為2組,觀察期間受疫情影響產生2例失訪脫落病例,因患者個人原因脫落1例,因未按療程用藥剔除2例,最終共75例納入分析(治療組35例,對照組40例)。見圖 1。

圖1 病例流程

2.2 兩組患者治療前后肝功能變化 見表2。

表2 肝功能(ALT、AST、GGT)變化比較 M(IQR)

2.3 兩組患者治療前后病毒學指標變化 見表3。

表3 血清病毒學指標(HBV DNA、HBsAg、HBeAg)變化比較 M(IQR)

2.4 兩組患者治療前后血清細胞因子變化 見表4。

表4 血清細胞因子(IL-6、IL-10、IL-17、IL-23)變化比較 M(IQR)

2.5 兩組患者臨床證候療效評定 見表5。

表5 臨床證候療效比較 [例(%)]

2.6 兩組患者不良反應比較 見表6。

表6 不良反應比較 [例(%)]

2.7 兩組患者基線資料比較 治療前兩組年齡、性別、肝臟炎癥及纖維化程度、肝功能、血清病毒學指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。見表7。

表7 基線資料比較 M(IQR)/例(%)

3 討論

中藥復方聯(lián)合TDF治療CHB在改善患者臨床癥狀、減輕肝臟炎癥和纖維化具有較好的臨床優(yōu)勢[13,14]。 復方梔子根顆粒是康良石教授在長期臨床實踐中總結出的有效方劑基礎上研制的院內制劑,已用于治療CHB 20余年,其以清熱利濕、軟堅散結立法,方中梔子根、鱉甲為君藥,以清熱利濕、軟堅散結,配伍茵陳為臣,對于肝膽濕熱型CHB患者更具治療優(yōu)勢。我們課題組前期研究結果顯示:復方梔子跟顆粒可顯著的阻斷和防治CHB所致肝纖維化[8,9,15]。本次研究結果表明復方梔子根顆粒聯(lián)合TDF治療CHB患者24周轉氨酶水平、HBsAg定量、HBV DNA較治療前均下降,與單藥治療前后無統(tǒng)計學差異,提示中藥復方聯(lián)合組和西醫(yī)單藥組降低轉氨酶、HBsAg定量、HBV DNA定量作用相似,與前期復方梔子根顆粒聯(lián)合TDF治療CHB患者48周,聯(lián)合組對HBsAg陰轉率優(yōu)于西醫(yī)單藥組的研究結果不一致[9]。究其原因為本次研究受疫情影響,整體服用中藥療程(24周)較之前(48周)短,影響療效。但本次研究發(fā)現(xiàn),中藥復方聯(lián)合組患者治療4周時,降低轉氨酶的效果優(yōu)于同期單用西藥組,提示聯(lián)合治療可更快改善肝功能,并且臨床總有效率高于對照組,不良反應少,在臨床上確有減毒增效之效。

慢性HBV感染中,HBV清除或持續(xù)性感染與機體免疫反應密切相關,且各類細胞因子的相互共同作用與T細胞的細胞效應密切相關。促炎因子IL-17主要來源于Th17細胞,IL-23是促進Th17增殖、分化及維持其功能的重要因子,Mandy J McGeachy等在敲除小鼠IL-23受體后觀察到CD4+T細胞明顯下降,并在體外實驗中觀察到CD4+T細胞源性IL-17同樣顯著降低,但加入IL-23后IL-17的分泌顯著增加[16,17]。一項納入67名初治CHB患者的研究,通過采集這些患者的肝組織樣本構建體外實驗,表明抑制IL-10能夠顯著升高CD4+T細胞頻率,降低Breg細胞對CD4+T細胞的抑制,從而調節(jié)HBV特異性T細胞的抗病毒能力[18]。IL-6一直被認為是促進Tfh細胞生成的主要細胞因子。敲除IL-6受體后,慢性病毒感染小鼠中的病毒特異性和多克隆激活性CD4+T細胞顯著減少,Th1和Tfh樣應答功能受損,且病毒特異性CD8+T細胞耗竭加劇[19,20]。

部分細胞因子水平也與肝病不良結局相關。相較健康人群,CHB患者血清中IL-6水平更高,而顯著升高的IL-6可促進HCC的進展[21-24]。血清中異常分泌的IL-17可促進炎癥反應,從而加重肝硬化及肝纖維化,異常升高的IL-10與HBV DNA載量及肝臟炎癥密切相關,可能是導致HBV促進肝纖維化的重要原因之一[21]。在CHB相關肝腫瘤進程中,IL-23促進巨噬細胞分泌VEGF,通過多通路參與HCC的增殖和轉移,且對HBeAg清除和HBsAg下降具有預測價值[25]。

兩組治療后血清IL-6、IL-10、IL-17、IL-23水平均較治療前下降,治療后治療組IL-6、IL-23水平較對照組下降更顯著,提示中藥復方聯(lián)合治療可進一步降低炎癥細胞因子水平,從而調節(jié)機體免疫,改善遠期預后。目前的藥理研究證實復方梔子根顆粒中的某些中藥成分如黃芪、丹參等可以促進機體IL-6、IL-23水平的下調[26-29]。其中IL-6作為一種多效性因子,在肝細胞的生物反應中發(fā)揮促炎作用,IL-23是Th17在HBV慢性感染過程中發(fā)揮免疫功能的重要效應分子[30],最近發(fā)現(xiàn)Th17細胞與宿主防御和自身免疫相關[31]。因此推斷復方梔子根顆粒是否通過其它途徑調節(jié)宿主免疫,進而影響T細胞分泌細胞因子水平,同時細胞因子的水平變化又影響T細胞功能,符合中藥復方的多途徑、多靶點作用特點。

本次研究初步證實了復方梔子跟顆粒聯(lián)合TDF,較單用西藥治療能更快改善患者肝功能水平、減輕臨床癥狀、影響細胞因子水平,因此可能降低了HBV相關肝硬化、肝癌不良結局風險。同時從患者血清細胞因子角度,探討了復方梔子根顆粒作用機制,為下一步研究該藥實現(xiàn)CHB免疫控制奠定基礎。但同時也存在幾個局限:①樣本量相對較小,所檢細胞因子種類有限;②受疫情影響,中藥復方療程較短,限制了其臨床療效;③抗乙肝病毒藥物治療CHB期間細胞因子水平變化是否與血清HBV DNA轉陰、HBsAg定量降低存在關系,仍需臨床進一步研究。