葉 磊 鄭梓瑩 陳 文 陳毅菁

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科,福建省泉州市 362000

胃癌是我國常見的癌癥之一,中醫(yī)藥已被廣泛用于胃癌的治療,由于其獨特的優(yōu)勢,中醫(yī)藥不僅可以顯著改善患者的癥狀,并可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤的病理惡化,從而防止腫瘤進一步發(fā)展[1]。華蟾素作為一種從中華巨型蟾蜍的表皮分泌物中提取的天然類固醇內(nèi)酯,被認為具備清熱解毒以及消腫止痛的功效,對改善惡性腫瘤的預(yù)后具有重要價值[2]。許多體內(nèi)外的研究表明,華蟾素具有抗腫瘤活性和增強化療效果的特性[3]。一項薈萃分析指出,華蟾素聯(lián)合化療方案治療胃癌比單獨化療更為有效,可明顯減輕化療相關(guān)的不良反應(yīng),并改善胃癌患者的生活質(zhì)量[2]。盡管華蟾素在臨床上已被廣泛應(yīng)用,但其抗腫瘤的分子機制目前仍未完全明確。因此,本實驗選用人胃癌MKN-28細胞系,從基礎(chǔ)實驗層面,探究華蟾素對胃癌細胞增殖和周期的影響,并進一步探索華蟾素對胃癌MKN-28細胞系凋亡相關(guān)蛋白表達量的影響,從而明確其抗癌機制,為華蟾素治療胃癌的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑 人胃癌MKN-28細胞購自上海(江西)中洪博元生物技術(shù)有限公司。華蟾素(1108-68-5,德思特生物)由中洪博元提供。本實驗所需試劑包括RPMI-1640完全培養(yǎng)基(KGM31800S,KeyGen Biotec);RPMI-1640不完全培養(yǎng)基(KGM31800N,KeyGen Biotec);OPTI-MEM培養(yǎng)基(31985-062,Gibco);胰蛋白酶-EDTA消化液(T1300,Solarbio); CCK8-法細胞增殖檢測試劑盒(KGA317-2,KeyGen Biotec);Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit(AP101-100-kit,MΜLTI SCIENCES);Cell Cycle Staining Kit(CCS102,MΜLTI SCIENCES);PVDF膜(IPVH00010, Millipore);超敏發(fā)光液(RJ239676,賽默飛);Mouse Anti-β-Actin(HC201,TransGen Biotech);HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(GB23301,Servicebio);Rabbit Anti Bcl-2 (ab194583,Abcam);Rabbit Anti BAX (ab32503,Abcam);Rabbit Anti Caspase-3 (ab59425,Abcam);HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(GB23303,Servicebio)。

1.2 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱(BPN-80CW,上海一恒科學(xué)儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(MF53,廣州市明美光電有限公司);潔凈工作臺(BBS-SDC, BIOBASE);多功能酶標分析儀(SuPerMax3100,上海閃譜生物科技有限公司);顯微鏡(BX43,Olympus);NovoCyteTM流式細胞儀[NovoCyte 2060R,艾森生物(杭州)有限公司];全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon-5200,上海天能科技有限公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)及藥物處理 人胃癌MKN-28細胞經(jīng)復(fù)蘇、解凍后,采用含10%胎牛血清和1%青霉素—鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)條件：含5%濃度的CO2、37℃、飽和濕度的孵箱。細胞培養(yǎng)液隔天換液1次,待細胞密度至80%～90%時需對細胞進行傳代,每2～3d傳代1次。取對數(shù)生長期的MKN-28細胞用于后續(xù)實驗。在Cell Counting Kit-8實驗(CCK8法)前,棄去細胞培養(yǎng)上清,用1×PBS洗兩遍,加入0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化,待細胞變圓加入培養(yǎng)基終止消化并收集細胞懸液至10mL離心管中,1 000r/min離心3min,棄去上清液加入培養(yǎng)基重懸細胞進行傳代。

1.4 細胞增殖活力檢測 通過CCK8法檢測細胞增殖活力。細胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好,行細胞計數(shù)后,將細胞懸液分配至96孔板中,做好標記,將細胞置于培養(yǎng)箱中24h;待細胞貼壁后,更換新鮮培養(yǎng)基,每孔100μL,不同孔分別加入0μg/mL、0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.04μg/mL、0.08μg/mL、0.16μg/mL、0.24μg/mL、0.32μg/mL、0.48μg/mL及0.64μg/mL濃度的華蟾素,繼續(xù)培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基,向各孔中加入10μL CCK8試劑,于培養(yǎng)箱中孵育2h,在450nm波長下用酶標儀測定各孔吸光度值,計算IC50。待CCK8法計算半抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)后,根據(jù)IC50值將MKN-28細胞進一步分為對照組(Control)和實驗組(華蟾素處理,Cinobufagin),對照組只加入DMSO,而實驗組加IC50濃度華蟾素處理24h,后續(xù)進行對應(yīng)檢測。

1.5 流式細胞凋亡檢測 收集1×106個細胞,1 500r/min 離心3min后,采用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌兩遍;取300μL 預(yù)冷的1×Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞,向各孔中加入5μL Annexin V-FITC 和 10μL PI;輕微混勻后,在室溫條件下,避光孵育10min,用流式細胞儀進行檢測細胞凋亡狀態(tài)。

1.6 流式細胞周期檢測 收集1×106個細胞,1 500r/min 離心3min后,采用PBS洗滌兩遍,按照細胞周期檢測試劑盒說明書,向各孔加入細胞周期檢測試劑,在室溫條件下,避光孵育30min,用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 Western Blot檢測 實驗組和對照組MKN-28培養(yǎng)細胞棄去培養(yǎng)基,加入RIPA裂解液裂解細胞,提取總蛋白。12 000r/min高速離心機4℃離心10min,取上清液,BCA蛋白定量試劑盒對總蛋白進行定量。對蛋白樣品進行變性后,進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)1h,后用300mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5h。PVDF膜用脫脂奶粉封閉后,一抗4℃孵育過夜,次日PVDF膜室溫孵育二抗2h,用發(fā)光液浸濕PVDF膜,置于全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中進行顯影。所使用的抗體及對應(yīng)稀釋倍數(shù)見表1。

表1 Western Blot檢測抗體信息表

2 結(jié)果

2.1 CCK8檢測華蟾素對胃癌細胞增殖的影響及IC50測定 隨華蟾素處理濃度的增加,細胞增殖能力逐漸下降,與濃度呈負相關(guān),其中,與0μg/mL組相比,濃度≥0.02μg/mL的華蟾素即可以達到顯著抑制胃癌細胞增殖的能力(P<0.05)。采用Graphpad prism 8.0計算MKN-28細胞最佳藥物處理濃度為0.16μg/mL。見表2。

表2 不同華蟾素作用濃度對胃癌MKN-28細胞的增殖影響

2.2 流式細胞凋亡檢測 對照組胃癌細胞凋亡比例為(7.87±0.50)%,而實驗組凋亡比例為(16.62±1.21)%,兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.62,P=0.002)。

2.3 流式細胞周期檢測 經(jīng)華蟾素處理后,實驗組G0/G1期細胞所占比例顯著增加,而G2/M期細胞所占比例顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組S期細胞所占比例減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.078),說明華蟾素可以將MKN-28增殖阻滯在G1期。見表3。

表3 華蟾素對胃癌MKN-28細胞細胞周期的影響

2.4 細胞凋亡相關(guān)蛋白Western Blot檢測結(jié)果 經(jīng)過華蟾素處理后,MKN-28細胞中,Bcl-2蛋白表達量顯著上升(P=0.002),而Bax、Caspase-3表達量則顯著下降(P<0.05)。見表4。

表4 華蟾素對胃癌MKN-28細胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達量的影響

3 討論

胃癌是全球第五大常見癌癥,也是全球癌癥死亡的第四大原因[4]。胃癌對我國人民的生命造成了巨大的威脅,根據(jù)2019年全球疾病負擔(dān)研究,中國的胃癌發(fā)病率占全球胃癌總數(shù)的44.21%,同時胃癌是中國第二大常被診斷的癌癥,也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[5]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進展和抗腫瘤藥物的出現(xiàn),胃癌的預(yù)后較前有了明顯改善,但鑒于化療的耐藥性與毒副作用,臨床醫(yī)生一直在探索傳統(tǒng)中藥治療胃癌的效果,以提高患者的生存時間或生活質(zhì)量,減少化療引起的副作用[6-7]。華蟾素幾十年來一直作為經(jīng)典的輔助療法在臨床上應(yīng)用[8]。有多項臨床研究報告表明,華蟾素可能對胃癌具有一定的治療效果[2],但有關(guān)華蟾素發(fā)揮抗胃癌的具體機制尚未明確[9]。

一些研究表明,華蟾素可以抑制人胃癌BGC-823細胞的侵襲、遷移能力[10],也可以抑制人胃癌SGC7901細胞的增殖,并通過下調(diào)Rho GTPase(RhoA、Cdc42、Rac1)信號通路的表達發(fā)揮抗腫瘤作用[11]。然而,華蟾素對人胃癌 MKN-28細胞系是否有同樣的抑制作用尚未得到報道。在本研究中,筆者以胃癌 MKN-28細胞作為研究對象,采用不同濃度的華蟾素進行干預(yù)治療,采用CCK8法檢測華蟾素對胃癌 MKN-28細胞增殖活力的影響。結(jié)果顯示,隨華蟾素藥物濃度的增加,MKN-28細胞增殖活力逐漸下降,其增殖活力與濃度呈負相關(guān),提示華蟾素對胃癌MKN-28細胞株亦有顯著抗癌作用?；贑CK8檢測結(jié)果,我們測算出華蟾素對MKN-28細胞的IC50值為0.16μg/mL,即采用0.16μg/mL濃度的華蟾素對MKN-28細胞具有50%的抑制效應(yīng),該值通常作為細胞實驗的理想藥物濃度。

進一步研究顯示,采用0.16μg/mL濃度的華蟾素干預(yù)胃癌MKN-28細胞株后,實驗組凋亡比例為(16.62±1.21)%,而對照組為(7.87±0.50)%,說明華蟾素具有促進胃癌MKN-28細胞凋亡的作用。此外,經(jīng)華蟾素處理后,實驗組G0/G1期細胞所占比例顯著增加,而G2/M期細胞所占比例顯著降低,說明華蟾素可以將MKN-28增殖阻滯在G1期,而既往已有大量研究表明,G2/M期細胞比例與腫瘤活性顯著相關(guān),G2/M期比例越高,說明腫瘤增殖活性越高,惡性程度越高[12]。本研究結(jié)果表明,華蟾素可以通過降低胃癌MKN-28細胞G2/M期細胞比例而降低腫瘤增殖活性,降低其惡性程度。筆者進一步通過Western Blot技術(shù)檢測了華蟾素處理后細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過華蟾素處理后,MKN-28細胞中,Bcl-2蛋白表達量顯著上升,而Bax、Caspase-3表達量則顯著下降,表明華蟾素促進了胃癌細胞的凋亡。

華蟾素發(fā)揮抗腫瘤的機制還有待進一步闡明。既往研究表明,信使RNA(mRNA)和小非編碼RNA分子(miRNA)可能是華蟾素發(fā)揮抗腫瘤作用的重要靶分子之一[13]。其中,miRNA可通過上調(diào)或下調(diào)靶點而發(fā)揮基因調(diào)控的作用,目前學(xué)界公認miRNA調(diào)控是癌癥發(fā)生、發(fā)展和侵襲的關(guān)鍵因素[14]。近幾十年來,中藥的各種生物活性成分在調(diào)節(jié)miRNA中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注[15]。本研究的結(jié)果,即IC50值的確定,將為探索華蟾素對胃癌MKN-28細胞轉(zhuǎn)錄組的影響奠定研究基礎(chǔ),未來我們可以在此基礎(chǔ)上探討華蟾素抗胃癌的作用機制。

總之,華蟾素能使人胃癌細胞MKN-28的增殖能力下降,誘導(dǎo)凋亡,阻滯胃癌進展相關(guān)的細胞周期,具有作為潛在抗癌藥物的開發(fā)價值;但華蟾素具體抗癌機制仍有待后期進一步研究。