徐媛媛 郭玲宏 吳姝瑋 張 婷 張 璐 蔣 獻(xiàn)

1四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚性病科,四川成都,610041;2四川大學(xué)疾病分子網(wǎng)絡(luò)前沿科學(xué)中心免疫炎癥研究院皮膚病學(xué)研究室,四川成都,610041

斑禿(alopecia areata, AA)是一種普遍出現(xiàn)的炎癥性非瘢痕性脫發(fā)疾病,其典型臨床特征為頭皮或/和身體其他部位呈現(xiàn)斑片狀的毛發(fā)脫失,嚴(yán)重病例可能發(fā)展至全頭皮甚至全身毛發(fā)的完全脫落[1]。作為一種自身免疫性疾病,斑禿的發(fā)病機制尚未明確,可能與毛囊的“免疫特權(quán)”被破壞,免疫系統(tǒng)錯誤地識別并攻擊自體毛囊,從而引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)和毛囊損傷有關(guān)[2,3]。斑禿的發(fā)生能夠?qū)颊叩慕】迪嚓P(guān)生活質(zhì)量造成重大的負(fù)面影響,尤其是對患者的心理健康產(chǎn)生顯著的損害,使患者面臨更高的抑郁、焦慮、社交恐懼及人格障礙風(fēng)險[4,5]。 目前,斑禿的治療仍然面臨顯著挑戰(zhàn),至今尚未有被公認(rèn)能夠完全治愈該病癥的療法。常見的治療策略主要基于對免疫反應(yīng)的抑制或刺激,包括局部或系統(tǒng)性的皮質(zhì)類固醇激素、接觸免疫治療、免疫調(diào)節(jié)劑、米諾地爾以及光療等手段,其主要目的在于控制疾病的發(fā)展,刺激和促進(jìn)毛發(fā)再生,但療效通常有限[6-8]。

特應(yīng)性疾病(atopic conditions),如哮喘、特應(yīng)性皮炎以及過敏性鼻炎等,是一組由遺傳因素和環(huán)境過敏原共同作用引發(fā)的免疫學(xué)相關(guān)疾病[9]。患有特應(yīng)性疾病的個體通常具有特應(yīng)性遺傳易感性,當(dāng)暴露于環(huán)境中的過敏原時,出現(xiàn)異常的免疫反應(yīng)[10]。相對普通人群而言,特應(yīng)性疾病患者更容易發(fā)展為斑禿;該現(xiàn)象在多項流行病學(xué)研究中得到證實,提示著特應(yīng)性疾病與斑禿發(fā)病風(fēng)險增加之間可能存在關(guān)聯(lián)性[1,11,12]。然而,由于觀察性流行病學(xué)本身性質(zhì)所具有的限制,它們的結(jié)論容易受到環(huán)境因素或者統(tǒng)計過程中偏移的影響,且并不能揭示特應(yīng)性疾病與斑禿發(fā)生風(fēng)險之間是否存在因果關(guān)系。因此,特應(yīng)性疾病是否是斑禿發(fā)生的危險因素仍然存在爭議。

孟德爾隨機化是一種利用基因變異作為工具變量,以推斷暴露和結(jié)局之間的因果關(guān)系的研究[13]。 孟德爾隨機化利用遺傳變異的隨機分布,規(guī)避了傳統(tǒng)的觀察性研究中來自混雜因素和反向因果關(guān)系的影響,使得其探究的關(guān)聯(lián)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠[14]。 目前,還沒有研究應(yīng)用孟德爾隨機化來探究特應(yīng)性疾病與斑禿發(fā)生風(fēng)險之間的因果關(guān)系。因此,本研究旨在通過一項雙樣本孟德爾隨機化研究,評估三種特應(yīng)性疾病(哮喘、特應(yīng)性皮炎以及過敏性鼻炎)與斑禿發(fā)生之間的潛在因果關(guān)系,以期為特應(yīng)性疾病與斑禿兩類疾病之間的關(guān)聯(lián)性提供來自遺傳學(xué)的證據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究設(shè)計 本研究使用全基因組關(guān)聯(lián)研究 (genime-wide association study, GWAS)的匯總數(shù)據(jù)集進(jìn)行兩樣本孟德爾隨機化分析,探討特應(yīng)性疾病(包括哮喘、特應(yīng)性皮炎以及過敏性鼻炎)對斑禿發(fā)生風(fēng)險的潛在因果效應(yīng),并通過一系列后續(xù)敏感性分析檢驗該因果關(guān)聯(lián)的可靠性。具體而言,分別將哮喘、特應(yīng)性皮炎以及過敏性鼻炎被設(shè)定為暴露因素,將斑禿被設(shè)定為結(jié)局因素,而與哮喘、特應(yīng)性皮炎和過敏性鼻炎顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)則被應(yīng)用為工具變量。

本研究所進(jìn)行的兩樣本孟德爾隨機化分析是基于三個假設(shè),包括:(1)每次分析應(yīng)用的工具變量分別與三種暴露因素(哮喘、特應(yīng)性皮炎以及過敏性鼻炎)存在強烈的關(guān)聯(lián)性;(2)工具變量與同暴露因素或者結(jié)局因素相關(guān)的任何其他混雜因素?zé)o關(guān);(3)工具變量僅通過與暴露因素的關(guān)聯(lián)影響結(jié)局因素。

1.2 數(shù)據(jù)來源與工具變量的選擇 斑禿的匯總數(shù)據(jù)集來源于FinnGen Biobank (https://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_L12_ALOPECAREATA.gz),包含682例患者和361140名對照[15]。哮喘的相關(guān)數(shù)據(jù)來源是OpenGWAS數(shù)據(jù)庫(ID: ebi-a-GCST90014325);該數(shù)據(jù)集包括56167例患者和352255名對照個體。特應(yīng)性皮炎的匯總數(shù)據(jù)集來源于GWAS catalog數(shù)據(jù)庫(ID: GCST900244787),包括60653例患者和804329名對照[16]。最后,過敏性鼻炎的遺傳數(shù)據(jù)也來源于GWAS catalog數(shù)據(jù)庫(GCST90086042),包括13936例患者和42701名對照[17]。暴露和結(jié)局的所有遺傳數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)重疊現(xiàn)象,且均來自于歐洲血統(tǒng)的個體,以避免由于種族差異造成的偏移。由于所有的遺傳數(shù)據(jù)均來源于公共數(shù)據(jù)庫或者可以公開獲取的文章,本研究并不涉及倫理批準(zhǔn)或者患者知情同意。

為了確保SNP與各暴露因素強相關(guān),將該關(guān)聯(lián)性閾值設(shè)置為p-value< 5×10-8;為了避免連鎖不平衡的干擾,將參數(shù)r2閾值設(shè)置為r2<0.001,遺傳距離閾值設(shè)置為10000千堿基對(kilobase pairs, kb);為了避免弱工具變量可能造成的偏移,將F統(tǒng)計量的閾值設(shè)置為F>10。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究使用R語言(4.2.3版本)中的“TwoSampleMR”包進(jìn)行所有的統(tǒng)計學(xué)分析。該兩樣本孟德爾隨機化采用逆方差加權(quán)法(inverse-variance weighted, IVW)作為主要的分析方法,若存在明顯異質(zhì)性則采用隨機效應(yīng)模型,若無明顯異質(zhì)性則采用固定效應(yīng)模型;也進(jìn)一步采用MR-Egger回歸、加權(quán)中位數(shù)、簡單模型和加權(quán)模型4種方法進(jìn)行補充分析,以驗證逆方差加權(quán)法分析的可靠性。

除上述孟德爾隨機化分析方法外,我們也進(jìn)行了一系列額外分析,如使用Cochran Q檢驗以驗證SNP間是否存在顯著異質(zhì)性、MR-Egger截距檢驗以驗證所有結(jié)果中是否存在顯著水平多效性、留一法(Leave-one-out analysis)檢測暴露與結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)性是否主要受單個SNP的驅(qū)動和影響。本研究使用優(yōu)勢比(odds ratio,OR)及其95%置信區(qū)間(95%CI)以量化評估特應(yīng)性疾病與斑禿之間的潛在因果關(guān)系。所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙尾檢驗,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 工具變量的篩選與確定 分別篩選與三種暴露因素顯著相關(guān)的SNPs(P<5×10-8),并去除連鎖不平衡的SNPs,最終篩選得到64個、61個以及3個SNPs,分別作為研究哮喘、特應(yīng)性皮炎以及過敏性鼻炎與斑禿發(fā)病風(fēng)險之間因果關(guān)系的工具變量。根據(jù)計算,三項關(guān)聯(lián)研究中分別使用的工具變量F值均大于10,表明存在弱工具變量的風(fēng)險較小。

2.2 特應(yīng)性疾病對斑禿發(fā)病風(fēng)險的影響 如表1及圖1所示,依據(jù)IVW法的分析結(jié)果,基因預(yù)測的哮喘與斑禿發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)(OR:1.45;95%CI:1.67～1.97),且哮喘與斑禿發(fā)病風(fēng)險增加之間的關(guān)聯(lián)性具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017)。同樣,IVW法分析表明基因預(yù)測的特應(yīng)性皮炎與斑禿發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)(OR:1.79;95%CI:1.28～2.51),且這種關(guān)聯(lián)性具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=6.762×10-4)。哮喘與斑禿發(fā)病風(fēng)險增加之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)一步被MR-Egger回歸、加權(quán)中位數(shù)、簡單模型和加權(quán)模型證實;而特應(yīng)性皮炎與斑禿發(fā)病風(fēng)險增加之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)一步被加權(quán)中位數(shù)和加權(quán)模型支持。此外,依據(jù)IVW法的分析結(jié)果,基因預(yù)測的過敏性鼻炎與斑禿發(fā)病風(fēng)險之間雖然也呈現(xiàn)出正相關(guān)的趨勢,但這種關(guān)聯(lián)性并未達(dá)到顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(OR:1.88;95%CI:0.89～3.96;P=0.096)。

圖1 三種特應(yīng)性疾病與斑禿孟德爾隨機化分析的散點圖

表1 五種方法對三種特應(yīng)性疾病與斑禿孟德爾隨機化分析的結(jié)果

2.3 敏感性分析 此外,我們還分別對三種關(guān)聯(lián)關(guān)系進(jìn)行了一系列的敏感性分析,包括異質(zhì)性檢驗、水平多效性檢驗、留一法分析、漏斗圖等,以驗證暴露因素和結(jié)局之間關(guān)聯(lián)性的可靠性。SNP間的異質(zhì)性通過Cochran Q檢驗進(jìn)行驗證,結(jié)果顯示與哮喘密切相關(guān)的64個SNP間、與特應(yīng)性皮炎密切相關(guān)的61個SNP間存在異質(zhì)性(P=0.001;P=5.316×10-5),而和過敏性鼻炎(P=0.612)密切相關(guān)的SNP間均未發(fā)現(xiàn)顯著異質(zhì)性。依據(jù)異質(zhì)性的存在與否,在使用IVW方法時選擇相對應(yīng)的模型進(jìn)行分析。暴露因素與結(jié)局因素之間關(guān)聯(lián)性是否存在水平多效性通過MR Egger截距檢驗進(jìn)行驗證,在哮喘與斑禿(P=0.158)、特應(yīng)性皮炎與斑禿(P=0.888)、過敏性鼻炎與斑禿(P=0.503)三種關(guān)聯(lián)性中均未發(fā)現(xiàn)顯著的水平多效性存在。留一法的分析結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示,三種特應(yīng)性疾病與斑禿發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián)性均未受到單一的SNP影響或者驅(qū)動,進(jìn)一步驗證了結(jié)果的可靠性和一致性。最后,漏斗圖顯示當(dāng)以逐個SNP為工具變量時,哮喘和斑禿、特應(yīng)性皮炎與斑禿之間的因果關(guān)聯(lián)效應(yīng)的散點基本對稱分布于IVW法分析結(jié)果的兩側(cè),表明不存在潛在的偏倚(圖3)。

圖2 三種特應(yīng)性疾病與斑禿“留一法”分析的結(jié)果圖

圖3 孟德爾隨機化分析漏斗圖

3 討論

本文基于孟德爾隨機化的方法,從基因?qū)用嫣骄苛巳N特應(yīng)性疾病(哮喘、特應(yīng)性皮炎和過敏性鼻炎)分別與斑禿發(fā)病風(fēng)險之間的因果關(guān)系。本研究結(jié)果表明,基因預(yù)測的哮喘、特應(yīng)性皮炎分別與斑禿發(fā)病風(fēng)險之間存在顯著正向的關(guān)聯(lián)性,而過敏性鼻炎與斑禿發(fā)病風(fēng)險之間則無顯著關(guān)聯(lián)性。本研究結(jié)果提示,在特應(yīng)性疾病患者中,特別是針對哮喘患者以及特應(yīng)性皮炎患者,需要警惕斑禿發(fā)病風(fēng)險增高的可能性。

此前,已有很多觀察性研究證明了特應(yīng)性疾病與斑禿在流行病學(xué)上存在顯著的關(guān)聯(lián)性[11,12,18-20]。根據(jù)最近兩項基于大型人群隊列的研究結(jié)果顯示[18,20],斑禿人群中特應(yīng)性皮炎、哮喘和過敏性鼻炎等特應(yīng)性疾病的患病率顯著升高;且三種特應(yīng)性疾病與斑禿之間均存在顯著關(guān)聯(lián)性。然而,由于這些回顧性研究設(shè)計的限制,它們并無法揭示特應(yīng)性疾病與斑禿之間的時間相關(guān)性,因此無法驗證特應(yīng)性疾病與斑禿之間的因果關(guān)系[20]。 本項孟德爾隨機化從基因?qū)用孢M(jìn)一步驗證了過往回顧性研究結(jié)論的可靠性和一致性。雖然我們的研究僅得出哮喘或特應(yīng)性皮炎與斑禿之間的顯著關(guān)聯(lián)性,過敏性鼻炎與斑禿之間的呈正向相關(guān)、但未達(dá)到顯著統(tǒng)計學(xué)水平;但這可能是由于目前針對過敏性鼻炎能夠公開獲取的GWAS統(tǒng)計數(shù)據(jù)較為有限,相關(guān)GWAS研究所涉及的患者及對照組樣本較小,因此所能作為工具變量使用的SNP數(shù)量較少,未能得到陽性結(jié)果。未來期待更多針對不同種族、更大樣本數(shù)量的過敏性鼻炎患者的基因測序數(shù)據(jù),以證實過敏性鼻炎與斑禿發(fā)病風(fēng)險之間的因果關(guān)聯(lián)。

盡管臨床上將特應(yīng)性疾病史視為斑禿的獨立危險因素,然而特應(yīng)性疾病增加斑禿發(fā)病風(fēng)險的具體機制目前并不清楚[12,21]。過往研究和觀點通常聚焦于斑禿病理過程中涉及的TH1/IFN-γ炎癥反應(yīng),但近期研究表明TH2信號通路在斑禿發(fā)病中同樣關(guān)鍵。TH2軸的關(guān)鍵細(xì)胞因子IL-4、IL-13與斑禿發(fā)病密切相關(guān),一項針對斑禿患者和正常對照的GWAS研究證實IL-13是斑禿的易感基因位點[22];一項針對土耳其人群的基因分析研究顯示,IL-4基因內(nèi)含子多態(tài)性與斑禿的易感性相關(guān)[23]。此外,斑禿患者血漿以及頭皮皮損部位均發(fā)現(xiàn)明顯的TH2相關(guān)細(xì)胞因子的上升[24-27]。 部分病例報道以及2期臨床試驗證實了度普利尤單抗,一類抑制TH2信號通路的單克隆抗體,能夠使得斑禿患者頭發(fā)再生長;這進(jìn)一步表明了TH2軸在斑禿發(fā)病中的潛在致病作用以及靶向TH2在治療斑禿中的應(yīng)用潛力[28-31]。 而TH2上調(diào)一直被認(rèn)為是特應(yīng)性疾病,特別是哮喘、特應(yīng)性皮炎和過敏性鼻炎的重要特征,多項大型臨床試驗中應(yīng)用靶向TH2的生物制劑治療特應(yīng)性疾病的有效性也進(jìn)一步證實了TH2通路在這類疾病中的異常變化[32-34]。 此外,新型小分子靶向藥物正處于皮膚病臨床試驗的最前沿;其中,口服酪氨酸蛋白激酶(JAK)抑制劑,如巴瑞替尼和托法替尼,均在斑禿和特應(yīng)性皮炎的臨床治療中展現(xiàn)出良好的療效和潛力[35]。目前已明確與斑禿發(fā)病密切相關(guān)的細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2等,以及與特應(yīng)性皮炎密切相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-4、IL-13、IFN-γ等,可通過刺激JAK/ STAT信號通路實現(xiàn)炎癥反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[36]。由此可見,特應(yīng)性疾病與斑禿兩類疾病之間可能共享相似的發(fā)病通路和遺傳學(xué)背景。這可能是基因預(yù)測的特應(yīng)性疾病增加斑禿發(fā)病風(fēng)險的根本原因,而其中涉及的具體分子需要更多基礎(chǔ)研究進(jìn)行解釋和支撐。

我們的研究存在限制。首先,在孟德爾隨機化分析中完全排除多效性,即滿足基本假設(shè)2是具有挑戰(zhàn)性的,因為識別所有可影響暴露和結(jié)果的混雜因素是非常困難的。在孟德爾隨機化分析之后,我們進(jìn)行了MR- Egger截距檢驗以驗證本項孟德爾隨機化中不存在顯著的水平多效性。其次,特應(yīng)性疾病和斑禿的GWAS數(shù)據(jù)集均來自歐洲血統(tǒng)人群,以避免由于種族相關(guān)混雜因素造成的偏差,但是限制了我們推斷不同人群結(jié)論的能力,因此需要對其他族群進(jìn)行進(jìn)一步的研究來驗證我們的結(jié)論。最后,由于GWAS數(shù)據(jù)集中缺乏更多信息,本研究沒有進(jìn)行基于不同特征,如年齡、性別或疾病嚴(yán)重程度的分層分析。

綜上所述,本項孟德爾隨機化研究為基因預(yù)測的兩種特應(yīng)性疾病(哮喘、特應(yīng)性皮炎)與斑禿發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián)性提供了來自遺傳學(xué)角度的相關(guān)證據(jù)。我們期待未來會有更完整與全面的相關(guān)GWAS匯總數(shù)據(jù)集,以進(jìn)一步為過敏性鼻炎與斑禿發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián)性提供證據(jù)支持。