鐘睿 王家寧 張蕾 郭凌鄖 楊建業(yè) 鄭飛 晏譽(yù)文 余丹麗 譚利國

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院1心內(nèi)科，2臨床研究所，3消化內(nèi)鏡中心 （湖北十堰 442000）

近年來缺血性疾病在臨床上愈發(fā)多見［1］，其中由嚴(yán)重肢體缺血（CLI），導(dǎo)致的截肢、致死事件受到了重點(diǎn)關(guān)注［2］，其危害性不遜于冠心病或中樞血管疾?。?-4］。目前CLI主要治療方式包括外科手術(shù)治療、藥物治療、腔內(nèi)介入手術(shù)治療等［5］，但遠(yuǎn)期效果均不十分理想［6］，1年肢體保存率僅為5%［7］，如何提高CLI的治療效果一直困擾著臨床醫(yī)師。CLI治療的關(guān)鍵在于血管重建，近年來以進(jìn)血管生成生長因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）為目標(biāo)的基因治療已經(jīng)成為CLI治療研究的熱點(diǎn)［8-9］。VEGF可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管新生［10］，是當(dāng)前研究較多的促血管生成因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指出VEGF可通過激活動(dòng)脈特殊信號(hào)增加血管密度，調(diào)控動(dòng)脈形成［11］。臨床研究［12］則發(fā)現(xiàn)，肌肉內(nèi)注射質(zhì)粒VEGF治療血栓閉塞性脈管炎的效果顯著，可減輕患者靜息痛，降低患者截肢風(fēng)險(xiǎn)。HGF同樣是一種強(qiáng)效促血管生成因子，國外研究［13-14］已證實(shí)，肌肉注射裸體HGF質(zhì)?？娠@著改善肢體缺血，且治療安全性良好，但目前鮮有將兩種促血管因子聯(lián)合用于治療CLI的相關(guān)報(bào)道。本研究將從細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕A(chǔ)上探討腺病毒介導(dǎo)的VEGF-HGF（Ad-VEGF-HGF）基因治療對(duì)缺血組織血管生成的影響，以期為臨床治療CLI提供一種新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用基因本實(shí)驗(yàn)所用基因Ad-VEGF、Ad-HGF、Ad-VEGF-HGF由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰人民醫(yī)院臨床研究所提供，通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查（編號(hào)：2023010）。

1.2 試劑BCA試劑盒，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Yeasen 公司，36208），兔α-Tubulin 抗體（Sigma 公司，05-829），兔VEGFA多克隆抗體（武漢三鷹公司，19003-1-AP），兔HGF多克隆抗體（Abcam 公司，ab24865），辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗抗小鼠（Jackson公司，C0152）及羊抗兔二抗（Jackson公司，C0151），兔CD31多克隆抗體（Abcam 公司，ab32457），小鼠SMA單克隆抗體（Santa Cruz公司，sc-53142），小鼠VEGF（武漢欣博盛，EMC103.48）及HGF ELISA試劑盒（武漢欣博盛，EMC037.48）。

1.3 構(gòu)建下肢缺血模型昆明小鼠84只，SPF級(jí)，6 ～ 8周齡，體質(zhì)量22 ～ 30 g，購于湖北積步醫(yī)療科技有限公司，喂養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將84只昆明小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組4只，空白對(duì)照組、VEGF組、HGF組、VEGF+HGF組各20只小鼠。

異氟烷氣體麻醉，常規(guī)消毒，以左下肢近卵圓窩處為起點(diǎn)，剪開皮膚，鈍性剝離，充分暴露股動(dòng)脈和靜脈，使用4-0無菌縫合線結(jié)扎股動(dòng)脈及靜脈制備下肢缺血模型。將0.5 mL 1010 pfu：Ad-VEGF，Ad-HGF，Ad-VEGF-HGF以鹽水5 mL稀釋10倍注入對(duì)應(yīng)分組小鼠左下肢肌肉中，每只小鼠注入0.2 mL。后于術(shù)后7、14、28 d分次用測下肢血流量，計(jì)算左側(cè)患肢與右側(cè)健肢血流比值。

1.4 HE染色和免疫組化將石蠟包埋好的各組腓腸肌組織按5 μm/片進(jìn)行連續(xù)切片。將切片置于二甲苯溶液中浸泡20 min，隨后按照降濃度梯度原則先后將切片置于無水酒精、95%酒精、75%酒精、45%酒精中浸泡5 min，最后將切片轉(zhuǎn)至蒸餾水中浸泡5 min，最后再進(jìn)行切片染色。HE染色將切片先用蘇木精染液染色15 min，1%鹽酸酒精分化10 s，然后再用1%伊紅染色3 min，最后用酒精梯度脫色后樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照。

免疫組化：切片常規(guī)脫水后，首先利用0.01 mol枸櫞酸鈉緩沖液（pH為6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，然后分別加小鼠CD31多克隆抗體（1∶200）及小鼠SMA多克隆抗體（1∶100），37 ℃恒溫環(huán)境中孵育40 min，PBS沖洗3 ～ 4次，每次5 min，后向每張切片上滴加50 μL HRP-羊抗小鼠二抗，室溫避光孵育20 min，PBS清洗3次，每次5 min。最后用DAB顯色液，顯微鏡下觀察并照相，計(jì)數(shù)新生血管。

1.5 Western blot提取各組小鼠左側(cè)下肢腓腸肌組織蛋白，BCA工作液測定蛋白濃度，然后按每孔20 mg的量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將含有蛋白的凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將膜用5%的脫脂奶粉室溫孵育30 min進(jìn)行封閉，然后加入兔VEGFA抗體多克隆抗體（1∶500），兔HGF多克隆抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次后，室溫孵育二抗2 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影并拍照。

1.6 ELISA使用ELISA法檢測Ad-VEGF-HGF小鼠血清的VEGF和HGF的表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。建模24 h后，采集各組小鼠左心血（5 mL），分離血漿?？瞻卓字械渭訕?biāo)準(zhǔn)品，其余反應(yīng)孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液或標(biāo)本溶液，每個(gè)反應(yīng)孔中液體量均為100 μL/孔，隨后用用封板膠紙封閉反應(yīng)孔，將孔板置于36 ℃恒溫孵育90 min，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。流水沖洗5次后，向每個(gè)反應(yīng)孔中滴加生物抗體工作液100 μL，封板，36 ℃恒溫孵育30 min。100 μL/顯色底物36 ℃恒溫孵育15 min，最后每個(gè)反應(yīng)孔中滴加100 μL終止液，振蕩混勻后上機(jī)，檢測OD450值并記錄。

1.7 安全性分析統(tǒng)計(jì)建模成功率以及各組小鼠治療期間有無不良反應(yīng)發(fā)生。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間對(duì)比采用重復(fù)測量的方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad Prism 9.4版本軟件對(duì)圖形進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 缺血后肢血流流量建模成功后，各組小鼠缺血后左下肢血流流量均顯著下降；術(shù)后第7天，各組小鼠缺血后左下肢血流流量均明顯優(yōu)于術(shù)后即刻（P＜ 0.05），且Ad-VEGF-HGF組小鼠缺血后左下肢血流流量明顯優(yōu)于其他各組（P＜ 0.05）；術(shù)后第28天 Ad-VEGF-HGF組小鼠缺血后左下肢血流流量逐步穩(wěn)定，組間對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1及圖1。

表1 建模前后左側(cè)缺血肢體血流流量/右側(cè)健肢血流流量Tab.1 Blood flow of left ischemic limb / right healthy limb before and after modeling ±s

表1 建模前后左側(cè)缺血肢體血流流量/右側(cè)健肢血流流量Tab.1 Blood flow of left ischemic limb / right healthy limb before and after modeling ±s

注：與術(shù)后即刻相比，#P＜0.05；與同期空白對(duì)照組相比，*P＜0.05。與同期VEGF組相比，△P＜0.05；與同期HGF組相比，▲P＜0.05

時(shí)間空白對(duì)照組VEGF HGF VEGF+HGF術(shù)后第28天0.82 ± 0.76#0.89 ± 0.85#0.86 ± 0.82#0.97 ± 0.93#*術(shù)前1.03 ± 0.98#1.05 ± 1.03#0.99 ± 0.97#1.02 ± 0.98#術(shù)后即刻0.47 ± 0.40 0.40 ± 0.36 0.36 ± 0.34 0.42 ± 0.40術(shù)后第7天0.67 ± 0.61#0.69 ± 0.68#0.65 ± 0.63#0.80 ± 0.77#*△▲術(shù)后第14天0.79 ± 0.74#0.89 ± 0.85#0.85 ± 0.83#0.99 ± 0.95#*

圖1 缺血后下肢血流流量比值Fig.1 Lower limb blood flow ratio after ischemia

2.2 Western blot術(shù)后第7、14、28天時(shí)假手術(shù)組、對(duì)照組的HGF、VEGF的表達(dá)水平最低，Ad-HGF組、Ad-VEGF組、Ad-VEGF-HGF組HGF蛋白、VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜ 0.05），且術(shù)后第14天Ad-VEGF-HGF組的表達(dá)水平達(dá)到相對(duì)峰值，見圖2-4。

圖2 Western blot檢測Fig.2 Western blot detection

圖3 術(shù)后各組不同觀察節(jié)點(diǎn)VEGF、HGF表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of VEGF and HGF at different observation nodes in each group after operation

圖4 VEGF-HGF組術(shù)后不同觀察節(jié)點(diǎn)VEGF、HGF蛋白表達(dá)水平Fig.4 VEGF and HGF protein expression levels at different observation nodes in vegf-hgf group after operation

2.3 ELISA檢測注射Ad-VEGF-HGF組小鼠VEGF蛋白、HGF蛋白表達(dá)水平在術(shù)后第7天開始逐步升高，并于術(shù)后第14天達(dá)到相對(duì)峰值，術(shù)后第28天時(shí)表達(dá)水平逐步降低，術(shù)后第14天時(shí)與其他各時(shí)間節(jié)點(diǎn)表達(dá)水平相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），見表2及圖5。

表2 VEGF、HGF蛋白表達(dá)水平變化Tab.2 Changes of VEGF and HGF protein expression levels ±s

表2 VEGF、HGF蛋白表達(dá)水平變化Tab.2 Changes of VEGF and HGF protein expression levels ±s

注：與術(shù)后第14天相比，#P ＜ 0.05

指標(biāo)VEGF HGF P值＜ 0.001＜ 0.001術(shù)前34.24 ± 1.05#1.89 ± 0.80#術(shù)后第7天36.99 ± 9.80#5.19 ± 1.75#術(shù)后第14天88.79 ± 23.22 7.26 ± 0.38術(shù)后第28天23.98 ± 0.46#4.20 ± 0.73#F值83.86 14.01

圖5 ELISA檢測Fig.5 Changes of detected by ELISA

2.4 免疫組化法檢測缺血后下肢新毛細(xì)血管密度術(shù)后第7天、術(shù)后第14天、術(shù)后第28天時(shí)觀察和計(jì)數(shù)新生血管，Ad-VEGF-HGF組血管新生較為明顯且數(shù)量較多，組間a-SMA所標(biāo)記新生血管水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），其中對(duì)照組各時(shí)期的a-SMA所標(biāo)記新生血管水平最低，術(shù)后第14天VEGF+HGF所標(biāo)記新生血管水平最高，見圖6。

圖6 SMA水平Fig.6 Levels of SMA

免疫組化CD31染色結(jié)果顯示，術(shù)后第7天、第14天、第28天時(shí)觀察和計(jì)數(shù)新生血管，組間CD31所標(biāo)記新生血管水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），其中對(duì)照組各時(shí)期的CD31所標(biāo)記新生血管水平最低，術(shù)后第14天Ad-VEGF-HGF組的CD31所標(biāo)記新生血管水平處于相對(duì)峰值，見圖7。

圖7 CD31水平Fig.7 Levels of CD31

3 討論

CLI的主要治療方法是恢復(fù)患肢血流，緩解缺血疼痛癥狀，血運(yùn)重建，具體方法包括外科手術(shù)治療以及藥物治療等［15］，但臨床觀察發(fā)現(xiàn)部分CLI患者臨床獲益并不顯著，截肢率并未見顯著下降［16-17］。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，基因治療逐漸展示出優(yōu)勢［18］，血管生成基因治療試驗(yàn)被視為對(duì)不同類型缺血的一種較有前景的新興療法［19］，其中VEGF和HGF基因是目前研究最多的基因［20-21］，M?KINEN等［22］使用經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)向CLI患者注射重組腺病毒-VEGF165基因，結(jié)果顯示這兩種基因工程構(gòu)建體能增加血管化。BAR?等［23］研究指出，與VEGF相比HGF可能在血管生成過程中發(fā)揮了更為重要的作用，且HGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)和增殖作用強(qiáng)于VEGF［24］，故HFC可能是治療缺血性疾病中某些關(guān)鍵因素。基于上述研究推測VEGF與HGF在促進(jìn)血管新生方面具有協(xié)同增效作用，聯(lián)合這兩種基因有望進(jìn)一步提高CLI的治療效果，但目前尚且缺乏實(shí)驗(yàn)論證。

本研究Western blot檢測結(jié)果證實(shí)Ad-VEGFHGF組小鼠體內(nèi)VEGF、HGF蛋白持續(xù)高表達(dá)，術(shù)后第14天后即達(dá)相對(duì)峰值，此后逐漸降低，除術(shù)后第28天外，Ad-VEGF-HGF組小鼠體內(nèi)VEGF、HGF蛋白表達(dá)水平均明顯高于其他各組。同時(shí)，研究通過血流儀探測發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第14天時(shí)，Ad-VEGF-HGF組小鼠的血流流量便出現(xiàn)了明顯恢復(fù)，血流恢復(fù)速度明顯優(yōu)于VEGF組、HGF組及對(duì)照組，這與Ad-VEGF-HGF組VEGF、HGF蛋白的表達(dá)狀態(tài)變化基本一致，由此可見Ad-VEGF-HGF雙基因注射后可發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步上調(diào)VEGF蛋白和HGF蛋白的表達(dá)水平，另一方面也證實(shí)了HGF和VEGF均可促進(jìn)血管新生，這與RIAUD等［25］動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為類似，該研究指出VEGF和HGF基因的共轉(zhuǎn)移在缺血性骨骼肌中產(chǎn)生了強(qiáng)大的血管生成效應(yīng)，并可能成為治療缺血性疾病的潛在治療組合。但在促進(jìn)血管新生過程中，是VEGF還是HGF發(fā)揮了主導(dǎo)作用尚且無法明確。安全性一直以來都是基因治療重點(diǎn)關(guān)注的問題。早期病毒載體的基因治療研究［26］指出以腺病毒為載體進(jìn)行VEGF基因治療冠心病缺血的效果良好，且未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，而本研究以腺病毒為載體聯(lián)合了VEGF基因和HGF兩種基因，這兩種基因是否會(huì)增加基因治療風(fēng)險(xiǎn)著實(shí)需要重點(diǎn)關(guān)注。本研究結(jié)果顯示小鼠建模成功，各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，未出現(xiàn)死亡小鼠，由此可見Ad-hVEGF-hHGF基因治療的安全性。

本研究的局限性在于未明確VEGF聯(lián)合HGF如何調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，哪種基因發(fā)揮了主導(dǎo)作用，作用劑量是否會(huì)對(duì)其促血管作用產(chǎn)生影響等，上述問題仍有待今后進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，Ad-VEGF-HGF基因注射可顯著提高小鼠體內(nèi)VEGF和HGF蛋白的表達(dá)水平并快速達(dá)到相對(duì)峰值水平，繼而進(jìn)一步促進(jìn)下肢缺血后的血管生成，增加血流量，改善下肢循環(huán)。