唐娟 李燚 翟麗瓊 劉邵雯 申涌 叢碩 劉詠梅

1貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 （貴陽(yáng) 550025）；2貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴陽(yáng) 550004）；3貴州省第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（貴陽(yáng) 500002）；貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院4臨床檢驗(yàn)中心，5輸血科（貴陽(yáng) 550004）

肝纖維化是由多種持續(xù)性肝臟炎癥導(dǎo)致的彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)沉積，早期肝纖維化患者癥狀不明顯，但隨著疾病進(jìn)展，最終可能威脅患者生命［1-4］。尋找科學(xué)有效的早期檢查方法進(jìn)行診斷并采取對(duì)應(yīng)干預(yù)措施，對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前組織病理學(xué)檢查是診斷肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于侵入性操作，臨床運(yùn)用存在一定局限性［5］。常用的無(wú)創(chuàng)診斷方法主要包括實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)（預(yù)測(cè)模型）和影像學(xué)檢查等［6-7］。但影像學(xué)檢查操作重復(fù)性較差，而單一指標(biāo)診斷肝纖維化效能不佳，因此多指標(biāo)聯(lián)合診斷成為新的趨勢(shì)［8］。

MicroRNAs（miRNAs）可能影響慢性肝病的進(jìn)程［9-10］。MiRNAs是一類(lèi)小的（約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)）的非編碼RNA，miRNAs轉(zhuǎn)錄后通過(guò)靶向mRNA參與細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡以及影響代謝、癌變和病毒感染等多種過(guò)程來(lái)調(diào)控基因表達(dá)［4，11］。MiRNA與HBV復(fù)制、持續(xù)感染以及肝細(xì)胞損傷和肝纖維化進(jìn)展密切相關(guān)［12］。當(dāng)肝源性miRNA在肝臟損傷或發(fā)生病變被釋放到血液中時(shí)，外周血中miRNA水平升高，這時(shí)可通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)到。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-571與肝硬化病程進(jìn)展密切相關(guān)［12］，據(jù)此推測(cè)miR-571表達(dá)水平能否作為肝纖維化診斷的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)，目前未有相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究旨在探討外周血miR-571對(duì)肝纖維化的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2022年12月至2023年9月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的肝纖維化患者40例、肝炎患者40例和同期體檢健康對(duì)照人群40例。其中健康對(duì)照組中男25例，女15例，年齡（47.23 ±14.72）歲；肝炎組中男21例，女19例，年齡（41.95± 13.89）歲；肝纖維化組中男21例，女19例，年齡（55.15 ± 12.71）。所有研究對(duì)象及家屬知情且同意，研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)：［2019倫審第（182）號(hào)］。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)肝纖維化和肝炎納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18 ～ 85歲；（2）符合2019版《慢性乙型肝炎防治指南》［13］；（3）經(jīng)病理學(xué)確診為肝纖維化。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料缺失；（2）肝移植術(shù)后；（3）肝癌；（4）近期服用過(guò)抗凝相關(guān)藥物。健康人群對(duì)照納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）近1個(gè)月體檢正常者；（2）年齡18 ～ 85歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠及哺乳期婦女；（2）患有肝臟腫瘤或其他類(lèi)型肝病；（3）合并其他嚴(yán)重臟器疾??；（4）近期服用過(guò)抗凝相關(guān)藥物。

1.3 方法檢測(cè)肝纖維化組、肝炎組和健康對(duì)照組外周血miR-571表達(dá)水平：取外周血3 mL，采用Trizol試劑提取盒（北京索萊寶科技有限公司）提取總RNA，并使用超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司，NanoDrop 2000C型）檢測(cè)RNA濃度。以總RNA做為模板，使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）和miR-571特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物（上海生物工程股份有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（美國(guó)Thermo公司，ProFlex?型）。將逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA，采用SYBR RT-qPCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）對(duì)miR-571進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性，95 ℃30 s，60 ℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-571相對(duì)表達(dá)量，選擇U6作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

表2 臨床資料表Tab.2 Baseline characteristic of participants ±s

表2 臨床資料表Tab.2 Baseline characteristic of participants ±s

注：APRI評(píng)分 =［（ALT）/（ALT參考值上限）］/（PLT）×100；FIB-4指數(shù)=年齡×AST/ PLT計(jì)數(shù)×ALT

指標(biāo)ALT（U/L）AST（U/L）PLT（× 109/L）APRI評(píng)分（分）FIB-4指數(shù)P 值0.001 0.014＜ 0.001 0.008＜ 0.001健康對(duì)照組（n = 40）25.24 ± 16.26 22.51 ± 13.62 233.68 ± 48.87 0.29 ± 0.18 0.19 ± 0.08肝炎組（n = 40）37.28 ± 28.07 40.62 ± 45.52 184.90 ± 154.32 0.79 ± 0.94 1.57± 1.25肝纖維化組（n = 40）57.21 ± 56.05 38.41 ± 46.32 124.92 ± 76.96 1.70 ± 3.34 3.59 ± 4.31 H值4.553 7.693 11.084 5.476 27.158

同時(shí)采用羅氏貝克曼庫(kù)爾特AU5800自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）等指標(biāo)水平。用Sysmex XN9000自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)抗凝全血中的血小板計(jì)數(shù)（PLT）。

1.4 主要觀察指標(biāo)比較肝纖維化組、肝炎組和對(duì)照組中AST、ALT、PLC、FIB-4指數(shù)、APRI評(píng)分和miR-571水平；分析miR-571水平與其他臨床指標(biāo)的的相關(guān)性；logistic回歸分析尋找肝纖維化獨(dú)立危險(xiǎn)因素；ROC曲線分析miR-571水平診斷肝纖維化顯著性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用多獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。使用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。為了確定肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，將單因素邏輯分析中P＜ 0.05的變量納入多因素邏輯回歸。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線用于預(yù)測(cè)肝纖維化患者的潛在生物標(biāo)志物，ROC曲線下面積（AUC）用于評(píng)估診斷生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料比較肝纖維化組的ALT、APRI評(píng)分和FIB-4指數(shù)均高于健康對(duì)照組和肝炎組，同時(shí)PLT低于其余兩個(gè)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。肝炎組的AST高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.2 外周血miR-571表達(dá)水平對(duì)比健康對(duì)照組、肝炎組和肝纖維化組外周血miR-571的表達(dá)水平見(jiàn)圖1A，結(jié)果顯示，肝纖維化組miR-571相對(duì)表達(dá)量為2.004（0.030，4.260）顯著高于健康對(duì)照組和肝炎組0.704（0.040，2.670），0.500（0.060，1.100），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.000 1）。肝炎組和健康對(duì)照組miR-571的表達(dá)水平組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將肝炎組和健康對(duì)照組合并為非纖維化組，結(jié)果顯示，見(jiàn)圖1B，非纖維化組和纖維化組miR-571的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.000 1）。

圖1 外周血miR-571表達(dá)水平對(duì)比Fig.1 Comparison of miR-571 expression levels in peripheral blood

2.3 外周血miR-571表達(dá)水平與AST、ALT、PLT、APRI評(píng)分和FIB-4指數(shù)相關(guān)性分析Spearman分析結(jié)果顯示，miR-571水平與AST無(wú)明顯相關(guān)，與ALT、APRI評(píng)分和FIB-4指數(shù)呈正相關(guān)（r= 0.23、0.30、0.22，P＜ 0.05），與PLT呈負(fù)相關(guān)（r= -0.19，P＜ 0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 MiR-571表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析Fig.2 MiR-571 expression level and clinical correlation index analysis

2.4 單因素多因素Logistic回歸分析將年齡、性別、AST、ALT、PLT、APRI評(píng)分、FIB-4指數(shù)以及miR-571水平進(jìn)行單因素logistic回歸分析，在α=0.05的水平上篩選肝纖維化發(fā)病的危險(xiǎn)因素。結(jié)果顯示年齡、ALT、PLT、APRI評(píng)分、FIB-4指數(shù)以及miR-571水平等6個(gè)因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步剔除混雜因素，建立多因素logistic回歸模型，結(jié)果提示FIB-4指數(shù)和miR-571是肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表3。

表3 肝纖維化的單因素和多因素Logistic回歸分析Tab.3 Hepatic fibrosis logistic regression analysis，involving univariate and multivariate

2.5 ROC曲線結(jié)果ROC曲線結(jié)果顯示，當(dāng)miR-571的截?cái)嘀禐?.80時(shí)，其診斷纖維化的AUC為0.91（95%CI：0.85 ～ 0.96），敏感度和特異度分別為97.50%和77.50%；當(dāng)FIB-4指數(shù)的截?cái)嘀禐?.48時(shí)，其診斷纖維化的AUC為0.83（95%CI：0.76 ～ 0.90），敏感度和特異度分別為97.50%和56.25%；使用miR-571和FIB-4指數(shù)聯(lián)合診斷時(shí)，當(dāng)截?cái)嘀禐?1.75時(shí)，其診斷纖維化的AUC為0.942（95%CI：0.90 ～ 0.98），敏感度和特異度分別為95.00%和95.00%，見(jiàn)圖3和表4。

圖3 miR-571和FIB-4指數(shù)診斷肝纖維化的ROC曲線圖Fig.3 ROC curves of miR-571 and FIB-4 index for diagnosis of liver fibrosis

表4 FIB-4指數(shù)和miR-571診斷肝纖維化的ROC 曲線結(jié)果Tab.4 ROC curve results of FIB-4 index and miR-571 in the diagnosis of liver fibrosis

3 討論

miR-571位于人類(lèi)第4號(hào)染色體上，有研究［12，14］發(fā)現(xiàn)，miR-571參與肝纖維化以及肝硬化的發(fā)生發(fā)展，在肝纖維化組織和TGF-β刺激的肝星狀細(xì)胞中表達(dá)升高，可通過(guò)Notch通路促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖和遷移同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。但目前未有具體研究表明外周血miR-571增高的相關(guān)機(jī)制，基于既往研究推測(cè)，細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破后miRNA合成增多，可能是細(xì)胞死亡/損傷期間miRNA的被動(dòng)釋放或是細(xì)胞主動(dòng)分泌造成外周血中miRNA水平增高［15］。本研究將健康對(duì)照組、肝炎和肝纖維化人群的外周血進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)分析后，發(fā)現(xiàn)肝纖維化患者miR-571水平顯著上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RODERBURG等［12］對(duì)肝硬化患者血清進(jìn)行微陣列篩選的結(jié)果一致。同時(shí)，我們將miR-571水平與ALT、AST、PLT、APRI評(píng)分和FIB-4指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，ALT和AST是檢測(cè)肝功能最常用的生化指標(biāo)，與肝細(xì)胞損傷的程度密切相關(guān)［16-17］。而APRI評(píng)分和FIB-4指數(shù)是在ALT、AST的基礎(chǔ)上結(jié)合了年齡和PLT等無(wú)創(chuàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估［18］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-571水平與ALT、APRI評(píng)分和FIB-4指數(shù)呈正相關(guān)，與PLT呈負(fù)相關(guān)。

本研究還將miR-571與臨床常見(jiàn)指標(biāo)結(jié)合，觀察多指標(biāo)聯(lián)合診斷效能。通過(guò)logistic回歸分析找出FIB-4指數(shù)和miR-571是肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并構(gòu)建疾病診斷模型，ROC曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)IB-4指數(shù)單獨(dú)診斷纖維化價(jià)值一般，而miR-571在截?cái)嘀禐?.80時(shí)，其診斷纖維化的AUC為0.91（95%CI：0.85 ～ 0.96），敏感度和特異度分別為97.50%和77.50%，當(dāng)FIB-4指數(shù)和miR-571聯(lián)合診斷肝纖維化截?cái)嘀禐?1.75時(shí)，其診斷纖維化的AUC為0.942（95%CI：0.90 ～ 0.98），敏感度和特異度分別為95.00%和95.00%，因此兩者聯(lián)合使用對(duì)肝纖維化診斷具有較高的臨床意義。但本研究也存在不足之處：（1）本研究為小樣本研究，存在一定的局限性，未來(lái)在更大人群中進(jìn)行證據(jù)級(jí)別更高的臨床研究來(lái)驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)是很有必要的。（2）未進(jìn)行患者的隨訪跟蹤，無(wú)法體現(xiàn)上述指標(biāo)用于評(píng)估肝纖維化患者預(yù)后的臨床價(jià)值。

綜上所述，肝纖維化患者外周血miR-571的水平顯著上升，將miR-571和FIB-4指數(shù)聯(lián)合檢測(cè)在肝纖維化診斷中具有一定的臨床價(jià)值。但今后還需更大樣本量的臨床研究及相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證造成外周血中miR-571表達(dá)升高的具體機(jī)制。