周穎 蔣大軍 田勇 古雍翔 楊國(guó)輝，3

1貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（貴陽(yáng) 550004）；2黔西南州人民醫(yī)院呼吸科（貴州興義 562400）；3貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（貴陽(yáng) 550004）

膿毒癥心肌功能障礙（sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD）是由膿毒癥引起的整體性的、可逆性的心臟功能障礙［1］。20% ～ 65%的膿毒癥患者合并有心肌功能障礙［2］；當(dāng)合并膿毒癥心肌功能障礙，死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加［3］。該病對(duì)液體復(fù)蘇和血管活性藥物的治療反應(yīng)性減弱［4］。臨床醫(yī)師對(duì)該病的治療和管理面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

SIMD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為包括有炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡等因素［1］。當(dāng)機(jī)體受到病原體的入侵時(shí)，模式識(shí)別受體（PRRs）通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）激活先天免疫活性。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）在炎癥信號(hào)通路中是一個(gè)銜接分子，參與細(xì)胞內(nèi)Toll樣受體4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信號(hào)調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞自噬信號(hào)等生物學(xué)過程［5］。自噬（Autophagy）作為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種自我保護(hù)機(jī)制，在膿毒癥心肌細(xì)胞損傷的過程中，細(xì)胞利用溶酶體對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)例如功能受損的細(xì)胞器、過剩蛋白質(zhì)、部分病原體、炎癥因子等進(jìn)行“自我消化”的降解過程，起到了保護(hù)細(xì)胞損傷及清除受損細(xì)胞器的作用［6］。SIMD心肌細(xì)胞中強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)與自噬水平呈不相適應(yīng)會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的組織器官損傷。通過促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬，可以減輕因炎癥損傷導(dǎo)致的心肌功能障礙［7-8］。TRAF6在膿毒癥并發(fā)急性肺、腎損傷患者中處于高表達(dá)水平［9-10］。何子純等［11］的研究表明在膿毒癥并發(fā)ARDS患者自噬處于被抑制狀態(tài)。唐晉等［12］通過miR-98-5p負(fù)向調(diào)控TRAF6的表達(dá)減輕肺部的炎癥反應(yīng)并保護(hù)肺泡功能。而抑制TRAF6在膿毒癥心肌損傷中的對(duì)心肌細(xì)胞自噬作用尚未見報(bào)道，本研究擬從促進(jìn)自噬和抑制炎癥方面探索其發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性昆明小鼠，健康清潔級(jí)，8周齡，體質(zhì)量25 ～ 30 g，購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK（黔）2018-0001；實(shí)驗(yàn)符合貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范（批準(zhǔn)號(hào)：2200656）。

1.1.2 主要試劑及儀器TRAF6特異性抑制劑C25-140（美國(guó)MCE），三溴乙醇（南京愛貝生物），TRAF6、p65、p-p65抗體（Affinity），beclin-1、P62、LC3B抗體（Abmart），GAPDH抗體（武漢三鷹），qPCR試劑盒（武漢塞維爾），IL-1β、TNF-α、ELISA試劑盒（江蘇晶美），VINNO 76LAB動(dòng)物超聲診斷儀（北京益仁）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型構(gòu)建將昆明小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分4組，每組6只，分別為假手術(shù)（sham）組、假手術(shù)+C25-140（sham+C）組、CLP組、CLP+C25-140（CLP+C）組。膿毒癥小鼠模型參考課題組前期實(shí)驗(yàn)的盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（CLP）制模方法，術(shù)后24 h出現(xiàn)心肌損傷及心功能障礙，此時(shí)心肌細(xì)胞自噬處于相對(duì)被抑制狀態(tài)，故選擇術(shù)后24 h作為試驗(yàn)終點(diǎn)［13］。sham+C組、CLP+C組術(shù)后0.5 h予C25-140（10 mg/kg，藥物劑量參考文獻(xiàn)［14］）腹腔注射；sham、CLP組給予等體積生理鹽水。

1.2.2 小鼠心臟功能測(cè)定術(shù)后24 h麻醉，VINNO76LAB超聲測(cè)左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVEDs），通過Teichholtz公式計(jì)算出左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）［15］。計(jì)算方法如下：LVFS（%）=（LVEDd-LVEDs）/LVEDd×100；LVEF（%）=［（LVEDd）3-（LVEDs）3］/（LVEDd）3×100。

1.2.3 血清TNF-α、IL1-β濃度測(cè)定取小鼠右側(cè)眼眶血離心取血清ELISA測(cè)TNF-α、IL1-β樣品濃度。

1.2.4 心肌組織HE染色取左心室最大橫徑冠狀切面的心肌組織HE染色評(píng)估各組心肌組織炎性損傷。

1.2.5 心肌組織透射電鏡觀察自噬小體、線粒體微結(jié)構(gòu)于心尖組織約0.1 cm × 0.1 cm × 0.1 cm大小，2.5%戊二醛固定，切片透射電鏡觀察自噬小體、線粒體微結(jié)構(gòu)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光PCR測(cè)心肌組織中TRAF6 mRNA表達(dá)TRAF6引物設(shè)計(jì)由上海生工生物公司設(shè)計(jì)，序列從5′-3′所示：TRAF6-F：GGAAGAGCAGTCGTTTCCTG，TRAF6-R：GTCACACCTCTACGGGGAAA；GAPDH-F：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA，GAPDH-R：TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC。提取心肌組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。經(jīng)預(yù)變性、變性、退火/延伸、擴(kuò)增；以2-ΔΔCt算TRAF6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot（WB）測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)取心肌組織提取蛋白。依據(jù)分子量選用10%、12%的SDS-PAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗，ECL顯影，Image J軟件對(duì)條帶灰度值分析。

1.2.8 抑制自噬后觀察C25-140對(duì)膿毒癥小鼠心肌損傷的影響為進(jìn)一步研究自噬在保護(hù)膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞功能中作用，在抑制TRAF6的同時(shí)予3-MA抑制自噬，觀察對(duì)小鼠心肌損傷和心功能的影響。將昆明小鼠18只隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為CLP組、CLP+C25-140（CLP+C）組、（CLP+C+3MA）組，術(shù)后依據(jù)分組腹腔注射C25-140（劑量為10 mg/kg）、3-MA（劑量為10 mg/kg，藥物劑量參考文獻(xiàn)［16］）；CLP給予等體積生理鹽水右側(cè)腹腔注射。術(shù)后24 h動(dòng)物超聲及取心肌組織送檢病理。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較使用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α = 0.05，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 9.0繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射C25-140后小鼠心肌組織中蛋白TRAF6和TRAF6 mRNA的表達(dá)下降與sham組比較，CLP組心肌組織TRAF6蛋白及mRNA顯著升高（P＜ 0.05）；與CLP組比較，CLP+C組心肌組織TRAF6蛋白及mRNA表達(dá)下降（P＜ 0.05）。C25-140對(duì)假手術(shù)組TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。見圖1。表明術(shù)后腹腔注射C25-140能有效抑制膿毒癥小鼠心肌組織TRAF6的表達(dá)。

2.2 抑制TRAF6后膿毒癥小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β下降與sham組比較，CLP組血清TNF-α、IL-1β濃度顯著升高（P＜ 0.05）；與CLP組比較，CLP+C組炎癥因子水平下降（P＜ 0.05），sham組與sham+C組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。表明術(shù)后抑制TRAF6減輕膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)。

圖2 抑制TRAF6后膿毒癥小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL1-β下降Fig.2 The decrease of serum TNF-α and IL1-β in septic mice after inhibition of TRAF6

2.3 HE染色評(píng)估心肌組織病理改變sham組、sham+ C組小鼠心肌組織光鏡下無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列稍不規(guī)則，心肌纖維水腫；CLP+C組心肌纖維輕度水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較CLP組減輕，表明抑制TRAF6減輕心肌炎癥反應(yīng)。見圖3。

圖3 各組心肌組織病理變化（400 ×，比例尺10 μm）Fig.3 HE staining of myocardial tissue in each group （400 ×，scale 10 μm）

2.4 抑制TRAF6改善膿毒癥小鼠的心臟收縮功能動(dòng)物超聲檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）。與sham組比較，CLP組小鼠的LVEF、LVFS顯著指標(biāo)下降（P＜ 0.05）；CLP術(shù)后給予腹腔注射C25-140后LVEF、LVFS較CLP組有改善（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 抑制TRAF6后改善CLP小鼠LVEF、LVFSFig.4 Improvement of LVEF and LVFS in CLP mice after inhibition of TRAF6

2.5 透射電鏡觀察心肌自噬小體、線粒體微結(jié)構(gòu)變化透射電鏡下sham組、sham+C組心肌線粒體排列正常，無(wú)腫脹，未見自噬小體；CLP 組小鼠心肌線粒體明顯腫脹，偶見自噬小體；與CLP組比較，CLP+C組線粒體腫脹減輕，自噬小體增多，見圖5。

圖5 透射電鏡觀察心肌細(xì)胞自噬小體、線粒體微結(jié)構(gòu)（25 000 ×，比例尺500 nm）Fig.5 Observation of autophagosomes and mitochondrial microstructure of cardiomyocytes by transmission electron microscopy

2.6 WB檢測(cè)心肌組織Beclin-1、LC3B、P62自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)CLP+C組與 CLP 組比較，抑制TRAF6后心肌組織中參與自噬起始蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)增加，P62減少（P＜ 0.05），表明抑制TRAF6后促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬。見圖6。

圖6 Western blot各組小鼠心肌組織Beclin-1、LC3B和P62的表達(dá)Fig.6 Expression of Beclin-1，LC3 B and P62 protein in myocardial tissue of mice in each group

2.7 3-MA抑制自噬后減弱了C25-140對(duì)膿毒癥小鼠心肌損傷的保護(hù)作用與CLP組比，CLP+C組小鼠心肌組織病理炎癥損傷減輕；CLP+C+3-MA組小鼠心肌組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維水腫、排列稍不規(guī)則，如圖7所示。抑制自噬降低了C25-140對(duì)膿毒癥小鼠心肌損傷的保護(hù)作用，表明促進(jìn)自噬是保護(hù)膿毒癥心肌損傷的重要因素。

2.8 3-MA抑制自噬后減弱了C25-140對(duì)膿毒癥小鼠心功能的保護(hù)作用超聲檢測(cè)小鼠心功能，如圖8所示，與CLP組比較，CLP+C組小鼠的LVEF、LVFS升高（P＜ 0.05）；與CLP+C組比較，CLP+C+3-MA組小鼠LVEF、LVFS下降（P＜ 0.05）。抑制自噬降低了C25-140對(duì)膿毒癥小鼠心功能的保護(hù)作用。

圖8 抑制自噬小鼠的LVEF、LVFS下降Fig.8 Inhibition of autophagy leads to the decrease of LVEF and LVFS in mice

3 討論

心臟是膿毒癥常見累及的靶器官，當(dāng)膿毒癥合并心功能障礙，病死率可高達(dá)70%，是ICU膿毒癥患者死亡的重要原因之一［17］。炎癥反應(yīng)是膿毒癥病理生理發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）是構(gòu)建膿毒癥研究的常用模型之一，更接近于臨床上膿毒癥的炎癥特征。CLP術(shù)后24 h檢測(cè)心肌組織中TRAF6蛋白以及mRNA顯著升高；血清TNF-α、IL1-β濃度顯著升高；心肌組織病理可見心肌纖維水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；動(dòng)物超聲多普勒檢測(cè)LVEF、LVFS明顯下降，說明膿毒癥心肌功能障礙模型建立成功；透射電鏡觀察偶見自噬小體、線粒體腫脹明顯，自噬處于相對(duì)被抑制狀態(tài)。CLP術(shù)后腹腔注射TRAF6特異性抑制劑C25-140后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WB以及PCR檢測(cè)心肌組織中TRAF6表達(dá)降低，炎癥因子下降；心功能指標(biāo)LVEF、LVFS升高；病理提示心肌炎癥減輕；透射電鏡觀察自噬小體增多，自噬蛋白Beclin-1、LC3II/I表達(dá)增加，自噬效應(yīng)增強(qiáng)。而自噬抑制劑3-MA減弱了C25-140對(duì)心肌的保護(hù)作用。

TRAF6是一種銜接蛋白，參與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家族和Toll樣受體（Toll-like Receptor，TLR）/白細(xì)胞介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的連接［18］。TLR4作為最早發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體家族成員之一，在心臟組織中高表達(dá)，參與心肌炎癥、心功能衰竭等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。TLR4激活下游信號(hào)TRAF6，進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路，產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等炎癥因子。本研究選擇使用TRAF6特異性抑制劑C25-140具有抑制NF-κB信號(hào)通路降低炎癥反應(yīng)的作用［14］；但在膿毒癥心肌功能障礙中無(wú)相關(guān)報(bào)道。CLP術(shù)后經(jīng)腹腔注射TRAF6特異性抑制劑后，阻斷炎癥信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，小鼠的血清炎癥因子下降，表明抑制TRAF6減輕膿毒癥的全身炎癥反應(yīng)。

心臟是膿毒癥常見受累的靶器官，膿毒癥的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)產(chǎn)生大量炎癥因子等心肌抑制物質(zhì)是SIMD形成的基礎(chǔ)；TNF-α、IL-1β等炎癥因子導(dǎo)致心肌細(xì)胞炎性水腫、氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、線粒體功能障礙等加重心肌細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而引起心肌組織損傷和心功能障礙［1］。SUN等［19］的研究使用橘皮苷顯著降低LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠心功能障礙模型的炎癥因子（TNF-α、IL-1β）和心肌酶（CK、LDH）的水平，減輕了心肌組織的炎癥反應(yīng)和心臟功能障礙。本實(shí)驗(yàn)使用特異性抑制劑C25-140抑制TRAF6，抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的上游關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，HE染色觀察心肌病理炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，心臟收縮功能LVEF、LVFS有所好轉(zhuǎn)，改善心肌炎癥損傷及膿毒癥小鼠的心臟功能。本實(shí)驗(yàn)透射電鏡檢查見CLP組小鼠心肌組織微結(jié)構(gòu)自噬小體數(shù)目減少、線粒體腫脹。線粒體占心肌細(xì)胞的30%，是心肌收縮和舒張功能能量產(chǎn)生的場(chǎng)所，線粒體功能障礙是SIMD廣泛認(rèn)同的發(fā)病機(jī)制之一。PENG等［20］研究，迷迭香酸（RA）通過激活Sirt1/PGC-1α通路減輕線粒體損傷改善LPS誘導(dǎo)的心臟功能障礙。JOSEPH等［21］抑制NOX2維護(hù)線粒體功能和保持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，減輕膿毒癥誘導(dǎo)的心臟收縮功能障礙。本實(shí)驗(yàn)觀察到抑制TRAF6后CLP小鼠線粒體腫脹減輕，具有保護(hù)線粒體功能的作用。

自噬在調(diào)節(jié)膿毒癥免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵性作用，在膿毒癥早期即可參與清除病原體、受損細(xì)胞和細(xì)胞器的修復(fù)、回收、再利用等調(diào)節(jié)過程，減輕心肌的損傷［6］。維持適當(dāng)?shù)淖允伤绞菦Q定細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)中保持正常功能的關(guān)鍵。在膿毒癥早期，自噬水平與膿毒癥嚴(yán)重狀態(tài)相適應(yīng)，當(dāng)膿毒癥病情逐漸加重，自噬受到抑制。LINARES等［22］研究表明，在營(yíng)養(yǎng)激活的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中TRAF6促進(jìn)mTORC1的激活。GAO等［23］研究表明，雷帕霉素抑制mTORC1促進(jìn)自噬改善慢性心力衰竭大鼠模型的心肌細(xì)胞凋亡和心臟功能。因此，進(jìn)一步推測(cè)TRAF6促進(jìn)mTORC1的激活負(fù)調(diào)節(jié)自噬信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞自噬過程。TANG等［8］研究，納西克拉辛（Narciclasine）促進(jìn)自噬上調(diào)緩解LPS誘導(dǎo)膿毒癥急性心肌損傷。CHEN等［24］在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠心肌病模型中觀察到丹參酮IIA磺酸鈉增強(qiáng)自噬抑制NLRP3減輕膿毒癥心肌病模型小鼠的炎癥反應(yīng)和心功能障礙。本實(shí)驗(yàn)抑制TRAF6后WB檢測(cè)心肌組織Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)增加，P62減少，結(jié)合透射電鏡觀察心肌組織自噬，表明自噬增強(qiáng)后緩解膿毒癥所致的炎癥反應(yīng)和心功能障礙，當(dāng)給予自噬抑制劑后部分逆轉(zhuǎn)了C25-140對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用。因此，抑制TRAF6促進(jìn)自噬參與改善膿毒癥心肌炎癥和心功能障礙的病理生理過程。

本實(shí)驗(yàn)使用動(dòng)物超聲多普勒檢測(cè)心臟功能，接近于臨床診斷SIMD的客觀依據(jù)。也存在不足，僅僅在動(dòng)物模型層面觀察心肌炎癥和心臟收縮功能，還需通過心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同方案的療效差異。其次，由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)等限制，未進(jìn)一步深層次直接探索抑制TRAF6后自噬信號(hào)通路中關(guān)鍵靶蛋白的變化。綜上所述，本研究論證抑制TRAF6后對(duì)膿毒癥小鼠心肌的炎癥損傷和心功能障礙的治療效果，并且觀察到抑制TRAF6增強(qiáng)膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞自噬水平，抑制自噬減弱了C25-140對(duì)膿毒癥小鼠心肌損傷的保護(hù)作用，為膿毒癥心肌功能障礙在治療方面提供抑制炎癥和促進(jìn)自噬聯(lián)合應(yīng)用的線索依據(jù)。