仁增卓嘎， 楊康潔， 蘆永良， 王志鑫， 王海久

1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院 a.肝膽外科， b.檢驗(yàn)科， 西寧 810001

2 拉薩市人民醫(yī)院麻醉科， 拉薩 850000

中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NET）可由致病菌、免疫復(fù)合物、血小板、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生［1］。其釋放過度會(huì)導(dǎo)致多種免疫細(xì)胞相互作用，促使IL-8、IL-6、TNF-α等多種細(xì)胞因子分泌，從而促進(jìn)炎癥引發(fā)組織損傷［2］。NET不但與自身免疫疾病、癌癥和血栓形成在內(nèi)的幾種疾病的病理生理有關(guān)，而且近些年研究表明，NET在肝臟疾病中發(fā)揮重要作用，且NET的過度釋放還可加速肝臟疾病向肝癌的進(jìn)展。本文通過綜述NET在乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、缺血再灌注損傷、肝臟腫瘤中的最新研究進(jìn)展，為相關(guān)肝病的診療和肝癌的預(yù)防提供新的思路。

1 NET形成機(jī)制與肝臟病理機(jī)制

1.1 NET形成機(jī)制 NET是細(xì)菌、病毒、細(xì)胞因子、LPS和PMA等物質(zhì)刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的，其中PMA［3］能夠最大限度激活中性粒細(xì)胞，形成由中性粒細(xì)胞彈性酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、瓜氨酸化組蛋白（H3 citrullination，H3cit）等組成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［4］。此過程不同于凋亡和壞死的死亡方式，被稱為“NETosis”。且根據(jù)是否導(dǎo)致中性粒細(xì)胞死亡分為可溶性NET和非可溶性NET兩種，又稱為氧化依賴性和非氧化依賴性。

可溶性NET是中性粒細(xì)胞在PMA［3］刺激下，結(jié)合PKC和RAF-MEK-MARK信號(hào)通路，使NADPH酶激活釋放氧自由基（ROS），從而激活肽基精氨酸脫亞胺酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）使組蛋白上精氨酸正電消失，并轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，導(dǎo)致DNA和組蛋白間電荷破壞，染色質(zhì)解體。解體的染色質(zhì)和顆粒蛋白釋放到細(xì)胞外空間形成NET，其中，ROS產(chǎn)生是NET形成的關(guān)鍵。在可溶性NET形成后，由于染色質(zhì)的解體，中性粒細(xì)胞喪失吞噬和趨化作用。非可溶性NET是細(xì)菌［5］、Toll樣受體2（TLR2）［6］刺激中性粒細(xì)胞，激活PAD4，使NE易位進(jìn)入細(xì)胞核，細(xì)胞核中的染色質(zhì)通過囊泡形式排出細(xì)胞外形成的。此過程不依賴NADPH酶，且不破壞質(zhì)膜，因此，在非可溶性NET形成過程中中性粒細(xì)胞仍具有吞噬和趨化能力。

1.2 NET形成與肝臟病理機(jī)制 NET在肝臟中通過Kupffer細(xì)胞和中性粒細(xì)胞清除血源性細(xì)菌，發(fā)揮先天自身免疫的關(guān)鍵任務(wù)。其中，Kupffer細(xì)胞具有免疫球蛋白超家族補(bǔ)體受體（CRIg），可識(shí)別補(bǔ)體C3調(diào)理顆粒、外源性抗原及病原體，捕獲及吞噬病原體［7］。另外，Kupffer細(xì)胞可通過招募血小板，使Kupffer細(xì)胞表面血管性血友病因子（vWF）與血小板糖蛋白（GPIb）相結(jié)合，導(dǎo)致血小板聚集，促進(jìn)細(xì)菌的清除（圖1）。其機(jī)制尚未清楚，可能原因是Kupffer細(xì)胞激活內(nèi)皮細(xì)胞Toll樣受體4（TLR4），使得中性粒細(xì)胞黏附于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，包圍感染的Kupffer細(xì)胞，從而阻止病原體通過血液傳播。研究表明，黏附的中性粒細(xì)胞能與整合素介導(dǎo)的血小板相結(jié)合觸發(fā)NET釋放，通過中性粒細(xì)胞-血小板-NET軸刺激顆粒蛋白，其中組蛋白激活凝血酶［8］，使其進(jìn)而形成纖維蛋白原，導(dǎo)致肝竇內(nèi)微血管血栓的形成（圖1）。凝血酶的產(chǎn)生不僅導(dǎo)致纖維蛋白原凝塊的形成，還可通過蛋白酶激活受體增強(qiáng)血小板的活性。NE和MPO又通過蛋白酶激活受體激活血小板，釋放NET。綜上所述，NET在肝臟中形成過程是一種循環(huán)，即肝臟中性粒細(xì)胞-血小板-NET軸，血小板誘導(dǎo)NET形成，NET自身蛋白顆粒又激活血小板，此循環(huán)既有利于致病菌的清除，又加重了炎癥的進(jìn)展，促進(jìn)凝血和組織損傷。

圖1 NET形成與肝臟病理機(jī)制Figure 1 NET formation and hepatic pathology

2 NET與肝臟疾病的聯(lián)系

肝臟是殺死致病菌，發(fā)揮免疫防御的重要器官。NET被報(bào)道參與一系列疾病的發(fā)生發(fā)展，如自身免疫性疾病、血液性疾病、癌癥等。現(xiàn)有研究表明，NET也在肝臟疾病中扮演著重要的角色。

2.1 HBV感染 慢性HBV感染與肝纖維化、肝硬化及肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。越來越多的研究表明，HBV感染與NET間存在一定聯(lián)系。當(dāng)機(jī)體感染HBV時(shí)，中性粒細(xì)胞功能降低，ROS的產(chǎn)生出現(xiàn)障礙，進(jìn)而抑制NET形成。Hu等［9］研究表明，HBV C蛋白或HBV E蛋白通過減少ROS的產(chǎn)生和自噬來抑制NET釋放，其中自噬機(jī)制是纖維蛋白原樣蛋白2（Fgl2）與粘脂蛋白3（Mccoln3）直接結(jié)合，調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流啟動(dòng)自噬，引發(fā)Fgl2-Mccoln3-自噬軸，從而觸發(fā)NET的形成，加重病毒性肝炎的肝損傷［10］（圖2）。另外，對(duì)HBV感染小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，NET形成區(qū)域有大量的纖維蛋白沉積。這意味著NET與血栓可能存在關(guān)聯(lián)，可能是由于Fgl2將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，促進(jìn)纖維蛋白沉積，其具體機(jī)制值得進(jìn)一步研究。綜上所述，在HBV感染時(shí)，NET不僅能捕獲病毒，還能引起纖維蛋白的沉積和血栓的形成，也可加重病毒性肝炎的肝損傷。

圖2 NET與肝臟疾病的聯(lián)系Figure 2 The association of NET with liver disease

2.2 NASH NASH是最常見的肝病之一，可由肝纖維化發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌（HCC）［11］。研究發(fā)現(xiàn)，NET中的標(biāo)志蛋白MPO和NE在NASH的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。Puli等［12］通過NE基因敲除的小鼠和野生型小鼠建立NASH模型，發(fā)現(xiàn)野生型NASH小鼠肝組織中NE表達(dá)增加，且NASH患者血清標(biāo)志物MPO-DNA水平升高，抑制MPO能顯著降低肝星狀細(xì)胞的激活，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)展和肝細(xì)胞損傷。Xu等［13］發(fā)現(xiàn)丹參酮（TⅡA）能夠抑制MPO和H3cit，進(jìn)而抑制NET釋放，同時(shí)也證明TⅡA能夠改善NASH小鼠的肝脂肪變性，降低血清中肝功能障礙標(biāo)志物的表達(dá)水平。其次，多種細(xì)胞因子也可作用于NET與NASH，如IL-6和TNF-α促炎因子，刺激NASH患者NET的形成，且增強(qiáng)NASH促凝血活性［14］。另外，Wang等［15］通過小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，NET可通過促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）分化，促進(jìn)NASH脂肪變性，導(dǎo)致肝臟腫瘤的發(fā)生和發(fā)展（圖2），抑制NET可降低NASH肝臟中Treg活性及腫瘤的發(fā)生。

2.3 肝缺血再灌注損傷 缺血再灌注損傷是先天免疫性的無菌炎癥反應(yīng)，常發(fā)生于肝移植術(shù)后和肝切除術(shù)后。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞作為肝缺血再灌注損傷的主要驅(qū)動(dòng)力，缺血后釋放ROS，促進(jìn)NET形成，進(jìn)而加重肝損傷［16］。如高遷移率族蛋白1（nuclear factor high mobility group box 1，HMGB1）通過TLR4誘導(dǎo)染色體解聚，形成NET發(fā)揮促炎作用［17］，而羥氯喹通過阻斷TLR9抑制PAD4的表達(dá)來抑制NET形成［16］，保護(hù)肝缺血再灌注損傷。除這些化學(xué)物質(zhì)外，一些炎性因子也會(huì)導(dǎo)致肝缺血再灌注損傷加劇，研究人員［18］通過計(jì)算機(jī)動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)肝缺血再灌注損傷后，IL-17A促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和NET形成，加重肝損傷。在富含組氨酸糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，HRG小鼠存在嚴(yán)重肝損傷且伴有中性粒細(xì)胞和NET形成增加，通過HRG預(yù)處理后可抑制中性粒細(xì)胞和NET形成，減輕小鼠缺血再灌注損傷［19］。另外，黃姜素也可通過抑制MEK/ERK信號(hào)通路來減輕肝缺血再灌注損傷［20］。此外，研究［21］發(fā)現(xiàn)苯甲酸酰肼、西維來司等化學(xué)物質(zhì)也可通過抑制NET的形成減輕缺血再灌注損傷（表1）。綜上所述，抑制NET的釋放可減輕肝缺血再灌注損傷，這為肝移植術(shù)后和肝切除術(shù)后的缺血再灌注損傷提供了治療策略。

表1 影響肝缺血再灌注損傷的因素Table 1 Factors that influence hepatic ischemia and reperfusion injury

2.4 NET與肝癌 HCC是我國(guó)發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤，超過90%的HCC發(fā)生于HBV、NASH等代謝性疾病和缺血再灌注損傷引起的肝損傷［23］。研究［24］表明，腫瘤細(xì)胞通過釋放趨化因子、蛋白酶及活化的血小板觸發(fā)腫瘤微環(huán)境，將中性粒細(xì)胞招募至腫瘤微環(huán)境形成腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞釋放NET。相反，NET釋放的NE、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、組織蛋白酶G（CG）也可刺激癌細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移（圖2）。隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)NET能促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，主要表現(xiàn)為血管生成增加、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞捕獲。研究［25］發(fā)現(xiàn)，NET血漿標(biāo)志物在肝硬化中升高，與肝硬化和/或HCC患者的肝功能障礙程度相關(guān)。Kaltenmeier等［26］和Wang等［27］通過對(duì)肝臟惡性腫瘤患者的血清和組織進(jìn)行回顧性分析證明，NET能促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，通過阻斷CXCL2可減弱中性粒細(xì)胞向腫瘤的募集和NET的形成，并抑制HCC進(jìn)展，同時(shí)該研究表明NET血清標(biāo)志物可作為術(shù)前判斷HCC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。Guan等［28］研究發(fā)現(xiàn)NET可捕獲HCC細(xì)胞，被捕獲的HCC細(xì)胞通過中和Toll樣受體TLR4/9-CCOX2信號(hào)傳導(dǎo)，激發(fā)肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，若抑制TLR4/9-CCOX2信號(hào)傳導(dǎo)或DNaseⅠ直接破壞NET，就可減少小鼠模型HCC的轉(zhuǎn)移。Yang等［29］研究發(fā)現(xiàn)，HCC能夠刺激富含氧化線粒體DNA的NET，從而促進(jìn)HCC的轉(zhuǎn)移。綜上所述，NET在HCC中發(fā)揮了重要作用，干預(yù)腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞抑制NET形成可成為肝癌治療的新靶標(biāo)［30］。

3 小結(jié)

近年來，國(guó)內(nèi)外研究表明，NET除發(fā)揮免疫防御作用外，還從多方面參與肝臟疾病的病理生理過程，其關(guān)鍵成分MPO、H3cit等蛋白對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展都起著關(guān)鍵作用。本文總結(jié)了NET在乙型肝炎、NASH、缺血再灌注損傷等多種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。雖然NET在肝臟疾病中的具體作用機(jī)制研究尚處于起步階段，但已有的研究［31］結(jié)果表明，DNase Ⅰ或PAD4抑制劑通過抑制NET形成，可減少多種原因所致肝損傷及肝癌的發(fā)展，使用此類抑制劑可減少中性粒細(xì)胞向腫瘤的募集。但目前NET在肝臟疾病中的研究尚處于初級(jí)階段，未來深入研究NET對(duì)肝臟疾病的影響及機(jī)制，以期為肝臟疾病治療和預(yù)后的早期識(shí)別提供新的思路。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：仁增卓嘎負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，收集文獻(xiàn)，撰寫論文；楊康潔參與圖片制作；王志鑫參與論文修改；蘆永良、王海久等負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。