崔 睿 左 婷 張鳳婷 王祎婷

（云南國(guó)土資源職業(yè)學(xué)院 云南昆明 652501）

云黃連，學(xué)名云南黃連，又稱(chēng)云連，為毛莨科黃連屬多年生草本植物[1-2]，是中藥材黃連的原植物之一。黃連具有清熱燥濕、祛火解毒等功效，為常用中藥材，以黃連為原料的中成藥品種已有100 多種。云黃連因其主要藥用有效成分小檗堿含量顯著高于其他黃連，為黃連屬植物中最高，極為珍貴。其市場(chǎng)價(jià)格比其他黃連高出2～3 倍，為我國(guó)名貴中藥材。

云黃連屬于東喜馬拉雅植物分區(qū)的特有植物，主要分布在怒江、獨(dú)龍江流域的高黎貢山、碧羅雪山、擔(dān)當(dāng)力卡山，所在緯度為24° N—36°30′ N，海拔2 500～3 400 m[3]，是典型的低緯高山植物。云黃連為云南省道地藥材，多生長(zhǎng)于樹(shù)腳枯枝落葉堆、濕潤(rùn)的陡坡或是布滿苔蘚的石縫中。

目前學(xué)者對(duì)云黃連的研究集中在其主要藥用成分和栽培方面，對(duì)于交配系統(tǒng)研究較少[4]。其中，張霽等研究了不同海拔（2 100～2 700 m）下，野生和人工栽培云黃連的生物量、主要有效成分含量及產(chǎn)量，結(jié)果表明野生云黃連根莖和根生物量沿海拔梯度呈上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異[5]；和杏妞和喬玉文等對(duì)云黃連栽培技術(shù)進(jìn)行了研究，主要包括選地整地、播種和育苗移栽、田間防病蟲(chóng)害、采收時(shí)期和后期加工等方面[6-7]；楊艷娟等對(duì)云黃連花部特征、花粉活力和柱頭可授性及繁育系統(tǒng)進(jìn)行研究，結(jié)果表明云黃連花序?yàn)槎嗥缇蹅阈?，花兩性，外有紫紅色苞片，萼片為黃綠色，花粉活力和柱頭可授性均隨著時(shí)間的變化先上升后下降[8-9]?；诖耍疚膶?duì)云黃連的交配系統(tǒng)展開(kāi)驗(yàn)證。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2022 年1 月在云南省怒江州貢山縣云黃連基地進(jìn)行。該地地處海拔2 650 m，植被為常綠闊葉林，全年日照，年平均降水量在2 000 mm 以上，年平均氣溫17 ℃，為顯著低緯高山氣候環(huán)境。

2 試驗(yàn)方法

2.1 雜交指數(shù)估算

研究采用Dafni[10]的標(biāo)準(zhǔn)，在試驗(yàn)地隨機(jī)選取云黃連小花20 朵，對(duì)其小花直徑和開(kāi)花狀態(tài)進(jìn)行測(cè)量。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）當(dāng)小花直徑小于1.0 mm時(shí)，記為0，1.0～2.0 mm 記為1，2.1～6.0 mm 記為2，大于6.0 mm 記為3；（2）柱頭具有可授性與花藥開(kāi)裂散粉是否同時(shí)，同步成熟或柱頭具有可授性時(shí)花藥未開(kāi)裂記為0，花藥先開(kāi)裂散粉記為1；（3）雌蕊與雄蕊的空間位置，同一高度記為0，高度不同時(shí)記為1。雜交指數(shù)（OCI）值為上述3 項(xiàng)結(jié)果之和。當(dāng)OCI=0 時(shí)，繁育系統(tǒng)屬于閉花受精型；當(dāng)OCI=1 時(shí)，屬于專(zhuān)性自交型；當(dāng)OCI=2 時(shí)，屬于兼性自交型，存在異交能力；當(dāng)OCI=3 時(shí)，屬于兼性異交型，自交親和，可能需要傳粉者；當(dāng)OCI≥4 時(shí)，屬于異交型，存在無(wú)融合生殖，但需要傳粉者。

2.2 花粉-胚珠比估算

選取花藥未開(kāi)裂的盛花期花朵，隨機(jī)選取雌蕊長(zhǎng)花型和雄蕊長(zhǎng)花型2 種花型的花朵各10 朵，用FAA固定液固定，分別做好標(biāo)記帶回實(shí)驗(yàn)室。將固定液中的小花依次取出，將花藥用1.0 mol/L HCl 軟化花粉壁，解剖花藥后將花粉分別移入1.5 mL 的離心管中，用蒸餾水定容。在60 ℃水浴鍋中水解15 min，充分震蕩后搖勻，移取2 μL 花粉液于凹面載玻片上，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)，重復(fù)4 次，計(jì)算單花花粉粒數(shù)。而后將雌蕊置于載玻片上，用解剖針小心挑破子房壁，觀察并統(tǒng)計(jì)單花胚珠數(shù)。小花花粉粒數(shù)與胚珠數(shù)之比即為花粉-胚珠比（P/O）。按照Cruden[11]的方法對(duì)P/O進(jìn)行判斷，P/O為2.7～5.4，繁育系統(tǒng)為閉花受精；P/O為18.1～39.0，繁育系統(tǒng)為專(zhuān)性自交；P/O為 31.9～396.0，繁育系統(tǒng)為兼性自交；P/O為244.7～2 588.0，繁育系統(tǒng)為兼性異交；P/O為2 108.0～195 525.0，繁育系統(tǒng)為專(zhuān)性異交。P/O值的降低意味著近交程度的升高，P/O值的升高意味著遠(yuǎn)交程度的上升。

2.3 人工套袋傳粉試驗(yàn)

按照Dafni 描述的方法開(kāi)展傳粉試驗(yàn)：（1）判斷自然條件下的傳粉情況。對(duì)照組（CK）不作任何處理，使其保持自然狀態(tài)。（2）判斷其是否需要傳粉者。自發(fā)的自花傳粉，開(kāi)花前套硫酸紙袋，不另作其他處理。（3）判斷自交是否親和。同株異花傳粉，開(kāi)花前去除雄蕊，在同株異花間進(jìn)行人工傳粉，而后套硫酸紙袋。（4）判斷雜交是否親和。人工異株異花傳粉，開(kāi)花前去除雄蕊后采用其他植株的花粉進(jìn)行傳粉，而后套硫酸紙袋。（5）檢測(cè)孤雌生殖情況。去除雄蕊后套硫酸紙袋，不另作其他處理。（6）判斷結(jié)子情況是否受傳粉者影響。風(fēng)媒的異花傳粉，去除雄蕊后套網(wǎng)袋（能通風(fēng)通花粉），隔離昆蟲(chóng)。（7）檢測(cè)異花花粉對(duì)結(jié)子的影響。自然條件下異花傳粉行為，去除雄蕊后不另作其他處理，使其自由傳粉。在花藥散粉之前進(jìn)行去雄工作，人工授粉時(shí)將其他花朵取下，然后直接將其花藥對(duì)準(zhǔn)待授粉花朵的柱頭，使其充分授粉。在果實(shí)完全成熟后，采集種子，然后進(jìn)行結(jié)實(shí)率的統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 雜交指數(shù)估算

測(cè)量結(jié)果顯示，云黃連小花朵直徑為 8.9～18.1 mm，依據(jù)Dafni 的標(biāo)準(zhǔn)，其花朵直徑大于6 mm，記數(shù)為3；部分云黃連小花雌蕊先成熟，部分雄蕊先成熟，故記為0 或1；雌蕊與雄蕊在空間上分離，記為1。云黃連的OCI 值為4 或5，根據(jù)Dafni 的標(biāo)準(zhǔn)，OCI 值與自交率呈反比，OCI 值越大，其異交程度越高，由此判斷云黃連的繁育系統(tǒng)屬于異交型，存在無(wú)融合生殖，但需要傳粉者。

3.2 花粉-胚珠比估算

由試驗(yàn)得出，云黃連中雄蕊長(zhǎng)的單花花粉粒數(shù)為708 750～1 086 250 粒，平均925 745 粒；單花胚珠數(shù)為76～103 枚，平均91 枚；花粉-胚珠比為10 173。雌蕊長(zhǎng)的單花花粉粒數(shù)為736 250～967 500 粒，平均844 167 粒；單花胚珠數(shù)為78～124 枚，平均97 枚；花粉-胚珠比為8 702，結(jié)果如表1 所示。根據(jù)Cruden的標(biāo)準(zhǔn)，可以得出結(jié)論：2 種花型的云黃連的繁育系統(tǒng)都是專(zhuān)性異交。此外，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，雄蕊長(zhǎng)花型云黃連的花粉-胚珠比極顯著大于雌蕊長(zhǎng)花型（P＜0.01），說(shuō)明雄蕊長(zhǎng)花型遠(yuǎn)交程度更高。

表1 云黃連花粉-胚珠比

3.3 套袋傳粉試驗(yàn)驗(yàn)證云黃連交配系統(tǒng)

采用人工授粉及套袋試驗(yàn)驗(yàn)證云黃連的交配系統(tǒng)，結(jié)果如表2 所示。自然條件下云黃連的結(jié)實(shí)率為89.47%，去除雄蕊套硫酸紙袋的結(jié)實(shí)率為48.94%，說(shuō)明云黃連存在孤雌生殖情況，且孤雌生殖比例較高。不去除雄蕊套硫酸紙袋處理，隔絕蟲(chóng)媒與風(fēng)媒的自發(fā)自花傳粉結(jié)實(shí)率為59.26%，稍高于孤雌生殖的結(jié)實(shí)率，而同株異花人工傳粉結(jié)實(shí)率卻高達(dá)83.33%，表明云黃連自交親和，但需要傳粉者，幾乎不存在自發(fā)的自花傳粉。在自然界中，昆蟲(chóng)在同一植株上的訪問(wèn)存在連續(xù)性，因此同株異花傳粉所引起的自交也有可能出現(xiàn)。人工異株異花傳粉結(jié)實(shí)率為86.49%，這說(shuō)明云黃連為異花授粉植物。去除雄蕊套網(wǎng)袋處理的結(jié)實(shí)率為47.17%，與去除雄蕊套硫酸紙袋產(chǎn)生的48.94%無(wú)融合生殖比例相近，去除雄蕊不套袋處理結(jié)實(shí)率高達(dá)88.89%，印證了云黃連不存在風(fēng)媒傳粉，依靠昆蟲(chóng)來(lái)進(jìn)行傳粉才能確保其較高的結(jié)實(shí)率。傳粉實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)云黃連交配系統(tǒng)為異交型，自交親和，需要傳粉者，其傳粉媒介為蟲(chóng)媒。

表2 云黃連不同傳粉處理的結(jié)實(shí)率

4 討論

高山區(qū)域由于其惡劣的環(huán)境條件，被認(rèn)為是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最為極端的生境之一[12-13]。長(zhǎng)期以來(lái)，高山被認(rèn)為是研究生物適應(yīng)進(jìn)化機(jī)制最理想的場(chǎng)所之一。植物繁育系統(tǒng)的研究是研究進(jìn)化生物學(xué)中的重要部分[14]。

隨著海拔的升高，傳粉昆蟲(chóng)的種類(lèi)、數(shù)量和活動(dòng)能力明顯下降[15]。傳粉限制是高山異交植物所面臨的普遍問(wèn)題，且隨著海拔升高限制越嚴(yán)重。經(jīng)雜交指數(shù)估算、花粉-胚珠比估算和人工套袋傳粉試驗(yàn)驗(yàn)證可知，云黃連交配系統(tǒng)為異交型，自交親和，需要蟲(chóng)媒傳粉，具有較高的孤雌生殖能力。

5 結(jié)語(yǔ)

云黃連由于生長(zhǎng)環(huán)境日益惡劣等原因，野生資源日益減少，因此開(kāi)展云黃連交配系統(tǒng)研究，了解其繁殖特性和遺傳多樣性，能夠?yàn)楸Ｗo(hù)野生資源和促進(jìn)人工栽培及引種馴化提供科學(xué)依據(jù)，還可以為中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和野生資源的保護(hù)提供有力支持。