宋娜娜 李永明 山東省青島市精神衛(wèi)生中心 266034

由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的結(jié)核病(TB)是導(dǎo)致人類死亡的重要原因。2022年約140萬人死于TB[1]。此外,耐藥結(jié)核病例大幅度增長。Mtb感染很難治療,因為Mtb的大部分生命周期都處于非復(fù)制(NR)狀態(tài)。由于NR Mtb對抗生素作用具有高度耐受性,并且可以突變?yōu)槟退幮?DR),因此常規(guī)結(jié)核病(TB)治療無效。適當控制細胞內(nèi)病原體Mtb的細胞分裂對其生長、存活、發(fā)病機制和抗生素耐藥性至關(guān)重要。然而,分枝桿菌調(diào)節(jié)其細胞周期的分裂成分和機制尚不完全清楚。細胞分裂是細菌繁殖的必要過程了解分枝桿菌的分裂機制及相關(guān)作用蛋白可能有助于TB新型疫苗的研發(fā)。有研究表明Mtb的Rv2147c基因及其編碼的SepF蛋白是一種細菌細胞分裂相關(guān)蛋白[2],參與細菌細胞分裂過程但在TB中結(jié)構(gòu)和功能尚不明確。本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測SepF蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,為抗結(jié)核藥物靶點選擇提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 目的基因及相關(guān)編碼信息獲取 從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取SepF蛋白的核酸及氨基酸序列等信息。SepF蛋白的Gene ID為887394,其蛋白序列為NP_216663.1。

1.2 方法

1.2.1 Rv2147c基因相關(guān)信息分析。Rv2147c基因序列信息從NCBI獲取,使用ORF Finger軟件分析其開放閱讀框。

1.2.2 SepF蛋白基本理化性質(zhì)分析。SepF蛋白的理化特征(如分子質(zhì)量、分子式、氨基酸構(gòu)成、不穩(wěn)定指數(shù)等)采用Expasy的Protparam預(yù)測。

1.2.3 SepF蛋白的親疏水性及信號肽、跨膜區(qū)、磷酸化位點分析。蛋白磷酸化位點是與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)相關(guān)的調(diào)節(jié)生物活性的特定位點。SepF蛋白的親疏水性采用ProtScale分析;采用SignaIP6.0 Server分析信號肽;采用PSORTb分析亞細胞定位;采用DEEP TMHMM分析跨膜區(qū);采用NetPhos3.1分析磷酸化位點。

1.2.4 SepF蛋白二級結(jié)構(gòu)分析與三級結(jié)構(gòu)建模。將SepF蛋白氨基酸序列輸入SOPMA軟件分析SepF蛋白的二級結(jié)構(gòu);SWISS-MODEL軟件通過分析氨基酸序列構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)模型。

1.2.5 蛋白質(zhì)抗原表位分析。應(yīng)用IEDB軟件預(yù)測SepF蛋白的B細胞表位,預(yù)測優(yōu)勢抗原表位;采用軟件預(yù)測分析T細胞抗原表位,選取HLA-A*02：01基因型>21分的優(yōu)勢抗原表位進行綜合分析。

1.2.6 相互作用蛋白預(yù)測。SepF的互作蛋白利用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測并對其生物學(xué)功能進行富集。

2 結(jié)果

2.1 Rv2147c基因相關(guān)信息及序列分析 Rv2147c基因的位于Mtb H37Rv的2406118-2406843,全長657bp,CG含量約占64%。SepF蛋白由218個氨基酸構(gòu)成,序列號為NP_216663.1。Rv2147c含有3個ORF,最長ORF 657 bp,編碼218個氨基酸(見圖1)。

圖1 Rv2147c基因的開放閱讀框分析

2.2 SepF蛋白的理化性質(zhì) SepF蛋白由218個氨基酸構(gòu)成,分子質(zhì)量為25 027.83ku,等電點5.40。SepF分子式為C1095H1668N320O337S10,包含3 430個原子。預(yù)測SepF蛋白脂肪指數(shù)為49.36,不穩(wěn)定指數(shù)53.74,可能為不穩(wěn)定蛋白。

2.3 SepF蛋白的親疏水性及信號肽、跨膜區(qū)、磷酸化位點分析 SepF蛋白親水性系數(shù)最高得分為2.222,最低得分為-2.889,為親水性蛋白(見圖2a)。PSORTb分析結(jié)果顯示,SepF蛋白定位于胞質(zhì)。使用SignaIP6.0 Server軟件預(yù)測的SepF蛋白信號肽(見圖2b),標準值D值小于閾值,表明SepF蛋白無信號肽端。TMHMM結(jié)果表明,SepF蛋白無跨膜螺旋(見圖2c),且218個氨基酸位于膜內(nèi)側(cè)的可能性為1.0。NetPhos 3.1結(jié)果顯示,28個磷酸化位點(13個Serine,6個Threonine,9個tyrosine)存在于SepF蛋白(見圖2d)。

圖2 SepF蛋白的親疏水性及信號肽、跨膜區(qū)、磷酸化位點分析

2.4 SepF蛋白的二、三級結(jié)構(gòu) 使用SOPMA進預(yù)測SepF蛋白二級結(jié)構(gòu)(見圖3a),其中包含29.05%的Hh,8.71%的Ee,3.32%的Tt,58.92%的Cc。SepF蛋白三級結(jié)構(gòu)模型(見圖3b)。

2.5 SepF蛋白相關(guān)抗原表位 應(yīng)用IEDB軟件預(yù)測SepF蛋白的B細胞表位,其中序列10-22,39-149,162-163等為優(yōu)勢抗原表位。采用軟件預(yù)測分析T細胞抗原表位,HLA-A*02：01其中>21分以上的有8個。

2.6 SepF相互作用蛋白 STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測SepF的互作蛋白,結(jié)果見圖4。包括ftsQ、ftsZ、ftsW、Rv2148c、yfiH等可與SepF蛋白相互作用富集于細胞分裂生物學(xué)過程。Rv2148c是一種非必需的保守蛋白,功能未知。在大腸桿菌中,yfiH有助于維持肽聚糖的組成,并且從大腸桿菌染色體中敲除pgeF導(dǎo)致絲氨酸或甘氨酸摻入細胞壁,導(dǎo)致對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性增加。在革蘭陽性菌細胞分裂起始階段聚合的FtsZ與SepF組合形成一種稱為原環(huán)的結(jié)構(gòu)。在原始環(huán)形成后,“晚期”分裂蛋白(ftsQ、ftsW等)開始組裝以促進參與細胞壁重塑的下游過程[3]。

圖4 SepF蛋白的相互作用蛋白預(yù)測

3 討論

耐多藥結(jié)核和廣泛耐藥結(jié)核的出現(xiàn)嚴重威脅人類和公共衛(wèi)生安全。細菌對3種或3種以上“二線”抗生素的耐藥性被歸類為極度耐藥結(jié)核病(XDR-TB),迫切需要開發(fā)具有新作用機制的新型抗結(jié)核藥物,與真核細胞不同,細胞分裂在很大程度上仍未用于開發(fā)新的細菌治療目的。細胞分裂是生物發(fā)展過程中的基本環(huán)節(jié),因此它是開發(fā)抗結(jié)核藥物的一個非常有希望的目標。

生物信息學(xué)分析顯示SepF蛋白氨基酸組成中排名前三位的都是脂肪族氨基酸,包括Arg(13.3%)、Asp(12.8%)、Ala(10.1%),有研究表明SepF可能與膜蛋白相互作用,或者SepF是一種外周膜蛋白,并且對脂質(zhì)雙層本身具有親和力[4],這也表明調(diào)控SepF可能會影響Mtb膜結(jié)構(gòu)的分配,從而影響Mtb自身存活或是宿主免疫機制。SepF蛋白為定位于細胞質(zhì)的親水性蛋白質(zhì),含有磷酸化位點表明其與信號傳導(dǎo)相關(guān)。本研究預(yù)測SepF蛋白含有29.05%的Hh,說明該蛋白相對保守。SepF蛋白Cc占58.92%,說明其具有重要功能。SepF蛋白的重要功能可能為抗結(jié)核疫苗的研發(fā)提供重要的理論支持。

預(yù)測SepF的可能相互作用蛋白為包括ftsQ、ftsZ、ftsW、Rv2148c、yfiH等可與SepF蛋白相互作用富集于細胞分裂生物學(xué)過程。細胞分裂是一個復(fù)雜的多步驟過程,需要以空間和時間控制的方式有序組裝各種蛋白質(zhì)。盡管在大腸桿菌中對協(xié)調(diào)細胞分裂的分子事件進行了最好的研究,但對Mtb的細胞復(fù)制過程知之甚少,Mtb是一種生長緩慢的細胞,倍增時間為24h。與大腸桿菌相比,Mtb的細胞分裂機制可能不同。有研究表明SepF在包皮分枝桿菌和枯草芽孢桿菌中參與其細胞分裂過程。保守的細胞分裂蛋白SepF在細胞中Z環(huán)的合成過程中與FtsZ形成聚合物,FtsZ是細菌中的關(guān)鍵細胞分裂蛋白,這是細胞分裂的第一階段。此外,SepF還充當Z環(huán)的膜錨。SepF過表達會阻斷包皮分枝桿菌中的細胞分裂,為什么會這樣尚不清楚。在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)SepF過量生產(chǎn)不會干擾Z環(huán)組裝,而是阻止負責隔膜合成的晚期分裂蛋白的組裝[5]。這表明,除了將FtsZ細絲錨定在膜上外,SepF在細胞分裂中也具有調(diào)節(jié)作用。在革蘭氏陽性菌中,FtsZ聚合物通過外周膜蛋白SepF附著在細胞膜上。一旦Z環(huán)組裝完成,所謂的晚期細胞分裂蛋白就會被招募,負責分裂隔膜的合成,例如肽聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶FtsW。晚期蛋白質(zhì)的組裝需要枯草芽孢桿菌中存在保守的跨膜蛋白FtsL、DivIC和DivIB,以及大腸桿菌中的同源蛋白FtsL、FtsB和FtsQ[6]。這些蛋白質(zhì)沒有明確的催化結(jié)構(gòu)域,它們可能起著結(jié)構(gòu)作用,并以某種方式調(diào)節(jié)晚期細胞分裂蛋白向Z環(huán)的募集。SepF在包皮分枝桿菌和枯草芽孢桿菌中的研究表明SepF在細菌細胞分裂過程中起著重要作用,了解這一僅限于病原體且宿主中不存在的過程,可能會為開發(fā)潛在的新抗菌藥物選擇合理的靶點,為破壞蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的新藥物的研發(fā)提供理論支持。

淋巴細胞表面受體能夠與Mtb的抗原表位結(jié)合從而發(fā)揮免疫作用,從而為疫苗開發(fā)的理論依據(jù)。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SepF蛋白含有大量抗原表位,為新型抗結(jié)核藥物提供了理論依據(jù)。