王繼祖，劉 磊，王森山，宋麗雯

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070）

豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)是豆科作物上的一種害蟲(chóng)，具有繁殖速度快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，近年來(lái)對(duì)苜蓿(Medicago sativa)等豆科植物的產(chǎn)量和質(zhì)量造成了嚴(yán)重的威脅。在我國(guó)西北苜蓿種植區(qū)，豌豆蚜每年給苜蓿生產(chǎn)造成10%～30%的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

單寧酸是植物的次生代謝產(chǎn)物，通過(guò)影響昆蟲(chóng)的取食，從而對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響[2]。邵婭等[3]研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸對(duì)豌豆蚜的生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖具有明顯抑制作用。陸宴輝等[4]用單寧酸飼喂蚜蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度在100 mg·kg-1以?xún)?nèi)時(shí)，單寧酸對(duì)棉蚜(Aphis gossypii)的生長(zhǎng)發(fā)育具有抑制作用；當(dāng)單寧酸濃度大于200 mg·kg-1時(shí)，棉蚜死亡率高達(dá)100%。單寧酸、沒(méi)食子酸還明顯抑制麥長(zhǎng)管蚜(Sitobion avenae)羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferaes, GST)的活力，降低蚜蟲(chóng)解毒能力[5]。有研究表明，雖然苜蓿中含有單寧酸，但是豌豆蚜可以在苜蓿上正常生長(zhǎng)發(fā)育[6]，表明其具有代謝單寧酸的能力。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是具有多種功能的超基因家族酶系，普遍存在動(dòng)植物、微生物中。目前研究表明，昆蟲(chóng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因分為Delta、Epsil、Omega、Sigma、Theta和Zeta6 個(gè)家族，其中Delta和Epsilon家族是昆蟲(chóng)特有的GSTs家族[7]?，F(xiàn)已報(bào)道的豌豆蚜20 個(gè)GST基因主要以Delta和Sigma亞家族為主[8]。GST 主要功能是催化有毒物質(zhì)形成低毒、易溶于水的化合物而排出體外，減少或避免對(duì)機(jī)體造成損傷[9]。GST 作為昆蟲(chóng)代謝外源物質(zhì)的主要酶之一，其活性受到植物次生物質(zhì)的誘導(dǎo)。研究表明，肉桂酸、水楊酸、花椒毒素、槲皮素、黃酮、香豆素、單寧酸、沒(méi)食子酸和蘆丁等植物次生物質(zhì)均能誘導(dǎo)斜紋夜蛾(Spodoptera litura)體內(nèi)GST 活性[10]。Wang 等[11]的研究結(jié)果表明，取食添加蘆丁、槲皮素、尼古丁、苦參堿、印楝素或魚(yú)藤酮的人工飼料后，短星翅蝗(Calliptamus abbreviatus)的GST 活性均顯著增加。亞洲小車(chē)蝗(Oedaleus asiaticus)的GST活性與食物中植物次生化合物的含量呈正相關(guān)關(guān)系[12]，類(lèi)似的結(jié)果也在麥長(zhǎng)管蚜中發(fā)現(xiàn)[13]。表明不同的植物次生物質(zhì)均可誘導(dǎo)昆蟲(chóng)體內(nèi)GST 活性，且在一些昆蟲(chóng)中存在劑量效應(yīng)。

GST家族基因在昆蟲(chóng)代謝植物次生物質(zhì)的功能已經(jīng)被證實(shí)。斜紋夜蛾8 個(gè)GST基因經(jīng)番茄堿處理后上調(diào)，RNA 干擾降低其中一個(gè)GST基因GSTS1的表達(dá)后，番茄堿對(duì)幼蟲(chóng)的毒性增加[14]?；ń范舅亍螌幩?、沒(méi)食子酸或蘆丁等植物次生物質(zhì)均可引起斜紋夜蛾SlGSTE1轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)[15]。此外，降低褐飛虱(Nilaparvata lugens)體內(nèi)NlGSTE1的表達(dá)量，導(dǎo)致褐飛虱對(duì)阿魏酸的敏感性增加[16]。干擾NlGST1-1的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致褐飛虱對(duì)含有蘆竹堿的飼料更加敏感[17]，此外，褐飛虱NlGST1-1的轉(zhuǎn)錄水平被降低后，若蟲(chóng)的相對(duì)增長(zhǎng)率和雌蟲(chóng)繁殖力也顯著降低[18]。這些研究結(jié)果表明一種植物次生物質(zhì)可以誘導(dǎo)多個(gè)GST基因的上調(diào)，而且一個(gè)GST基因可以參與昆蟲(chóng)對(duì)多種植物次生物質(zhì)的代謝，但豌豆蚜中GST基因的轉(zhuǎn)錄是否受到單寧酸的影響尚不清楚。

為明確單寧酸對(duì)豌豆蚜體內(nèi)GST 活性的影響，解析豌豆蚜不同組織GST基因在單寧酸處理前后轉(zhuǎn)錄水平的差異及變化規(guī)律，本研究以綠色型豌豆蚜為供試材料，測(cè)定豌豆蚜在單寧酸處理48 h 后GST 活性變化；通過(guò)分析文獻(xiàn)與豌豆蚜基因組數(shù)據(jù)，確定豌豆蚜體內(nèi)存在22 條GST基因；利用qPCR 解析豌豆蚜不同組織GST基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)單寧酸的響應(yīng)，旨為探究GST基因在豌豆蚜代謝單寧酸中的功能奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

挑選發(fā)育健康的綠色型豌豆蚜成蚜于離體蠶豆(Vicia faba)葉片上，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)[溫度：25 ℃，光周期：16 h/8 h (光/暗)]，待產(chǎn)蚜后剔除成蚜，培育至3 齡若蚜?xí)r用于試驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：酶標(biāo)儀(BioTek Instruments, Inc)、高速冷凍離心機(jī)、HQH-H300 智能人工氣候箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、熒光定量PCR 儀(美國(guó)Applied Biosystems 公司)、Eppendorf 型移液槍和水浴鍋等。

主要試劑：異丙醇(甘肅中瑞化工有限公司)、氯仿(成都市科隆化學(xué)品有限公司)、無(wú)水乙醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒(寶生物工程Takara 有限公司)、qPCR試劑盒(蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司)等。

1.3 研究方法

1.3.1 單寧酸對(duì)豌豆蚜GST 活性的影響測(cè)定

試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照和處理兩組。采用離體葉片植物介導(dǎo)法[19]，將蠶豆苗插入1.5 mL 離心管中，再加入2 g·L-1單寧酸1 000 μL。然后將離心管轉(zhuǎn)移至一個(gè)覆蓋著紗布的透明塑料杯中，之后將3 齡若蚜挑取至塑料杯中的蠶豆苗上。讓其攝入單寧酸48 h，對(duì)照為清水。每個(gè)處理40 只蚜蟲(chóng)，48 h 后每個(gè)處理收集0.02 g 蚜蟲(chóng)鮮重，用于GST 活性測(cè)定，3 個(gè)生物重復(fù)。收集的蚜蟲(chóng)經(jīng)液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用，測(cè)定時(shí)加入緩沖液研磨，制成酶液。

GST 活性測(cè)定方法：使用GST 活性檢測(cè)試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)測(cè)定并計(jì)算出豌豆蚜的酶比活力。

1.3.2 單寧酸對(duì)豌豆蚜GST基因表達(dá)的測(cè)定

1)樣品收集

試驗(yàn)設(shè)置同1.3.1，每處理設(shè)4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50 只蚜蟲(chóng)，48 h 后進(jìn)行解剖，分別收集頭、胸、腹、中腸。收集的蚜蟲(chóng)組織經(jīng)液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

2) cDNA 的制備

將樣品在低溫環(huán)境下研磨，用Trizol 法提取各組織總RNA，ScanDrop 微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA 濃度，選擇A260/A280> 1.8 且A260/A230> 1.8的樣品，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后的cDNA 保存于-20 ℃作為qPCR 模板備用。

3)引物設(shè)計(jì)

豌豆蚜GTS基因的引物序列如表1 所列。

表1 豌豆蚜GST 基因qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequence from qRT-PCR for the GST genes of pea aphids

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，整理后的數(shù)據(jù)根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[20]。使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行基因表達(dá)量顯著性分析，以P< 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用Origin 2018 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 單寧酸對(duì)豌豆蚜GST 活性的影響

豌豆蚜取食2 g·L-1單寧酸48 h 后，其GSTs 活性為7.598 nmol·(min·g)-1，對(duì)照組GSTs 活性為11.036 nmol·(min·g)-1。測(cè)定結(jié)果表明，GST 活性有所下降，但與對(duì)照組相比差異不顯著(P> 0.05)。

2.2 單寧酸對(duì)豌豆蚜GST 基因qRT-PCR 分析

2.2.1 豌豆蚜頭部GST基因qRT-PCR 分析

通過(guò)對(duì)豌豆蚜頭部GST基因表達(dá)量測(cè)定分析，結(jié)果顯示，蚜蟲(chóng)取食單寧酸后，其頭部有11 個(gè)基因表達(dá)水平變化顯著(P< 0.05) (圖1)，其中ApGST101、ApGST102、ApGST104、ApGST109、ApGST2、ApGSTX1、ApGSTD6顯著上調(diào)表達(dá)(圖1A)，ApGST101表達(dá)量上調(diào)2.5 倍；ApGST104、ApGSTX1上調(diào)表達(dá)3 倍左右；ApGST103、ApGST108、ApGSCD、ApGSTomega表達(dá)量下調(diào)(圖1B)，其中ApGST108、ApGSTCD下調(diào)表達(dá)3 倍左右；ApGST103、ApGSTomega下調(diào)表達(dá)1.4 倍左右。有11 個(gè)基因表達(dá)水平不顯著(P> 0.05) (圖1C)。

2.2.2 豌豆蚜胸部GST基因qRT-PCR 分析

蚜蟲(chóng)取食單寧酸后，其胸部有15 個(gè)基因表達(dá)水平變化顯著(P< 0.05) (圖2)，其中ApGST101、ApGST102、ApGST103、ApGST104、ApGST109、ApGST2、ApGSTX4、ApGSTD5、ApGSTD6、ApGSTthet均上調(diào)表達(dá)，ApGSTD6相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的6.4 倍；ApGST107、ApGST108、ApGST3、ApGSTX3、ApGSTomega被單寧酸抑制，呈下調(diào)表達(dá)(圖2B)，其中ApGST107、ApGSTomega下調(diào)表達(dá)5 倍左右；ApGST108、ApGST3、下調(diào)表達(dá)3.5倍；ApGSTX3下調(diào)表達(dá)1.6 倍。有7 個(gè)基因表達(dá)差異不顯著(P> 0.05) (圖2C)。

圖2 豌豆蚜取食單寧酸48 h 胸部GST 基因表達(dá)量的變化Figure 2 Changes in GST genes expression in the thorax of pea aphids treated with tannic acid for 48 hours

2.2.3 豌豆蚜腹部GST基因qRT-PCR 分析

蚜蟲(chóng)取食單寧酸后，其腹部有16 個(gè)基因表達(dá)水平變化顯著(P< 0.05) (圖3)，ApGST101、ApGST103、ApGST104、ApGST105、ApGST107、ApGST702、ApGSTX1、ApGSTX5、ApGSTD6、ApGSTthet顯著上調(diào)表達(dá)，其中ApGST101、ApGST105表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的5 倍；在單寧酸誘導(dǎo)下，ApGST108、ApGST109、ApGSTD5和ApGSTomega下調(diào)表達(dá)2 倍左右(圖3B)；ApGST3、ApGSTX3分別下調(diào)表達(dá)3.9 倍和6.2 倍。有6 個(gè)基因表達(dá)量差異不顯著(P> 0.05) (圖3C)。

圖3 豌豆蚜取食單寧酸48 h 腹部GSTs 基因表達(dá)量的變化Figure 3 Changes in GST gene expression in the abdomen of pea aphids treated with tannic acid for 48 hours

2.2.4 豌豆蚜中腸GST基因qRT-PCR 分析

蚜蟲(chóng)取食單寧酸后，其中腸有13 個(gè)基因表達(dá)水平具顯著性差異(P< 0.05) (圖4)，其中ApGST104、ApGST105、ApGST107、ApGST2、ApGST3、ApGSTD6、ApGSTX4、ApGSTX6、ApGSTCD顯著上調(diào)表達(dá)(圖4A)，APGST105表達(dá)量上調(diào)最高，為對(duì)照的3.2 倍；有4 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖4B)，ApGSTomega下調(diào)表達(dá)最高，為7 倍左右；ApGST102和ApGST701下調(diào)表達(dá)2 倍左右；ApGSTthet下調(diào)表達(dá)3.3 倍。有9 個(gè)基因表達(dá)量差異不顯著(P> 0.05) (圖4C)。

圖4 豌豆蚜取食單寧酸48 h 中腸GST 基因表達(dá)量的變化Figure 4 Changes in GST gene expression in the midgut of pea aphids treated with tannic acid for 48 hours

3 討論

單寧酸是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物中，對(duì)許多害蟲(chóng)物種的生長(zhǎng)具有內(nèi)源性抑制作用[21]。研究表明，單寧酸在昆蟲(chóng)腸道中會(huì)與葉蛋白或消化酶形成復(fù)合物，降低昆蟲(chóng)對(duì)食物的利用率并延緩昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育[22-23]。解毒酶在昆蟲(chóng)代謝外源物質(zhì)中發(fā)揮重要的作用，是維持昆蟲(chóng)正常生理功能的重要物質(zhì)[24]。昆蟲(chóng)的主要解毒酶包括細(xì)胞色素P450 酶(Cytochrome P450, CYP450)、GST、羧酸酯酶(CarE)等。昆蟲(chóng)在代謝外源物質(zhì)的過(guò)程中，GST 將其底物與谷胱甘肽分子結(jié)合，使底物更易溶于水；CYP450氧化其底物使其對(duì)偶聯(lián)酶具有反應(yīng)性；CarE 可水解許多含有內(nèi)源性和外源性酯的化合物[25]。解毒酶在昆蟲(chóng)與寄主植物之間的相互作用中具有重要作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)單寧酸可影響GST 的活性并且在不同組織中對(duì)GST基因表達(dá)有一定的影響。

植物次生物質(zhì)對(duì)不同昆蟲(chóng)的作用效果也不同。辣椒素對(duì)煙青蟲(chóng)(Helicoverpa assulta) GST 有顯著的誘導(dǎo)作用，番茄苷則抑制其活性。而番茄苷、辣椒素對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera) GST 并無(wú)顯著影響[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蚜取食2 g·L-1單寧酸48 h后，GST 活性下降，可能是由于豌豆蚜吸收單寧酸含量超過(guò)了自身解毒代謝的極限，導(dǎo)致解毒代謝功能下降，GST 活性降低。單寧酸對(duì)GST 活性的影響取決于劑量和時(shí)間，低劑量或短時(shí)間用單寧酸處理，GST 活性升高，反之，GST 活性降低或沒(méi)有影響[28]。如單寧酸對(duì)楊小舟蛾(Micromelalopha troglodyta) GST誘導(dǎo)具有明顯的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系[29]。通過(guò)對(duì)馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaea operculella)進(jìn)行含煙堿飼料飼喂，發(fā)現(xiàn)煙堿處理后其體內(nèi)解毒酶CarE和GST 的含量呈逐漸降低的趨勢(shì)，可能是馬鈴薯塊莖蛾為了適應(yīng)煙堿而作出的響應(yīng)[30]。

研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素等可以誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)GST基因的上調(diào)表達(dá)，表明GST基因可能參與了棉鈴蟲(chóng)對(duì)槲皮素的代謝過(guò)程[31]。此外，番茄堿可以誘導(dǎo)斜紋夜蛾GST基因的上調(diào)表達(dá)，利用RNA 干擾降低其中一個(gè)GST基因的表達(dá)后，番茄堿對(duì)幼蟲(chóng)的毒性增加[32]。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR 分析了蚜蟲(chóng)中腸、頭部、胸部和腹部中22 個(gè)條GST基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，GST基因在蚜蟲(chóng)不同組織中具有多樣化的表達(dá)模式。其中ApGST101在頭部的表達(dá)量上調(diào)了2.5 倍，ApGSTD6在胸部中的相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)6.4 倍。這可能是由于唾液腺在解剖過(guò)程中并未分離的原因。昆蟲(chóng)唾液腺具有排毒、抵抗植物次生物質(zhì)和外源有毒物質(zhì)的作用[33]。不同組織中，桃蛀螟(Dichocrocis punctiferalis)CYP4G113基因在唾液腺中的表達(dá)量最高。CYP4G113基因被干擾后，幼蟲(chóng)在玉米(Zea mays)上的存活率、化蛹率等生命參數(shù)顯著降低。這可能是CYP4G113基因被干擾后影響了桃蛀螟對(duì)寄主次生物質(zhì)的代謝，有毒物質(zhì)大量積累，導(dǎo)致死亡[34]。當(dāng)桃蚜(Myzus persicae)取食含有茉莉酸和水楊酸的人工飼料后，唾液腺特異表達(dá)基因C002和sigma GST基因表達(dá)量顯著升高，表明桃蚜利用寄主植物次生代謝產(chǎn)物，提高相關(guān)解毒酶或唾液蛋白基因表達(dá)量，增強(qiáng)對(duì)寄主防御的適應(yīng)性[35]。

本研究中，ApGST105在中腸組織中表達(dá)水平最高。中腸是外源化合物解毒的重要部位，含有高水平表達(dá)的GST基因[36]。所以推測(cè)ApGST105基因可能參與了豌豆蚜對(duì)單寧酸的代謝過(guò)程。在對(duì)其他昆蟲(chóng)的研究中也有類(lèi)似結(jié)果，如美國(guó)白蛾(Hyphantria cunea)取食添加綠原酸的人工飼料后，中腸中1 個(gè)GST基因的mRNA 水平被顯著誘綠原酸誘導(dǎo)[37]。此外，昆蟲(chóng)的脂肪體在其對(duì)植物次生代謝物和外源毒素解毒代謝的過(guò)程中也有重要作用[38]。如斜紋夜蛾進(jìn)食0.01%單寧酸、0.5%單寧酸后，脂肪體SlGSTe1的表達(dá)量顯著上升，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，單寧酸可以使脂肪體的SlGSTe1表達(dá)上調(diào)[14]。而本研究中ApGST105在腹部中表達(dá)量上調(diào)5 倍，可能是因?yàn)橹倔w參與了豌豆蚜代謝單寧酸的過(guò)程。

經(jīng)單寧酸處理48 h 后，豌豆蚜體內(nèi)GST 活性降低，但部分GST基因顯著上調(diào)表達(dá)。這可能與豌豆蚜部分GST基因下調(diào)倍數(shù)較高有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，單寧酸對(duì)GST 活性以及GST基因的轉(zhuǎn)錄都產(chǎn)生了影響。后期將根據(jù)定量分析GST基因表達(dá)量的結(jié)果，篩選出關(guān)鍵基因，用RNAi技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵基因的基因功能，進(jìn)一步闡釋豌豆蚜對(duì)單寧酸代謝機(jī)制。