梁杏花?劉佛球?顏蓉?胡娟

【摘要】目的 探討角蛋白23（KRT23）高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖對(duì)肝癌的影響。方法 通過(guò)生物信息學(xué)分析KRT23在肝癌中的表達(dá)，過(guò)表達(dá)及抑制KRT23后采用噻唑蘭（MTT）、克隆形成實(shí)驗(yàn)分析KRT23對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）及蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)分析KRT23與AKT 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)關(guān)系。結(jié)果 肝癌中KRT23的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組織。MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示KRT23過(guò)表達(dá)后促進(jìn)細(xì)胞增殖，而下調(diào)KRT23后抑制細(xì)胞增殖；通過(guò)基因富集分析（GSEA）， qPCR及蛋白免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KRT23可激活A(yù)KT信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)在過(guò)表達(dá)KRT23細(xì)胞中抑制AKT信號(hào)通路后細(xì)胞增殖能力明顯下調(diào)。結(jié)論 KRT23調(diào)控AKT信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞增殖，提示KRT23在肝癌的惡性進(jìn)程中具有重要的作用，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色。

【關(guān)鍵詞】KRT23；AKT信號(hào)通路；肝癌；增殖

KRT23 promotes the proliferation of liver cancer by activating AKT signaling pathway Liang Xinghua， Liu Foqiu， Yan Rong， Hu Juan. Department of Gastroenterology， the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 511300， China

Corresponding author， Liang Xinhua， E-mail： 122002858@qq.com

【Abstract】Objective To investigate the effect of high keratin 23 （KRT23） expression promoting cell proliferation on liver cancer. Methods The expression of KRT23 in liver cancer was analyzed by bioinformatics. After overexpression and inhibition of KRT23， the effect of KRT23 on the proliferation of liver cancer cells was analyzed by MTT and clone formation assay. The regulatory relationship between KRT23 and AKT signaling pathway was analyzed by software prediction， qPCRand Western blot. Results The expression level of KRT23 in liver cancer was significantly higher than that in normal control tissues. MTT and clone formation assay showed that overexpression of KRT23 promoted cell proliferation， while downregulation of KRT23 inhibited cell proliferation. GSEA analysis， qPCR and Western blot showed that KRT23 could activate the AKT signaling pathway and promote cell proliferation. Meanwhile， inhibition of AKT signaling pathway in overexpressing KRT23 cells significantly reduced cell proliferation. Conclusions KRT23 affects the proliferation of liver cancer cells by regulating the AKT signaling pathway. These results suggest that KRT23 exerts significant effects upon the malignant procession of liver cancer and may play an important role in the occurrence and development of liver cancer.

【Key words】KRT23；AKT signaling pathway；Liver cancer；Proliferation

肝細(xì)胞癌（肝癌，HCC）是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤。肝癌的發(fā)病率在各類(lèi)腫瘤中排名第五，是世界上第六大常見(jiàn)病和第三大癌癥相關(guān)死亡原因［1-2］。肝癌病死率之高主要由于其復(fù)發(fā)率較高，據(jù)報(bào)道肝癌兩年復(fù)發(fā)率為50%，而這種高復(fù)發(fā)率主要是由于腫瘤的增殖能力和耐藥性導(dǎo)致［3］。因此，迫切需要了解影響肝癌進(jìn)展和惡性增殖的潛在機(jī)制。從數(shù)千個(gè)基因中區(qū)分促進(jìn)肝癌惡性進(jìn)程的關(guān)鍵基因?qū)τ谝种七@一過(guò)程是必不可少的，但仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。角蛋白分為Ⅰ型角蛋白（含 KRT9～KRT20）和Ⅱ型角蛋白（含KRT1～KRT8），可作為影響上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的中間絲蛋白［4］。據(jù)報(bào)道角蛋白23 （KRT23）與肝臟疾病密切相關(guān)［5］。KRT23是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）的靶基因，被MYC擴(kuò)增，可能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖并導(dǎo)致肝癌［6］。然而，KRT23在肝癌中對(duì)腫瘤進(jìn)程的影響及具體機(jī)制尚不清楚。本研究旨在觀察KRT23在肝癌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖功能的影響，探討其能否作為肝癌預(yù)防及治療靶點(diǎn)。

材料與方法

一、主要材料

HCCLM3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心；培養(yǎng)基相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Lipo3000? Transfection Reagent試劑購(gòu)自碧云天；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)試劑盒由美國(guó)Promega公司生產(chǎn)；GAPDH抗體、KRT23抗體均由博士德公司生產(chǎn)；LY294002購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qPCR）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均由Takala公司生產(chǎn)。KRT23過(guò)表達(dá)pcDNA3.1質(zhì)粒（KRT23）及空載pcDNA3.1質(zhì)粒，干擾質(zhì)粒及引物，均由廣州艾基生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建；PCR儀器為美國(guó)R&D公司生產(chǎn)；BX43顯微鏡為日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。肝癌組織樣本收集于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科，并獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2023-D-006）。

二、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

HCCLM3細(xì)胞用含10% FBS的1640 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并加入鏈霉素和青霉素預(yù)防污染。觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞融合長(zhǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞處理

將HCCLM3細(xì)胞接種于6孔板，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞分組如下，過(guò)表達(dá)KRT23組（HCCLM3-KRT23）及其過(guò)表達(dá)對(duì)照組（HCCLM3-vector）、干擾KRT23組（HCCLM3-KRT23/RNAi）及其干擾對(duì)照組（HCCLM3-RNAi-vector）。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，換為1640培養(yǎng)基（10% FBS）繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

3. 噻唑蘭（MTT）檢測(cè)細(xì)胞活力

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，將細(xì)胞種植于96孔板，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至2×103個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后向待測(cè)孔中加入5 mg/mL MTT溶液，每孔20 μL；4 h后加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上振蕩10 min，

使結(jié)晶物充分溶解；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm處測(cè)量各孔的吸光度值。

4.克隆形成實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度500細(xì)胞/mL接種于6孔板持續(xù)培養(yǎng)10～14 d，觀察克隆出現(xiàn)日期及生長(zhǎng)情況，大于50個(gè)細(xì)胞的集落算一個(gè)克隆，加固定液，1 mL/孔搖床上放置10 min后，加1 mL/孔結(jié)晶紫染色，計(jì)算每個(gè)孔的克隆數(shù)并拍照。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

采用Trizol法提取HCCLM3細(xì)胞樣本中的總RNA，根據(jù)qPCR 體系說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組樣本中KRT23 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct方法計(jì)算分析各組樣本中KRT23表達(dá)水平。

6.蛋白免疫印跡法

用蛋白裂解液裂解、提取各組HCCLM3細(xì)胞總蛋白，濃度測(cè)定用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度。每組各取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn) PVDF膜、奶粉封閉、一抗KRT23抗體（1∶1 500）和GAPDH抗體（1∶3 000） 孵育、二抗山羊抗兔HRP抗體（1∶3 000） 孵育、ECL 發(fā)光液顯色步驟依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用 Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析癌組織和癌旁組織間的差異。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、KRT23在人類(lèi)肝癌組織高表達(dá)

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)KRT23在肝癌中表達(dá)高于正常對(duì)照（圖1A），在組織樣本中蛋白免疫印跡法檢測(cè)KRT23蛋白表達(dá)高于癌旁對(duì)照組織（圖1B），且qPCR檢測(cè)KRT23 mRNA表達(dá)高于癌旁對(duì)照組織（圖1C），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）。

二、KRT23過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖能力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過(guò)qPCR及蛋白免疫印跡法檢測(cè)KRT23過(guò)表達(dá)組（HCCLM3-KRT23）與載體對(duì)照組（HCCLM3-vector）及KRT23干擾組（HCCLM3-KRT23/RNAi）與其干擾對(duì)照組（HCCLM3-RNAi-vector）中KRT23基因（圖2A）及蛋白（圖2B）表達(dá)情況，經(jīng)過(guò)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HCCLM3細(xì)胞中KRT23過(guò)表達(dá)組中細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于過(guò)表達(dá)對(duì)照組，而KRT23干擾后細(xì)胞增殖能力弱于干擾對(duì)照組（圖2C）；通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KRT23過(guò)表達(dá)組中細(xì)胞克隆形成能力強(qiáng)于過(guò)表達(dá)對(duì)照組，而KRT23干擾后細(xì)胞克隆形成能力低于干擾對(duì)照組（圖2D），2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0. 05）。

三、KRT23通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖

通過(guò)基因富集分析（GSEA）發(fā)現(xiàn)KRT23富集AKT信號(hào)通路相關(guān)分子，且與KRT23的表達(dá)正相關(guān)（圖3A）。通過(guò)蛋白免疫印跡法發(fā)現(xiàn)載體對(duì)照組（HCCLM3-vector）相比KRT23過(guò)表達(dá)組（HCCLM3-KRT23）中p-AKT表達(dá)明顯增高，然而KRT23的干擾組（HCCLM3-RNAi-vector）中p-AKT蛋白的表達(dá)水平低于干擾對(duì)照組（HCCLM3-RNAi-vector）（圖3B）；通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與過(guò)表達(dá)載體對(duì)照組（HCCLM3-ector）相比，KRT23過(guò)表達(dá)組（HCCLM3-KRT23）中細(xì)胞周期相關(guān)分子CyclinD1表達(dá)增強(qiáng)，而細(xì)胞周期抑制分子p21表達(dá)降低；反之在KRT23的干擾組（HCCLM3-RNAi-vector）與干擾對(duì)照組（HCCLM3-RNAi-vector）中細(xì)胞周期相關(guān)分子CyclinD1表達(dá)降低，而細(xì)胞周期抑制分子p21表達(dá)升高（圖3C）。

四、KRT23促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖依賴(lài)于AKT信號(hào)通路

為了進(jìn)一步驗(yàn)證KRT23通過(guò)AKT信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖能力，我們?cè)贙RT23過(guò)表達(dá)細(xì)胞中用AKT信號(hào)通路抑制劑（LY294002）刺激后，通過(guò)MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AKT通路抑制劑刺激后細(xì)胞活力受到抑制（圖4A），同時(shí)細(xì)胞克隆數(shù)明顯降低（圖4B）。

討論

肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，盡管肝切除術(shù)、射頻消融、肝移植等治療方法取得了重大進(jìn)展，但由于肝癌早期發(fā)現(xiàn)較難，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，這使得肝癌成為世界范圍內(nèi)最棘手的腫瘤之一［7］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，癌基因和腫瘤抑制因子的異常表達(dá)可能在肝癌發(fā)展進(jìn)程中起著不可或缺的作用［8-9］。KRT23引起了我們的注意，因?yàn)橛袌?bào)道證實(shí)KRT23可作為肝癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物［4］。然而KRT23在肝癌中的調(diào)節(jié)功能尚未有相關(guān)報(bào)道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)KRT23在肝癌中升高，通過(guò)MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)表明在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)KRT23可促進(jìn)細(xì)胞增殖。

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)［10-12］。同時(shí)許多研究發(fā)現(xiàn)AKT信號(hào)通路的激活對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖，自噬調(diào)節(jié)等具有重要的作用［13］。與此同時(shí)，許多研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路與肝癌密切相關(guān)。上述研究提示在肝癌中AKT信號(hào)通路的激活對(duì)肝癌的進(jìn)程有重要作用。

本研究通過(guò)GSEA分析發(fā)現(xiàn)KRT23高表達(dá)與AKT信號(hào)通路的基因富集正相關(guān)。過(guò)表達(dá)KRT23后p-AKT活性增強(qiáng)，且細(xì)胞周期蛋白cyclinD1表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期抑制分子p21表達(dá)下降。在KRT23高表達(dá)的基礎(chǔ)上聯(lián)合AKT抑制劑處理，細(xì)胞增殖能力降低。本研究證明 KRT23是肝癌中潛在的癌基因，并且能通過(guò)激活A(yù)KT 信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。因此，KRT23可能成為新的干預(yù)和治療肝癌的潛在靶點(diǎn)。然而，我們的研究還存在不足，缺少KRT23在體內(nèi)對(duì)腫瘤的影響研究及KRT23對(duì)AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)的機(jī)制研究。這也是我們未來(lái)研究應(yīng)側(cè)重于KRT23影響肝癌進(jìn)程的機(jī)制。

綜上所述，KRT23可通過(guò)調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，為KRT23可以作為肝癌診斷及治療的潛在靶點(diǎn)提供理論支持。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-12-11）

（本文編輯：楊江瑜）