任曉曉 楊萬軍 卿 卓 葉占峰 羅朝斌

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所 貴州貴陽 550006）

植物次生代謝產(chǎn)物具有多種藥理活性和重要的生物功能[1]，其中木脂素類化學(xué)成分被證明具有保護(hù)肝臟、保護(hù)神經(jīng)、抗病毒、抗炎癥和抗氧化等良好的生物活性[2-4]。前人研究證明，桑葉含有木脂素類化合物，可以作為提取天然木脂素的原料，但由于直接從桑樹中提取活性物質(zhì)比較容易受到季節(jié)、氣候和地理因素的影響，且直接從植物中提取次生代謝物質(zhì)其產(chǎn)量有限，不能滿足需求[5]。因此，需要尋找其他適宜植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的途徑。家蠶以桑葉為食，食桑后桑葉中的次生代謝物質(zhì)會在家蠶體內(nèi)富集及轉(zhuǎn)化，因此可以探索以家蠶作為生物反應(yīng)器，用于生產(chǎn)植物次生代謝物質(zhì)。為探明家蠶蠶繭中木脂素類化合物成分及含量，本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS/MS）對7 個家蠶品種的5 種不同顏色的蠶繭進(jìn)行分析，以期為開拓天然木脂素類化合物生產(chǎn)途徑提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用家蠶共有7 個品種，分別為白色繭品種2 個（編號為HY、FR）、黃色繭品種2 個（編號為202、RCA）、粉色繭品種1 個（編號為CD）、紅色繭品種1 個（編號為CH）、綠色繭品種1 個（編號為CL）。供試家蠶飼養(yǎng)于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所遵義基地，不同繭色品種在同室同條件下使用良桑飼喂，飼養(yǎng)至上蔟結(jié)繭第7 d。每個品種采集蠶繭個體混合樣5 g 備用，每個品種設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 樣品進(jìn)樣前處理

樣品經(jīng)過真空冷凍干燥后使用研磨儀研磨至粉末狀備用。準(zhǔn)確稱取100 mg 樣品粉末，使用1.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液充分溶解。將溶解后的樣品存放于4 ℃冰箱過夜，期間渦旋3 次以提高提取率。過夜后的樣品在12 000 r/min 的條件下離心10 min，吸取上清液，使用微孔濾膜（孔徑為0.22 μm）過濾，保存于進(jìn)樣瓶中備用。

1.3 UPLC-MS/MS 分析

使用超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem Mass Spectrometry, MS/MS）對待測樣品進(jìn)行檢測。超高效液相色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm。在流動相中，水相為超純水，有機(jī)相為乙腈。洗脫梯度為0 min，V（水）∶V（乙腈）=95∶5；11.0 min，V（水）∶V（乙腈）=5∶95；12.0 min，V（水）∶V（乙腈）=5∶95；12.1 min，V（水）∶V（乙腈）=95∶5；15.0 min，V（水）∶V（乙腈）=95∶5。流速為0.4 mL/min。柱溫為40 ℃。進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣25 psi。

基于邁維代謝公司的自建數(shù)據(jù)庫及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，對質(zhì)譜檢測的一級譜和二級譜進(jìn)行定性分析。采用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring, MRM）對代謝物進(jìn)行定量分析。

1.4 樣本質(zhì)控分析

將不同顏色蠶繭等量混合制成質(zhì)控樣本，在儀器分析的過程中，每10 個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，以檢測分析過程的重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 木脂素類化合物鑒定

經(jīng)鑒定，7 個供試品種中均檢測到10 種木脂素類化合物，分別為松脂醇（C20H22O6）、杜仲樹脂酚（C21H24O7）、鵝掌楸樹脂醇A（C22H26O8）、松脂醇單葡萄糖苷（C26H32O11）、牛蒡子苷（C27H34O11）、5'-甲氧基羅漢松脂苷（C27H34O12）、丁香樹脂酚-己糖（C28H36O13）、松脂醇二葡萄糖苷（C32H42O16）、橄欖脂素二葡萄糖苷（C32H44O17）、中脂素二葡萄糖苷（C33H44O17）。木脂素類化合物種類在不同繭色、不同蠶品種之間并無差別，推測其原因在于家蠶合成木脂素類化合物的原料源于桑葉。本試驗中供試家蠶飼喂的桑葉一致，木脂素類化合物的合成代謝途徑與蠶繭繭色和蠶品種無密切關(guān)系。

2.2 不同繭色蠶繭間木脂素類化合物含量分析

對7 個供試品種蠶繭樣本鑒定出的木脂素類化合物進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，不同繭色的蠶繭中10 種木脂素類化合物的含量差別較大。如表1 所示，在黃色繭中，含量最高的是松脂醇單葡萄糖苷，丁香樹脂酚-己糖含量次之；在紅色繭中，松脂醇含量最高，達(dá)到30 mg/g，然后依次是松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷和丁香樹脂酚-己糖；在綠色繭中，松脂醇含量最高，為29.40 mg/g，其余9 種化合物的含量均較低；在白色繭中，含量最高的是丁香樹脂酚-己糖，其次是松脂醇單葡萄糖苷；在粉色繭中，除松脂醇外，其余9 種木脂素類化合物的含量均較低。杜仲樹脂酚、牛蒡子苷、橄欖脂素二葡萄糖苷和中脂素二葡萄糖苷在不同繭色的蠶繭中含量均較低。

表1 不同天然彩色繭的木脂素類化合物含量 單位：mg/g

2.3 同繭色不同品種間木脂素類化合物含量分析

由表1 可知，在黃色繭品種中，RCA 含有的松脂醇二葡萄糖苷的含量約為202 的3.45 倍，其余9種化合物的含量在兩者之間差別較小。在白色繭品種中，HY 和FR 中含量較高的化合物種類一致，但HY 中松脂醇單葡萄糖苷、5'-甲氧基羅漢松脂苷和丁香樹脂酚-己糖的含量分別是FR 中的3.20、2.66和1.96 倍。

2.4 同一品種內(nèi)木脂素類化合物含量分析

對黃色繭和白色繭同品種不同樣本之間的木脂素類化合物含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表2 和表3 所示。由結(jié)果可以看出，在同品種不同樣本之間，多種化合物的含量差別較大。例如，在RCA品種中，樣本1 杜仲樹脂酚的含量是樣本2 和樣本3 的2～3 倍；在FR 品種中，樣本2 松脂醇單葡萄糖苷的含量約是樣本1的1.96倍。蠶繭中的木脂素類化合物來源于家蠶食用桑葉后對其中的物質(zhì)加工后合成，同一品種不同的樣本中木脂素類化合物含量有差異，說明家蠶個體對桑葉的吸收利用及合成木脂素類化合物的能力有差別。

表2 黃色繭的木脂素類化合物含量 單位：mg/g

表3 白色繭的木脂素類化合物含量 單位：mg/g

3 結(jié)論與討論

本試驗通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對白色繭、黃色繭、粉紅繭、紅色繭、綠色繭含有的木脂素類化合物進(jìn)行了定性和定量檢測，結(jié)果顯示在本批次蠶繭中，共檢測出10 種木脂素類化合物。同時發(fā)現(xiàn)，不同繭色蠶繭含有的木脂素類化合物種類并沒有差別，但每種化合物的含量不同：黃色繭的松脂醇單葡萄糖苷和丁香樹脂酚-己糖含量較高；紅色繭和綠色繭的松脂醇含量較高；白色繭的丁香樹脂酚-己糖含量較高；粉色繭的10 種木脂素類化合物的含量均較低。同繭色不同品種間，含量最高的木脂素類化合物種類一致，但部分種類化合物含量有明顯差異。此外，同一家蠶品種所產(chǎn)蠶繭各樣本間的木脂素類化合物含量差別也較大。

分析認(rèn)為，家蠶食下桑葉后，桑葉中的次生代謝物質(zhì)在家蠶體內(nèi)的積累和轉(zhuǎn)化是一個非常復(fù)雜的過程，除與品種特性有關(guān)外，還與個體消化、吸收、合成及累積能力密切相關(guān)[6]。此外，食桑量、環(huán)境溫濕度等因素對于桑葉次生代謝物質(zhì)在蠶體內(nèi)的轉(zhuǎn)化也有重要影響。木脂素類化合物在家蠶體內(nèi)的合成和富集途徑還未明確，這將是本課題下一步的研究內(nèi)容。