宋紀(jì)顯,陳 琦,陳 捷,郭亞凈,武雙平,吉恩生,2

(1.河北中醫(yī)藥大學(xué),石家莊 050200;2.河北省中醫(yī)藥結(jié)合氫醫(yī)學(xué)技術(shù)創(chuàng)新中心,石家莊 050091;3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬平安醫(yī)院,石家莊 050000)

高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)是一種代謝性疾病,通常由嘌呤代謝異常引起,以尿酸生成增多及排泄減少為主要特征,以血尿酸異常升高為主要表現(xiàn)[1],是痛風(fēng)發(fā)生的直接因素,還會(huì)導(dǎo)致尿酸性腎結(jié)石、腎功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥[2-3]。人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,使HUA的患病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)[4]。由于HUA早期無(wú)明顯癥狀,而西藥治療又因常見的不良反應(yīng)導(dǎo)致長(zhǎng)期用藥受限。因此,尋找安全有效的中醫(yī)藥治療方法對(duì)防治和延緩HUA并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。

HUA發(fā)作前癥狀多不明顯,中醫(yī)理論認(rèn)為其屬于“未病”或“伏邪”范疇[5]。本病病機(jī)總屬虛實(shí)夾雜,多由“濕”邪引起,以脾腎不足為本,濕、熱、痰瘀互結(jié)為標(biāo),病位在于筋骨,源于脾腎,故補(bǔ)腎健脾、利濕祛濁是其主要治則[6-8]。中醫(yī)藥治療高尿酸血癥的案例較多,多以清熱利濕、除濕通絡(luò)、益氣健脾、泄?jié)犰铕龅葹榛局蝿t[9-10]。葛根菊苣茯苓方取《太平惠民和劑局方》所載參苓白術(shù)散健脾滲濕之義化裁而成,具有補(bǔ)腎健脾、清熱利濕、化痰祛瘀之功效,方中山藥健脾養(yǎng)胃、滋腎益精,葛根解肌退熱、升陽(yáng)止瀉,共為君藥;茯苓健脾利水,薏苡仁健脾滲濕,山楂行氣散瘀、化濁降脂,陳皮健脾燥濕,共為臣藥;菊苣、梔子、蒲公英清熱利尿,百合養(yǎng)陰潤(rùn)肺,桑葉疏風(fēng)清熱,共為佐藥;干姜溫中散寒、緩和其他藥物寒性,甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥,共為使藥,諸藥配伍,共奏健脾補(bǔ)腎、清熱利濕、化痰祛瘀之效[11-12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)方中菊苣正丁醇提取物、葛根提取物葛根異黃酮具有促進(jìn)尿酸排泄的作用[13-14],菊苣、葛根、桑葉配方使用可以降低高尿酸合并關(guān)節(jié)炎小鼠的尿酸水平[15],茯苓、山藥均可不同程度降低HUA大鼠尿酸水平[16-17]。本實(shí)驗(yàn)建立HUA大鼠模型,同時(shí)以別嘌醇為陽(yáng)性對(duì)照藥,研究不同劑量葛根菊苣茯苓方對(duì)高尿酸血癥大鼠尿酸水平的影響及其可能的作用機(jī)制,為葛根菊苣茯苓方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究經(jīng)河北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),編號(hào):DWLL202304004。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠42只,8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK[京]2016-0 006。大鼠飼養(yǎng)于河北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,可自由進(jìn)食、飲水,動(dòng)物房室內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的溫度和濕度。

1.2 主要藥物與制備

葛根菊苣茯苓方由葛根、菊苣、茯苓、薏苡仁、山藥、桑葉、梔子、蒲公英、百合、山楂、陳皮、干姜、甘草組成,以上藥物由河北中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂提供,經(jīng)河北中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定均為正品。將上述中藥飲片加入400 mL飲用水浸泡30 min,之后煎煮40 min,留取藥液;第2次加水300 mL煎煮30 min,留取藥液,將2次煎煮所得藥液充分混合后過濾,按低、中、高劑量濃縮制備成含生藥0.615 g、1.23 g、2.46 g的水煎液。氧嗪酸鉀(貨號(hào):P831461,規(guī)格:100 g/瓶)、腺嘌呤(貨號(hào):A800685,規(guī)格:25 g/瓶),上海麥克林生化科技股份有限公司;別嘌醇(貨號(hào):S45825,規(guī)格:25 g/瓶),上海源葉生物科技有限公司。

1.3 主要試劑

蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒(貨號(hào):G1120),北京索萊寶科技有限公司;血尿酸(serum uric acid,SUA)ELISA測(cè)定試劑盒(貨號(hào):GM1111)、血肌酐(serum creatinine,SCr)ELISA測(cè)定試劑盒(貨號(hào):GM1112)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)ELISA測(cè)定試劑盒(貨號(hào):GM1110)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)ELISA測(cè)定試劑盒(貨號(hào):GM1102)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)ELISA測(cè)定試劑盒(貨號(hào):GM1103)、GAPDH抗體(貨號(hào):GB15002),武漢賽維爾生物有限公司;腺苷脫氨酶(adenosine deaminase,ADA)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):A048-2-1)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):A002-1-1),南京建成生物工程研究所;有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(organic anion,OAT)3抗體(貨號(hào):bs-0609R)、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette sub-family G member,ABCG)2抗體(貨號(hào):bs-4780R),北京博奧森生物技術(shù)有限公司;尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(recombinant urate transporter,URAT)1抗體(貨號(hào):GB111847)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OAT1抗體(貨號(hào):GB113690)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter type,GLUT)9抗體(貨號(hào):26486-1-AP),武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器

DM5000B型光學(xué)顯微鏡,德國(guó)Leica公司;Vilber Fusion FX5 Spectra型多功能成像系統(tǒng),法國(guó)VilberLourmat公司;Varioskan LUX型多功能讀數(shù)儀、 EPOCH 3020型全自動(dòng)酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo Scientific公司。

2 方法

2.1 分組與造模

將42只清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組(n=6):正常組、模型組、葛根菊苣茯苓方低劑量組(6.15 g/kg)、中劑量組(12.3 g/kg)、高劑量組(24.6 g/kg)、別嘌醇組(0.03 g/kg)、正常給藥組(葛根菊苣茯苓方中劑量)。以上劑量根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》進(jìn)行換算[18],相當(dāng)于體質(zhì)量為70 kg的成人每日用量的等效劑量。本實(shí)驗(yàn)造模過程及方法參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[19],除正常組及正常給藥組外,其余各組大鼠每日灌胃氧嗪酸鉀1.5 g/kg、腺嘌呤0.1 g/kg建立HUA模型,連續(xù)21 d。從第8天開始,除正常組與模型組外,其余各組大鼠每日灌胃葛根菊苣茯苓方及別嘌醇干預(yù)治療,持續(xù)14 d,正常組與模型組給予等量蒸餾水。

2.2 樣本采集

末次給藥24 h后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠,股動(dòng)脈取血,離心后取血清于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。大鼠仰臥位固定于手術(shù)操作板上,充分暴露腹腔,摘取腎臟、肝臟后用0.9%氯化鈉溶液沖洗,腎臟拍照、稱取質(zhì)量。將部分腎臟組織取出并置于凍存管內(nèi),-80 ℃保存,用于Western blot檢測(cè);用4%多聚甲醛固定部分腎臟、肝臟組織,制備石蠟切片。

2.3 計(jì)算腎臟系數(shù)

統(tǒng)計(jì)各組大鼠體質(zhì)量及腎臟質(zhì)量,并計(jì)算腎臟系數(shù)(腎臟系數(shù)=腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量)。

2.4 蘇木精-伊紅hematoxylin-eosin staining,HE染色觀察腎臟、肝臟組織形態(tài)

取固定包埋的腎臟、肝臟組織制作石蠟切片(厚度3～4 μm),行HE染色,在顯微鏡下觀察、采集圖像。

2.5 ELISA檢測(cè)

取凍存的大鼠血清,室溫下溶解,參照ELISA試劑盒說明書,利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組大鼠血清中SUA、BUN、SCr、XOD、ADA、ALT、AST含量。

2.6 Western blot檢測(cè)

腎臟組織剪碎后加入裂解液,離心后取上清液,二奎琳甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測(cè)定蛋白濃度。蛋白電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入OAT1(1:1 000)、OAT3(1:1 000)、ABCG2(1:1 000)、URAT1(1:1 000)、GLUT9(1:1 000)、GAPDH(1:5 000)一抗4 ℃孵育12 h,再加入對(duì)應(yīng)的二抗(1:10 000)常溫孵育,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影,Image J定量分析,以目的條帶/GAPDH灰度值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量,用GraphPad Prism 8.0繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 葛根菊苣茯苓方對(duì)HUA大鼠腎臟外觀及腎臟系數(shù)的影響

正常組大鼠腎臟形態(tài)大小均正常,且色澤暗紅,表面光滑,模型組大鼠腎臟變大,色澤變淺且表面皺縮而有顆粒感,見圖1。模型組大鼠體質(zhì)量與正常組比較明顯下降(P<0.05),腎臟質(zhì)量明顯增加(P<0.05),腎臟系數(shù)顯著增大(P<0.05);與模型組比較葛根菊苣茯苓方中劑量組與別嘌醇組大鼠腎臟質(zhì)量明顯降低(P<0.05),腎臟系數(shù)明顯減小(P<0.05),見表1。

A.正常組;B.模型組;C.葛根菊苣茯苓方低劑量組;D.葛根菊苣茯苓方中劑量組;E.葛根菊苣茯苓方高劑量組;F.別嘌醇組;G.正常給藥組

A.正常組;B.模型組;C.葛根菊苣茯苓方低劑量組;D.葛根菊苣茯苓方中劑量組;E.葛根菊苣茯苓方高劑量組;F.別嘌醇組;G.正常給藥組

注:有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(OAT1),有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體3(OAT3),尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(URAT1),三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(ABCG2),葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(GLUT9)A.正常組;B.模型組;C.葛根菊苣茯苓方低劑量組;D.葛根菊苣茯苓方中劑量組;E.葛根菊苣茯苓方高劑量組;F.別嘌醇組;G.正常給藥組

A.正常組;B.模型組;C.葛根菊苣茯苓方低劑量組;D.葛根菊苣茯苓方中劑量組;E.葛根菊苣茯苓方高劑量組;F.別嘌醇組;G.正常給藥組

表1 葛根菊苣茯苓方對(duì)HUA大鼠體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量及腎臟系數(shù)的影響

3.2 葛根菊苣茯苓方對(duì)HUA大鼠血清中BUN、SUA、SCr、XOD、ADA水平的影響 ELISA結(jié)果顯示模型組大鼠血清SUA、BUN、SCr、XOD、ADA含量與正常組比較明顯升高(P<0.05),與模型組比較葛根菊苣茯苓方和別嘌醇組大鼠上述指標(biāo)表達(dá)水平均有不同程度下降(P<0.05)。見表2。

表2 葛根菊苣茯苓方對(duì)HUA大鼠血清BUN、SUA、SCr、XOD、ADA的影響

3.3 葛根菊苣茯苓方對(duì)HUA大鼠腎臟組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示正常組大鼠腎小球、腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,未見明顯尿酸鹽結(jié)晶與炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠腎小球部分萎縮,腎小管代償性擴(kuò)張,管內(nèi)可見大小不等的空泡、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及尿酸鹽結(jié)晶。與模型組比較葛根菊苣茯苓方和別嘌醇組大鼠腎小球、腎小管病理改變均有不同程度改善。見圖2。

3.4 葛根菊苣茯苓方對(duì)HUA大鼠腎臟OAT1、OAT3、ABCG2、URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠腎臟組織OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05);與模型組比較,葛根菊苣茯苓方和別嘌醇組大鼠腎臟組織OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表達(dá)水平有不同程度上升,URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度下降(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 葛根菊苣茯苓方對(duì)HUA大鼠腎臟組織中OAT1、OAT3、ABCG2、URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)的影響

3.5 葛根菊苣茯苓方對(duì)HUA大鼠肝臟組織形態(tài)及ALT、AST水平的影響

HE染色結(jié)果顯示各組大鼠肝臟組織形態(tài)基本正常,肝細(xì)胞索排列整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)大致清晰。血清ELISA結(jié)果顯示各組大鼠間ALT、AST水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4、表4。

表4 葛根菊苣茯苓方對(duì)HUA大鼠肝臟ALT、AST水平的影響

4 討論

HUA是由嘌呤代謝障礙引起,以尿酸生成、排泄失衡為特征的代謝性疾病[20]。隨著HUA發(fā)病率的逐年上升[21],尋找安全有效的中醫(yī)藥治療方法十分必要。為此,本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合使用氧嗪酸鉀和腺嘌呤建立HUA模型以模擬高尿酸血癥,同時(shí)給予不同劑量葛根菊苣茯苓方干預(yù),探究中醫(yī)藥治療的效果及潛在機(jī)制。氧嗪酸鉀可降低尿酸酶活性,腺嘌呤作為尿酸前體物質(zhì)可促進(jìn)尿酸合成,二者合用可升高尿酸[22-23]。別嘌醇可減弱黃嘌呤氧化酶的活性,抑制尿酸生成,故選用別嘌醇為陽(yáng)性對(duì)照藥作為療效參考[24],另外單獨(dú)設(shè)立葛根菊苣茯苓方組以觀察此方對(duì)肝腎功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),模型組大鼠SUA、BUN、SCr水平與正常組比較明顯升高,同時(shí)腎臟系數(shù)增加,腎臟呈灰白色且有顆粒感,腎小管出現(xiàn)不同程度擴(kuò)張,說明模型制備成功。

HUA可導(dǎo)致機(jī)體SUA、SCr、BUN水平升高,SCr是由磷酸肌酸代謝生成的化合物,BUN是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物,二者含量增高說明腎臟濾過功能受損[25],大量過飽和尿酸會(huì)在血液中形成結(jié)晶并沉積于腎小球、腎小管及腎間質(zhì),導(dǎo)致腎臟損傷[26]。ADA可催化腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤,核酸代謝酶XOD可與體內(nèi)黃嘌呤和次黃嘌呤發(fā)生氧化反應(yīng)并生成尿酸[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),模型組大鼠腎臟系數(shù)與正常組比較明顯升高,XOD、ADA水平升高;同時(shí)模型組大鼠腎小球部分萎縮硬化,出現(xiàn)尿酸鹽結(jié)晶以及腎小管代償性擴(kuò)張。給予葛根菊苣茯苓方及別嘌醇治療后,大鼠腎臟系數(shù)顯著下降,腎臟病理?yè)p傷得到改善,SUA、BUN、SCr、XOD、ADA水平也出現(xiàn)不同程度下降,這說明葛根菊苣茯苓方可降低大鼠高尿酸水平,改善腎臟病理?yè)p傷。同時(shí)肝臟HE染色及ALT、AST結(jié)果顯示各給藥組肝臟均無(wú)異常病理變化,肝功能基本正常,說明葛根菊苣茯苓方?jīng)]有明顯的不良反應(yīng)。

尿酸在腎臟中的代謝主要由尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控,包括OAT1、OAT3、ABCG2、URAT1、GLUT9等均發(fā)揮重要作用。OAT1和OAT3主要分布在腎臟近曲小管基底膜側(cè),可通過介導(dǎo)有機(jī)陰離子化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)加速尿酸排泄[28]。ABCG2是腺苷三磷酸結(jié)合“半轉(zhuǎn)運(yùn)體”蛋白,可促進(jìn)腸道尿酸排泄[29]。URAT1可促進(jìn)尿酸與腎小管上皮細(xì)胞中的陰離子交換;GLUT9可通過轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖促進(jìn)尿酸重吸收,二者表達(dá)上調(diào)可造成機(jī)體尿酸水平升高[30-31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表達(dá)水平明顯降低,URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。而與模型組比較,給予葛根菊苣茯苓方后,OAT1、OAT3、ABCG2蛋白水平上升,URAT1、GLUT9蛋白水平下降,這說明葛根菊苣茯苓方可通過調(diào)控尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)尿酸作用。

綜上所述,葛根菊苣茯苓方可通過調(diào)節(jié)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白干預(yù)大鼠體內(nèi)尿酸的生成和排泄,發(fā)揮降尿酸作用,同時(shí)對(duì)肝腎功能沒有明顯不良反應(yīng)。這為中藥復(fù)方治療HUA提供了實(shí)驗(yàn)參考和依據(jù)。