陳燕軍，吳有根，魏惠珍，金浩鑫

1.江西師范大學(xué)醫(yī)院，江西 南昌 330027

2.江西應(yīng)用科技學(xué)院，江西 南昌 330100

3.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006

連花清瘟膠囊是由13味中藥組成的復(fù)方制劑，《中國藥典》2020年版僅測定連翹苷[1]，難以全面控制連花清瘟膠囊質(zhì)量。有關(guān)連花清瘟制劑中多指標(biāo)成分測定已有報道[2-9]。一測多評法是僅測定1個成分來實現(xiàn)多個成分的同步監(jiān)控[10-12]。孫云波等[13]以綠原酸為內(nèi)參物，采用超高效液相色譜法同時測定連花清瘟膠囊中7個成分。本實驗采用高效液相色譜法，以連翹苷為內(nèi)參物，通過建立綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、大黃酸的相對校正因子測定了連花清瘟膠囊中綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸6種成分，為進(jìn)一步提高連花清瘟膠囊質(zhì)量評價水平提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀；LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)（島津公司）；Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent公司）；Millipore－Q純水器（美國Millipore公司）；AUW-220D型十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）；AB-104N型萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ3200超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

綠原酸（批號110753-202119，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%）、甘草苷（批號111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、木犀草苷（批號111720-202111，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.6%）、連翹酯苷A（批號111810-202209，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.4%）、連翹苷（批號110821-202117，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%）、大黃酸（批號110757-201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司），磷酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司），水為Milli-Q超純水。連花清瘟膠囊由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號分別為A2203128、A2204040、B2211257、B2203209、B2204254。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸對照品適量，加50%甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為121.52、56.20、43.30、123.72、185.04、4.76 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取連花清瘟膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按連花清瘟膠囊處方比例和生產(chǎn)工藝分別制備缺甘草、連翹、金銀花、大黃的陰性樣品，分別按2.1.2項方法制備，即得。

2.2 色譜條件

Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸水（B），梯度洗脫（0～5 min，8%A；5～20 min，8%A→15%A；20～30 min，15%A；30～50 min，15%A→30%A；50～65 min，30%A→45%A；65～90 min，45%A）；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm。按以上色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）、連花清瘟膠囊（B）、缺甘草陰性樣品（C）、缺金銀花陰性樣品（D）、缺大黃陰性樣品（E）、缺連翹陰性樣品（F）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC Chromatograms of mixed reference substances (A),Lianhua Qingwen Capsules (B),negative samples without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (C),negative samples without Lonicerae Japonicae Flos (D),and negative samples without Rhei Radix et Rhizoma (E),negative samples without Forsythiae Fructus (F)

2.3 線性關(guān)系考察

取混合對照品溶液，分別進(jìn)樣2、5、10、20、30、40 μL，記錄色譜圖。以綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性方程和線性范圍Table 1 Linearity equations and linear range of various components

2.4 精密度試驗

精密吸取同一批號B2204254連花清瘟膠囊樣品制備的供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸的峰面積值，計算得綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸峰面積的RSD值分別為1.3%、1.9%、1.6%、1.4%、1.3%、2.2%。

2.5 重復(fù)性試驗

取批號B2204254連花清瘟膠囊粉末適量，平行制備供試品溶液6份，測定綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸的峰面積，并計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.5%、3.1%、3.0%、2.8%、2.7%、3.0%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取批號B2204254連花清瘟膠囊供試品溶液，室溫下分別在配制后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸的峰面積值，計算得綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸峰面積的RSD值分別為1.5%、2.8%、2.1%、1.3%、1.9%、2.4%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗

取批號B2204254連花清瘟膠囊內(nèi)容物6份，每份約1.0 g，精密稱定，加入含綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸質(zhì)量濃度分別為166.00、5.71、5.14、24.60、16.60、3.71 μg/mL混合對照品溶液50 mL，制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸的平均回收率分別為99.40%、101.0%、104.5%、98.17%、99.70%、99.58%，RSD值分別為1.12%、2.53%、3.15%、2.94%、1.41%、2.84%。

2.8 校正因子的測定

精密吸取混合對照品溶液2、5、8、10、15、20 μL，進(jìn)樣測定，以連翹苷為內(nèi)參物，根據(jù)公式fs/i＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)（式中fs為內(nèi)參物的絕對校正因子，fi為待測物的絕對校正因子，As為內(nèi)參物峰面積，Ai為待測物峰面積，Cs為內(nèi)參物質(zhì)量濃度，Ci為待測物質(zhì)量濃度）計算綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、大黃酸的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 連花清瘟膠囊中各成分的校正因子Table 2 RCF for different components in Lianhua Qingwen Capsules

2.9 校正因子耐用性考察

精密吸取混合對照品溶液，進(jìn)樣測定，對連花清瘟膠囊中綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、大黃酸校正因子進(jìn)行耐用性考察，分別考察色譜柱、色譜儀器、柱溫對校正因子的影響，結(jié)果見表3～5。上述考察因素對連花清瘟膠囊中綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、大黃酸的校正因子無顯著影響，校正因子是相對穩(wěn)定的數(shù)值，可用于定量分析。

表3 不同色譜柱對校正因子的影響Table 3 Effects of different chromatographic columns on RCF

表4 不同色譜儀對校正因子的影響Table 4 Effects of different liquid chromatographic instruments on RCF

表5 不同柱溫對校正因子的影響Table 5 Effects of different column temperature on RCF

2.10 樣品測定

取5批連花清瘟膠囊，制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，分別按外標(biāo)法、一測多評法計算綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對誤差[以RSD表示，RSD＝（一測多評法計算值－外標(biāo)法實測值）/外標(biāo)法實測值]，結(jié)果見表6。

表6 連花清瘟膠囊中綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷和大黃酸的測定結(jié)果（n＝3）Table 6 Determination of chlorogenic acid,glycyrrhizin,luteolin,forsythiaside A,forsythin,and rhein in Lianhua Qingwen Capsules（n＝3）

3 討論

3.1 供試品溶液的制備和色譜條件的選擇

以提取率為考察指標(biāo)，分別考察了供試品溶液制備時的提取方式（超聲提取、加熱回流提?。?、提取溶劑（50%甲醇、80%甲醇、甲醇）、提取時間（20、30、40 min），結(jié)果用50%甲醇超聲處理30 min可有效提取6種成分。以各待測成分色譜峰的分離度、拖尾因子為主要指標(biāo)，考察了檢測波長（330、280、250 nm）、流動相（乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-乙腈-0.4%磷酸水溶液），并優(yōu)化了洗脫梯度，最終確定檢測波長280 nm，流動相以乙腈-0.4%磷酸水溶液為佳。

3.2 內(nèi)標(biāo)成分和指標(biāo)成分的選擇

連翹苷是《中國藥典》2020年版中連花清瘟膠囊的質(zhì)控成分[1]。本實驗條件下，連翹苷與其他成分分離良好，對照品易獲得，在樣品中含量變化差異不大，比較穩(wěn)定，RSD值較小，因此被選擇為內(nèi)參物。而其他5個成分也是連花清瘟膠囊中主要特征性成分[14-17]，選擇它們作為評價指標(biāo)對確保連花清瘟膠囊的療效具有重要的意義。

本研究采用HPLC-一測多評法同時測定連花清瘟膠囊中綠原酸、甘草苷、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、大黃酸等6個成分，并與外標(biāo)法實測值進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩者無顯著差異。本研究建立的一測多評法，選用連翹苷為“內(nèi)標(biāo)”參照成分，在進(jìn)行法定標(biāo)準(zhǔn)檢測時，同時測定其他5個成分，可以節(jié)約對照品，降低分析檢測成本。該法回收率高、重復(fù)性良好，為連花清瘟膠囊建立更全面的質(zhì)量控制提供了新方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突