余景滔 姜 麗 方小川 盧子濱 余林中 陳育堯 曹惠慧 區(qū)錦瑩 劉俊珊

（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515）

中藥藥理學(xué)是以傳統(tǒng)中藥學(xué)與現(xiàn)代藥理學(xué)為主體的實(shí)踐性新興交叉學(xué)科。實(shí)驗(yàn)是本學(xué)科的基礎(chǔ)，通過實(shí)驗(yàn)教學(xué)可強(qiáng)化學(xué)生對中藥藥理學(xué)科研思維及技能的掌握，提高教學(xué)質(zhì)量［1］。教育部明確指出，實(shí)踐育人特別是實(shí)踐教學(xué)依然是高校人才培養(yǎng)中的薄弱環(huán)節(jié)，與培養(yǎng)拔尖創(chuàng)新人才的要求還有差距。因此切實(shí)開展中藥藥理實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革是非常必要的。貫通性實(shí)驗(yàn)教學(xué)注重內(nèi)容的連貫性，強(qiáng)調(diào)知識(shí)間的相互聯(lián)系與交叉，可以促進(jìn)學(xué)科知識(shí)融合，加深學(xué)生對課程理論的理解，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量。然而迄今國內(nèi)尚未有完善的中藥藥理學(xué)貫通性實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案，因此文章聚焦于貫通性實(shí)驗(yàn)，結(jié)合現(xiàn)有教學(xué)基礎(chǔ)條件及中藥藥理學(xué)教學(xué)團(tuán)隊(duì)的教學(xué)改革實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革。

涼膈散（LGS）為中醫(yī)溫病經(jīng)典名方，首載于《太平惠民和劑局方》，由連翹、梔子、黃芩、甘草、薄荷、大黃、芒硝7 味藥組成，具有瀉火解毒、清上泄下的功效，主治中上二焦火熱證。除芒硝外，涼膈散中其余藥物均有抗氧化作用［2-7］，其中的大黃、芒硝為瀉下藥，具有瀉下通便作用，能改善腸運(yùn)動(dòng)［8，9］。本課題組研究結(jié)果［10，11］表明，涼膈散具有抗炎作用。此外，現(xiàn)代藥理研究［12-14］表明，涼膈散中部分中藥如梔子、黃芩、甘草及大黃，均具有鎮(zhèn)痛作用。因此本研究以涼膈散為核心，建立抗氧化、組織平滑肌運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)、泄下、抗炎和鎮(zhèn)痛的貫通性實(shí)驗(yàn)方案，系統(tǒng)地從細(xì)胞分子-器官-動(dòng)物等不同層次對涼膈散進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)，探究其不同的藥理作用，從而進(jìn)一步加深學(xué)生對中藥藥理學(xué)課程的理解。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器HW-400S 型恒溫平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司）；PCLAB-UE型生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)（北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；Thermo 酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；JA3003N型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；N-1200B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；DGX-9243BC-1型冷凍干燥器（中國上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 藥材與試劑涼膈散所含中藥由廣州康美藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院張宏偉副教授鑒定；磷酸鈉鹽口服溶液（今辰清）［上海海虹實(shí)業(yè)（集團(tuán)）巢湖今辰藥業(yè)有限公司］。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明種（KM）雌性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心。

2 方法

2.1 涼膈散的制備依據(jù)文獻(xiàn)［15］煎煮方法，將涼膈散生藥制備成濃度為1 mg/mL的藥液。

2.2 涼膈散抗氧化實(shí)驗(yàn)將50 μL 不同濃度凉膈散或50 μL 維生素C（Vitmin C，10 mg/mL）與150 μL DPPH溶液（0.2 mmol/L）混合，加入96 孔板中。共分為4 組，凉膈散組、維生素C 組、凉膈散空白組及維生素C 空白組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。室溫下反應(yīng)20 min，波長517 nm測量吸光度值，計(jì)算清除率。清除率=［1-（樣本OD值-空白OD值）/對照OD值］×100%。

2.3 涼膈散對小腸離體平滑肌的影響平滑肌槽中臺(tái)式液預(yù)溫至38 ℃；剪取小鼠1.5～2.0 cm離體空腸，線鉤勾住腸管兩端，調(diào)整前負(fù)荷約2 g，基線調(diào)零，穩(wěn)定后記錄正常收縮曲線。給藥乙酰膽堿（10 μg/mL）、阿托品（50 μg/mL）、凉膈散（100 mg/mL），分別采集數(shù)據(jù)，計(jì)算給藥的張力增值，比較結(jié)果。張力增值=給藥后張力-給藥前張力。

2.4 涼膈散對小鼠小腸運(yùn)動(dòng)的影響將36 只小鼠隨機(jī)分為6 組，每組6 只，即空白組、凉膈散最高劑量組（40 g/kg）、凉膈散高劑量組（20 g/kg）、凉膈散中劑量組（10 g/kg）、凉膈散低劑量組（5 g/kg）、今辰清（SPOS）組（2.64 g/kg），準(zhǔn)確稱量小鼠體質(zhì)量并記錄。以3%印度墨水為指示劑，與涼膈散藥物混合，依據(jù)小鼠體質(zhì)量，按0.2 mL/10 g 給藥劑量灌胃，給予相應(yīng)藥液。灌胃給藥20 min 后，立即頸椎脫臼處死動(dòng)物，打開腹腔，分離腸系膜，剪下小腸，置于實(shí)驗(yàn)桌報(bào)紙上。拉直小腸，測量總長度（cm）和墨水推進(jìn)距離（cm），計(jì)算墨水推進(jìn)百分率，比較各組結(jié)果。墨水推進(jìn)百分率=（墨水推進(jìn)距離/小腸總長度）×100%。

2.5 涼膈散抗炎鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

2.5.1 抗硫酸銅誘導(dǎo)斑馬魚炎癥實(shí)驗(yàn)斑馬魚養(yǎng)殖于南方醫(yī)科大學(xué)人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選實(shí)驗(yàn)室。隨機(jī)選取受精后3 d 的健康斑馬魚幼魚60 條，分為6 組，每組10條。給藥方式為浸泡給藥，分組如下。

空白組：浸泡在egg water中2 h，不予任何處理。硫酸銅模型組：浸泡在含硫酸銅（20 μmol/L）2 mL 的egg water中2 h。陽性對照組：浸泡在含有硫酸銅（20 μmol/L）2 mL 和地塞米松（DEX，10 μg/mL）的egg water 中2 h。凉膈散組：浸泡在含有硫酸銅（20 μmol/L）2 mL 和凉膈散藥液高、中、低濃度（300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL）的egg water中2 h。

2 h 后，用0.02%三卡因麻醉斑馬魚并置于瓊脂板上固定，在熒光顯微鏡下觀察魚腹主動(dòng)脈處中性粒細(xì)胞的數(shù)量并拍照。

2.5.2 小鼠熱板實(shí)驗(yàn)取小鼠120 只，隨機(jī)分為6 組，每組20 只，即空白組、凉膈散最高劑量組（40 g/kg）、凉膈散高劑量組（20 g/kg）、凉膈散中劑量組（10 g/kg）、凉膈散低劑量組（5 g/kg）、扶他林組（0.5 g/kg）；準(zhǔn)確稱量小鼠體質(zhì)量并記錄。將熱板鎮(zhèn)痛儀調(diào)節(jié)至55 ℃，加熱后作為熱刺激；記錄小鼠自投入熱板至舔后足的時(shí)間，作為該鼠痛閾值。給藥前，測定每只小鼠痛閾，5 s≤痛閾值≤30 s為合格；灌胃給藥（0.2 mL/10 g）30 min后，再次測定痛閾值并記錄。若給藥后小鼠60 s 內(nèi)無舔后足反應(yīng)，按60 s 記。計(jì)算每只小鼠計(jì)算痛閾提高百分率，比較各組的結(jié)果。痛閾提高百分率（%）=（給藥后痛閾值-給藥前痛閾值）/給藥前痛閾值×100%。

2.5.3 小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)取小鼠120 只，隨機(jī)分為6組，每組20 只，分組給藥與小鼠熱板實(shí)驗(yàn)相同。給藥30 min 后，每只小鼠腹腔注射醋酸（0.1 mL/10 g），觀察并記錄每只小鼠20 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)。

2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 涼膈散具有抗氧化作用凉膈散對DPPH·自由基的清除率隨劑量的增加逐漸提高，當(dāng)其濃度在700 μg/mL以上時(shí)，對DPPH·自由基的清除率為76%，到達(dá)平臺(tái)期。這表明凉膈散可有效清除DPPH·自由基，發(fā)揮抗氧化作用，以藥物濃度700 μg/mL 及以上效果明顯，因此將該濃度用于本科中藥藥理實(shí)驗(yàn)課教學(xué)中。見圖1。

圖1 涼膈散抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 涼膈散對小鼠離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)具有舒張作用鑒于未見涼膈散全方對小鼠腸平滑肌的作用研究，并且基于凉膈散組方中含大黃、芒硝及甘草等組分可發(fā)揮瀉下作用，為探索其對小鼠離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)是否有舒張或收縮作用，作者通過記錄凉膈散、乙酰膽堿及阿托品對小鼠小腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響曲線，并計(jì)算平均張力增值、最大張力增值以及最小張力增值。結(jié)果顯示，乙酰膽堿對小鼠離體腸平滑肌具有收縮作用，凉膈散與阿托品均對小鼠離體腸平滑肌具有舒張作用，且凉膈散松弛作用較阿托品大。見表1。

表1 凉膈散對小鼠離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （± s）

表1 凉膈散對小鼠離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （± s）

注：與乙酰膽堿組比較，1）P＜0.001，2）P＜0.01，3）P＜0.005。

組別凉膈散乙酰膽堿阿托品最小張力增值-0.178±0.1183)0.074±0.015-0.219±0.033鼠數(shù)8 8 8藥液濃度100 mg/mL 10 μg/mL 50 μg/mL給藥量800 μL 100 μL 100 μL平均張力增值-0.208±0.0641）0.451±0.022-0.210±0.0221）最大張力增值-0.121±0.1562）0.648±0.030-0.190±0.1612）

3.3 涼膈散具有瀉下作用基于凉膈散組方中大黃、芒硝等具有瀉下作用的藥材，進(jìn)一步通過小鼠腸道推進(jìn)實(shí)驗(yàn)探究其是否能夠促進(jìn)小鼠腸道運(yùn)動(dòng)。結(jié)果顯示，與空白組相比，凉膈散與陽性藥SPOS 均可提高墨水在小鼠腸道中推進(jìn)的距離，給予凉膈散中劑量10 g/kg、高劑量20 g/kg及最高劑量40 g/kg后，墨水推進(jìn)百分率分別提高至91.8%、92.0%及88.0%，且效果均優(yōu)于陽性藥，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，凉膈散中劑量（10 g/kg）效果較好。見圖2。

圖2 涼膈散對小鼠小腸運(yùn)動(dòng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 涼膈散可減輕炎癥反應(yīng)為建立以凉膈散為核心的貫通式實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系，通過構(gòu)建斑馬魚硫酸銅炎癥模型，對其抗炎作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，與空白組相比，硫酸銅模型組斑馬魚神經(jīng)柱區(qū)域（白色線框內(nèi)）聚集大量中性粒細(xì)胞，表明斑馬魚出現(xiàn)急性炎癥；凉膈散及陽性藥DEX 均可顯著減少中性粒細(xì)胞向中央彌散，且凉膈散的抑制作用隨濃度增大而顯著提高。由此說明，凉膈散可抑制硫酸銅誘導(dǎo)斑馬魚中性粒細(xì)胞遷移，減輕炎癥反應(yīng)，以濃度300 μg/mL效果最明顯。見圖3。

圖3 涼膈散抗硫酸銅誘導(dǎo)斑馬魚炎癥實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5 涼膈散具有鎮(zhèn)痛作用現(xiàn)代藥理研究［14］表明，涼膈散復(fù)方中大黃、黃芩、甘草和梔子具有鎮(zhèn)痛作用。因此，作者運(yùn)用熱板法和醋酸扭體法探索凉膈散全方對小鼠痛閾值是否有提高。結(jié)果顯示，與空白組相比，凉膈散中劑量（10 g/kg）組可減少小鼠的舔足和扭體反應(yīng)次數(shù)，與陽性藥扶他林效果相當(dāng)，其在醋酸扭體動(dòng)物模型上表現(xiàn)出的鎮(zhèn)痛作用更為明顯。見圖4。

圖4 涼膈散鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 貫通性實(shí)驗(yàn)改革的應(yīng)用

上述研究結(jié)果表明，涼膈散能實(shí)現(xiàn)分子-器官-動(dòng)物不同層次的藥理作用，滿足貫通性實(shí)驗(yàn)的要求，故選取凉膈散設(shè)計(jì)貫通性實(shí)驗(yàn)具有合理性和可行性?；诖耍髡哌x取2019 級(jí)中藥學(xué)和中藥制藥2 個(gè)專業(yè)學(xué)生進(jìn)行貫通性實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)踐。收集本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)課結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果與上述設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)一致，表明該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有較好的可重復(fù)性。此外，基于貫通性實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)踐結(jié)果，作者對該教學(xué)模式應(yīng)用于中藥學(xué)和中藥制藥2 個(gè)專業(yè)的實(shí)踐情況進(jìn)行調(diào)查分析，共收集中藥學(xué)和中藥制藥2 個(gè)專業(yè)學(xué)生填寫的有效問卷72 份。學(xué)生認(rèn)為該貫通性實(shí)驗(yàn)具有下述優(yōu)點(diǎn)，即實(shí)驗(yàn)課參與度高，實(shí)驗(yàn)原理及操作掌握程度好；課堂滿意度高，能力提升顯著。學(xué)生對實(shí)驗(yàn)課綜合評(píng)價(jià)高，同行評(píng)教效果優(yōu)異，課程講授評(píng)分成績名列前茅。

5 討論

中藥藥理學(xué)是中醫(yī)藥高等教育中藥學(xué)類專業(yè)的核心課程，也是中醫(yī)學(xué)及中西醫(yī)學(xué)類專業(yè)的基礎(chǔ)課程，對于培養(yǎng)學(xué)生“理論與實(shí)踐”相結(jié)合的能力有重要意義［16］。實(shí)踐教學(xué)在中藥藥理學(xué)的教學(xué)過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用，其方法改革是推動(dòng)實(shí)踐教學(xué)改革和人才培養(yǎng)模式改革的關(guān)鍵。本研究采用經(jīng)典名方?jīng)鲭跎⑻剿鲗?shí)踐教學(xué)方法改革，并充分利用其具有多重功效的優(yōu)勢，設(shè)計(jì)了抗氧化、離體平滑肌運(yùn)動(dòng)、小鼠腸推進(jìn)、抗炎、醋酸扭體法和熱板法等實(shí)驗(yàn)。上述實(shí)驗(yàn)從分子、器官、動(dòng)物不同層次進(jìn)行中藥藥理研究，形成比較完善的貫通式實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系，不僅覆蓋中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中的大部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，還引入了本團(tuán)隊(duì)建立的斑馬魚炎癥模型，實(shí)現(xiàn)了科研和教學(xué)的有機(jī)融合，取得較好的教學(xué)效果。本項(xiàng)目為中醫(yī)藥院校及綜合性院校的中藥學(xué)專業(yè)學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供改革模板及改革思路，具有較高的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。