李春燕 劉 英＊ 李凱利 洪曉華 王 梓 王南春

1.浙江省綠色清潔技術(shù)及洗滌用品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州，310051；

2.納愛(ài)斯浙江科技有限公司，浙江杭州，310051

吡硫鎓鋅作為去屑劑已有60多年的使用歷史[1]，歐盟（EU）是化妝品行業(yè)最發(fā)達(dá)的地區(qū)之一，在化妝品監(jiān)管方面的政策法規(guī)和技術(shù)方法均處于世界前列，關(guān)注歐盟化妝品法規(guī)的進(jìn)展，對(duì)我國(guó)化妝品監(jiān)管體系的完善和行業(yè)的發(fā)展具有積極意義。2021年歐盟發(fā)布化妝品法規(guī)修訂案，從2022年3月起，禁止吡硫鎓鋅在洗護(hù)發(fā)產(chǎn)品中作為去屑劑使用[2]。因此用吡硫鎓鋅作為去屑劑的洗發(fā)水體系需要儲(chǔ)備新的去屑方案。

大量文獻(xiàn)報(bào)道馬拉色菌的過(guò)度繁殖是導(dǎo)致頭皮屑產(chǎn)生的重要原因，頭皮上馬拉色菌數(shù)量的減少和消亡直接反映為頭皮屑的減少[3-4]。因此，不少去屑劑原料的功效評(píng)價(jià)都采用對(duì)馬拉色菌的抑制能力作為指標(biāo)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致頭屑產(chǎn)生的馬拉色菌為限制性馬拉色菌和卵型糠秕馬拉色菌[6-7]，能抑制限制性馬拉色菌和糠秕馬拉色菌的產(chǎn)品將被認(rèn)為具有去屑效果。本文與黃淑明等[5]的觀點(diǎn)相似，認(rèn)為去屑劑與去屑洗發(fā)水的抑菌效果并不完全一致，因此沒(méi)有單獨(dú)研究單一去屑劑的體外抑菌效果，而是用完整的去屑洗發(fā)水配方作為測(cè)試樣。

去屑洗發(fā)水中，除吡硫鎓鋅做去屑劑外，使用頻率較多的去屑劑還有氯咪巴唑、吡羅克酮乙醇胺鹽和水楊酸，2018—2022年去屑洗發(fā)產(chǎn)品中使用氯咪巴唑、吡羅克酮乙醇胺鹽、吡硫鎓鋅和水楊酸的比例（數(shù)據(jù)來(lái)源英敏特）見(jiàn)圖1。

圖1 2018—2022年，去屑洗發(fā)產(chǎn)品中氯咪巴唑、吡羅克酮乙醇胺鹽、吡硫鎓鋅和水楊酸的使用比例

本研究通過(guò)比較氯咪巴唑、吡羅克酮乙醇胺鹽、水楊酸的去屑效果，篩選出對(duì)糠秕馬拉色菌和限制性馬拉色菌具有較好抑菌率、抑菌環(huán)和最小抑菌濃度的方案。該方案穩(wěn)定性更好，通過(guò)了人體去屑測(cè)試，取得第三方人體去屑測(cè)試的功效報(bào)告。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料、試劑與儀器

糠秕馬拉色菌（Malasseziafurfur，ATCC44344），廣東省微生物菌種保藏中心；限制性馬拉色菌（Malasseziarestricta，ATCC96810），中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA），美國(guó)BD公司；牛膽鹽、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；聚山梨醇酯40，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；吡硫鎓鋅，Kolon Life Science；吡羅克酮乙醇胺鹽，科萊恩化工科技（上海）有限公司；氯咪巴唑，上海寰球?qū)崢I(yè)發(fā)展有限公司；水楊酸，衢州市展宏生物科技有限公司；糠秕馬拉色菌所用培養(yǎng)基：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1%吐溫40和0.5%牛膽鹽；限制性馬拉色菌用培養(yǎng)基：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1%吐溫40。

生物安全柜，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器，松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；VORTEX GENIUS3 渦旋振蕩器、數(shù)顯型試管振蕩器Roller 10 digital，IKA公司；低溫培養(yǎng)箱Binder KB240，德國(guó)賓德Binder公司；皮膚表面紋理分析系統(tǒng)VisioScan VC20，Courage+Khazaka Cologne Germany。

1.2 菌懸液的制備

取二代馬拉色菌菌株凍存管進(jìn)行連續(xù)傳代，取第五代培養(yǎng)基新鮮菌苔至P B S 稀釋液中制備菌液并做適當(dāng)稀釋備用，要求濃度為（1×106～1×107） CFU/mL。方法參考QB/T 2738—2023《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評(píng)價(jià)方法》中7.2.2.5菌液制備過(guò)程。

1.3 體外去屑性能評(píng)價(jià)方法

1.3.1 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)試方法

參考《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）2.1.8.3中的瓊脂稀釋法并加以改進(jìn)，在無(wú)去屑劑空白樣洗發(fā)水基礎(chǔ)上添加1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的去屑成分，分別對(duì)倍系列稀釋到不同的濃度（以去屑劑的質(zhì)量算），同時(shí)分別配置兩種馬拉色菌對(duì)應(yīng)的雙倍濃度的培養(yǎng)基滅菌備用，分別取9 mL系列稀釋的洗發(fā)水溶液至培養(yǎng)皿中，將50 ℃左右的雙倍濃度的培養(yǎng)基9 mL加入培養(yǎng)皿，混勻待凝固后，吸取菌懸液一滴點(diǎn)種在含有去屑劑的培養(yǎng)基表面，每皿點(diǎn)中3～4個(gè)點(diǎn)位，放于32 ℃條件下培養(yǎng)7 d觀察結(jié)果。

1.3.2 抑菌率的測(cè)試方法

參考QB/T 2738—2023《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評(píng)價(jià)方法》中懸液定量法，洗發(fā)水作用濃度10%，作用時(shí)間2 min，產(chǎn)品測(cè)試濃度樣液與加入菌作用完成后，直接取樣1 mL（不做稀釋）于培養(yǎng)皿內(nèi)做菌落計(jì)數(shù)，同時(shí)也對(duì)其進(jìn)行10倍系列稀釋做活菌計(jì)數(shù)，凝固后培養(yǎng)皿倒置放于32 ℃條件下培養(yǎng)7 d后計(jì)算抑菌率。

1.3.3 抑菌環(huán)的測(cè)試方法

參考《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）2.1.8并加以改進(jìn)后實(shí)驗(yàn)。具體操作步驟：用打孔器將定性濾紙打成直徑6 mm圓形，高壓滅菌后放于烘箱內(nèi)干燥，每片圓濾紙片滴加20 μL 10%濃度的洗發(fā)水溶液，放于（47±1） ℃烘箱內(nèi)干燥30 min；將活化好的馬拉色菌制備成菌懸液，吸取1 mL至馬拉色菌培養(yǎng)基表面，多角度晃動(dòng)培養(yǎng)皿2～3 min使菌液均勻分布于培養(yǎng)基表面，吸出培養(yǎng)皿多余的菌液，半開(kāi)蓋放于超凈工作臺(tái)風(fēng)干表面水分；用鑷子夾取上述干燥的含有洗發(fā)水溶液的紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，每皿放3～4片，蓋好平皿置于32 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)40 h左右，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑，≤7 mm認(rèn)為沒(méi)有抑菌作用。

1.4 消費(fèi)者感官性能評(píng)價(jià)方法

1.4.1 內(nèi)部消費(fèi)者測(cè)試方法

制備無(wú)去屑劑的空白洗發(fā)水作為對(duì)照樣，用確定的去屑方案和空白洗發(fā)水制備成去屑洗發(fā)水作為測(cè)試樣，篩選4名有頭屑測(cè)試者，其中2名使用對(duì)照樣，另外2名使用測(cè)試樣，連續(xù)使用28 d。

使用方法：按自己的使用習(xí)慣，連續(xù)不間斷樣品。

測(cè)試區(qū)域：前額發(fā)際線正中點(diǎn)向后5 cm處。

測(cè)試時(shí)間：使用前、使用14 d后和使用28 d后。

測(cè)試儀器：皮膚表面紋理分析系統(tǒng)VisioScan VC20。

1.4.2 第三方人體測(cè)試方法

第三方測(cè)評(píng)機(jī)構(gòu)篩選31名有頭屑的測(cè)試者，先使用無(wú)去屑劑的空白樣1周，再連續(xù)使用去屑測(cè)試樣品14 d后、28 d后通過(guò)皮膚科醫(yī)生判斷和VisioScan VC20拍攝判斷去屑效果。

1.5 耐熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方法

將含吡硫鎓鋅的市場(chǎng)樣和替換吡硫鎓鋅的自制洗發(fā)水分別置于52 ℃烘箱中考察，15 d后取出恢復(fù)至室溫，觀察外觀變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 四種去屑劑的MIC結(jié)果

在無(wú)去屑劑空白樣洗發(fā)水基礎(chǔ)上添加1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的去屑劑，再稀釋成不同濃度（以去屑劑的質(zhì)量算）。比較氯咪巴唑、吡羅克酮乙醇胺鹽、吡硫鎓鋅和水楊酸四種去屑成分對(duì)糠秕馬拉色菌和限制性馬拉色菌的MIC（文中所有的百分?jǐn)?shù)均為活性物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，見(jiàn)表1。

表1 限制性馬拉色菌和糠秕馬拉色菌的MIC

由表1可知，四種去屑成分中，吡羅克酮乙醇胺鹽對(duì)限制性馬拉色菌的MIC最小，其次是吡硫鎓鋅，氯咪巴唑和水楊酸。吡硫鎓鋅、吡羅克酮乙醇胺鹽和氯咪巴唑?qū)凤躐R拉色菌的MIC均在25 ppm左右，水楊酸對(duì)糠秕馬拉色菌的MIC＞400 ppm。

2.2 抑菌環(huán)和抑菌率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 四種去屑劑的抑菌率和抑菌環(huán)結(jié)果

考察了在無(wú)去屑劑空白樣洗發(fā)水基礎(chǔ)上，添加不同加量的去屑劑或相同加量的去屑劑在不同pH值下對(duì)糠秕馬拉色菌和限制性馬拉色菌的抑菌率和抑菌環(huán)，數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，見(jiàn)表2。

表2 不同方案的抑菌率和抑菌環(huán)

從表2數(shù)據(jù)看出，吡硫鎓鋅對(duì)兩種菌的抑菌率和抑菌環(huán)的效果最好，氯咪巴唑?qū)凤躐R拉色菌的作用效果明顯，加量≥0.4%時(shí)對(duì)糠秕馬拉色菌的抑菌率可以＞99.9%，吡羅克酮乙醇胺鹽對(duì)兩種馬拉色菌的抑菌率隨加量的提高而增強(qiáng)，對(duì)限制性馬拉色菌的抑菌率比糠秕馬拉色菌的作用更好。水楊酸單獨(dú)使用，加量在0.4%及以下時(shí)，對(duì)兩種馬拉色菌基本沒(méi)有抑制效果。

推測(cè)吡羅克酮乙醇胺鹽和氯咪巴唑組合的方案有比較好的效果。

2.2.2 去屑劑組合的抑菌率和抑菌環(huán)結(jié)果

根據(jù)表2 的結(jié)果，將氯咪巴唑的加量定在0.4%，組合不同加量的吡羅克酮乙醇胺鹽，數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，見(jiàn)表3。

表3 不同方案的抑菌率和抑菌環(huán)

從表3結(jié)果可知，隨著吡羅克酮乙醇胺鹽加量的提高，對(duì)限制性馬拉色菌的抑菌作用增強(qiáng)，體現(xiàn)在限制性馬拉色菌的抑菌率和抑菌環(huán)數(shù)據(jù)上，可見(jiàn)吡羅克酮乙醇胺鹽達(dá)到一定濃度后對(duì)限制性馬拉色菌的抑制作用是明顯的，0.25%吡羅克酮乙醇胺鹽＋0.4%氯咪巴唑的性價(jià)比最高，除了對(duì)限制性馬拉色菌的抑菌環(huán)不如吡硫鎓鋅，其他結(jié)果均不差于吡硫鎓鋅。

2.2.3 去屑組合與市場(chǎng)樣的比較

將確定的去屑組合（0.25%吡羅克酮乙醇胺鹽＋0.4%氯咪巴唑）與部分去屑洗發(fā)露（市場(chǎng)樣1、2、3不含吡硫鎓鋅，市場(chǎng)樣4含吡硫鎓鋅）做抑菌率和抑菌環(huán)對(duì)比，數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，見(jiàn)表4。

表4 不同方案的抑菌率和抑菌環(huán)

從表4結(jié)果看出，0.25%吡羅克酮乙醇胺鹽+0.4%氯咪巴唑的配方體系對(duì)兩種馬拉色菌的抑菌率、抑菌環(huán)和MIC在不含吡硫鎓鋅的市場(chǎng)樣中處于較高水平；與含吡硫鎓鋅的市場(chǎng)樣相比，除了限制性馬拉色菌的抑菌環(huán)數(shù)據(jù)稍低，其他指標(biāo)均相當(dāng)。

2.3 消費(fèi)者感官性能評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 內(nèi)部消費(fèi)者感官評(píng)價(jià)

制備無(wú)去屑劑的空白洗發(fā)水，加入0.5%吡硫鎓鋅為測(cè)試樣1、加入0.25%吡羅克酮乙醇胺鹽和0.4%氯咪巴唑?yàn)闇y(cè)試樣2。篩選4名有頭屑的測(cè)試者，2名使用測(cè)試樣1，另外2名使用測(cè)試樣2，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 使用前后的去屑效果

從表5看出，測(cè)試樣2的去屑效果不差于測(cè)試樣1，二者的去屑效果在14 d后就表現(xiàn)明顯，28 d后仍保持健康無(wú)頭屑狀態(tài)，均具有去屑效果。

2.3.2 第三方消費(fèi)者感官評(píng)價(jià)

將確定的去屑方案制備成100年潤(rùn)發(fā)柔亮去屑調(diào)理洗發(fā)露，送第三方測(cè)去屑功效。

檢驗(yàn)項(xiàng)目：去屑功效類測(cè)試。

測(cè)試人數(shù)：31人。

檢測(cè)依據(jù)：參考團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/ZHCA 019—2022《化妝品去屑功效測(cè)試方法》。

檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)：華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司。

評(píng)價(jià)方法：皮膚科醫(yī)生判斷和VisioScan VC20拍攝使用前后對(duì)比照片。

檢測(cè)結(jié)論：與使用前相比，使用測(cè)試樣品14 d后的頭屑等級(jí)評(píng)分顯著性下降；與使用前相比，使用測(cè)試樣品28 d后的頭屑等級(jí)評(píng)分顯著性下降；該測(cè)試樣品有去屑功效。數(shù)據(jù)見(jiàn)表6和表7。

表6 皮膚科醫(yī)生對(duì)頭屑等級(jí)評(píng)分結(jié)果

表7 部分圖片案例

2.4 耐熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將含吡硫鎓鋅的洗發(fā)水市場(chǎng)樣和替換吡硫鎓鋅的自制洗發(fā)水分別置于52 ℃烘箱中考察，15 d后取出恢復(fù)至室溫，觀察外觀變化?？梢钥闯鼋?jīng)過(guò)52 ℃耐熱15 d，吡硫鎓鋅的洗發(fā)水市場(chǎng)樣出現(xiàn)分層，替換吡硫鎓鋅的自制洗發(fā)水穩(wěn)定性好于含吡硫鎓鋅的洗發(fā)水市場(chǎng)樣（圖2）。

圖2 耐熱穩(wěn)定性對(duì)照

3 結(jié)論

以糠秕馬拉色菌和限制性馬拉色菌為指示菌，本研究篩選出在去屑洗發(fā)水中替換去屑劑吡硫鎓鋅去屑體系：0.25%吡羅克酮乙醇胺鹽加0.4%氯咪巴唑，含該體系的洗發(fā)水在體外去屑評(píng)價(jià)（抑菌率、抑菌環(huán)和MIC）的結(jié)果均不差于含吡硫鎓鋅的洗發(fā)水。該去屑體系的第三方人體去屑功效測(cè)試結(jié)果表明：與使用前相比，使用14 d后的頭屑評(píng)分顯著性下降；與使用前相比，使用28 d后的頭屑評(píng)分顯著性下降；體外去屑評(píng)價(jià)與人體去屑測(cè)試的結(jié)果一致，該去屑體系具有去屑功效。通過(guò)52 ℃耐熱穩(wěn)定性考察，替換吡硫鎓鋅的洗發(fā)水體系的穩(wěn)定性顯著好于含吡硫鎓鋅的洗發(fā)水。