胡 云 鄒勇平 周元元 王 帥 梁志春

聚乳酸(polylactic acid,PLA)吸管在(58±2) ℃的弱光環(huán)境下,經(jīng)過70 d左右的時(shí)間即可完全降解[1],其初始原料來自玉米、甜菜、土豆等天然可再生資源,是一種環(huán)保、可再生、可持續(xù)的新型生物基食品接觸材料[2]。當(dāng)前,包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家陸續(xù)出臺(tái)了禁塑令[3-4],遏止一次性塑料吸管的使用。PLA吸管安全無害、對(duì)環(huán)境友好,具備商業(yè)應(yīng)用的基本特性[2],成為了替代傳統(tǒng)的聚丙烯(polypropylene,PP)吸管的主要選擇。

PLA材料通常與聚酯混合以改善其抗沖擊性[5-6],當(dāng)聚酯部分添加三聚氰胺甲醛樹脂時(shí),甲醛會(huì)從這些食品接觸材料中遷移出來[7]。甲醛具有毒性,中國(guó)及歐盟規(guī)定,塑料等食品接觸材料中甲醛的特定遷移限量為15 mg/kg[8-9]。據(jù)報(bào)道[10-11],德國(guó)、荷蘭對(duì)市場(chǎng)上生物基餐具的產(chǎn)品抽檢中,有11%左右的樣品甲醛遷移量超過限量要求,最高達(dá)到了247 mg/kg。為了保障消費(fèi)者的安全,亟需對(duì)PLA吸管這種新型生物基食品接觸材料中的甲醛進(jìn)行遷移測(cè)試并進(jìn)行安全性評(píng)估。目前,中國(guó)規(guī)定的食品接觸材料中甲醛遷移量的測(cè)定方法為乙酰丙酮分光光度法和變色酸分光光度法[12]。2,4-二硝基苯肼(2,4-dinnitrophenylhydrazine,DNPH)柱前衍生高效液相色譜法[13-14]與分光光度法相比具有更高的靈敏度,在分析領(lǐng)域中更常被選擇用于醛類的測(cè)定。普遍認(rèn)為,衍生化法的甲醛檢測(cè)靈敏度受衍生化試劑DNPH的pH值、物質(zhì)的量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間的影響[15-16],但是不同的產(chǎn)品,優(yōu)化的衍生條件并不完全相同。

據(jù)統(tǒng)計(jì)[17],飲料水、果蔬汁、茶飲料的消費(fèi)占據(jù)了中國(guó)飲料總消費(fèi)量的前列,試驗(yàn)選擇用水模擬飲料和茶飲料,用酸性模擬液模擬果蔬汁飲料。酸性模擬液為國(guó)內(nèi)外常用的4 mL/100 mL冰乙酸的水溶液和3 mL/100 mL冰乙酸的水溶液。根據(jù)PLA吸管在冷凍飲品、常溫飲品、熱燙飲品下的實(shí)際使用情況,設(shè)計(jì)相應(yīng)溫度條件,研究PLA吸管中甲醛的遷移行為,并進(jìn)行相應(yīng)的安全性評(píng)估,旨在為這種新型食品接觸材料的市場(chǎng)監(jiān)管提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

PLA吸管:市售;

色譜柱:Eclipse Plus C18(4.6×150 mm,3.5 μm),美國(guó)Agilent公司;

預(yù)柱:Agilent EP-C18柱,美國(guó)Agilent公司;

甲醛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液(質(zhì)量濃度為1 002 mg/L)、甲醛-DNPH腙標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為1 008 mg/L):色譜級(jí),美國(guó)o2si公司;

2,4-二硝基苯肼(純度98%):色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;

甲醇、乙腈:色譜純,默克化工技術(shù)(上海)有限公司;

冰乙酸:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

超純水:自制。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(配置DAD檢測(cè)器):1260型,美國(guó)Agilent科技有限公司;

Milli-Q超純水儀:Reference型,密理博(上海)貿(mào)易有限公司;

酸度計(jì):S210-K型,梅特勒托利多科技(中國(guó))有限公司;

電子分析天平:XSR204型,梅特勒托利多科技(中國(guó))有限公司;

精密恒溫箱:DH611C型,雅馬拓科技貿(mào)易(上海)有限公司;

數(shù)顯恒溫水浴鍋:HH-4型,常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Eclipse Plus C18(4.6×150 mm,3.5 μm);預(yù)柱:Agilent EP-C18柱;流動(dòng)相:水—乙腈(V水∶V乙腈=55∶45);流速1.0 mL/min,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量20 μL;吸收波長(zhǎng)355 nm。

1.2.2 甲醛-DNPH腙標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制 分別準(zhǔn)確吸取1 008 mg/L甲醛-DNPH腙標(biāo)準(zhǔn)溶液0.01,0.1,0.2,0.4,0.7 mL于10 mL棕色容量瓶中,加乙腈定容至刻度,配得質(zhì)量濃度為1.008,10.08,20.16,40.32,70.56 μg/mL的甲醛-DNPH腙標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。此系列標(biāo)準(zhǔn)溶液每次臨用前現(xiàn)配。

1.2.3 DNPH衍生化試劑的配制 準(zhǔn)確稱取0.673 3 g DNPH于100 mL棕色容量瓶中,先加入50 mL乙腈,然后加入1.5 mL冰乙酸,超聲20 min至完全溶解,最后用乙腈定容至刻度,配得濃度為33.3 mmol/L、冰乙酸含量為1.5%的DNPH溶液。此溶液可于5 ℃避光保存2周,臨用前進(jìn)一步稀釋至2.664 mmol/L,此濃度是標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的甲醛濃度的4倍。

1.2.4 柱前衍生化反應(yīng) 遷移試驗(yàn)結(jié)束后,取5 mL酸性食品模擬液的浸泡液,與5 mL濃度為2.664 mmol/L、冰乙酸含量為1.5%的DNPH衍生化試劑在45 ℃反應(yīng)40 min,反應(yīng)結(jié)束后迅速置于冰水浴中冷卻5 min,經(jīng)0.45 μm針頭過濾器過濾后待上機(jī)分析;對(duì)于用水作為食品模擬液的浸泡液,從中取4.85 mL,加入0.15 mL冰乙酸,使其中冰乙酸體積含量達(dá)到3%,其余衍生化條件與酸性食品模擬液的浸泡液相同。

1.2.5 甲醛的遷移試驗(yàn) 采用GB 5009.156—2016中的全浸法,以水、3%冰乙酸的水溶液、4%冰乙酸的水溶液為食品模擬液,對(duì)一次性PLA吸管進(jìn)行遷移測(cè)試。遷移測(cè)試模擬了一次性PLA吸管在冷飲、溫飲、熱飲3種溫度條件下的使用情況,分別為5,40,100 ℃,浸泡時(shí)間3 h。遷移測(cè)試結(jié)束后,將浸泡液與DNPH進(jìn)行衍生化反應(yīng),對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行高效液相色譜分析,外標(biāo)法定量,計(jì)算PLA吸管水及酸性食品模擬液中甲醛的遷移量,結(jié)果表示為每千克食品模擬液中甲醛遷移的毫克數(shù)。在設(shè)定的遷移試驗(yàn)條件下,未觀察到PLA吸管任何物理性能(如變形、融化、溶脹等)的改變。

1.2.6 多因素方差分析 以摩爾量倍數(shù)和冰乙酸含量為“固定因子”,以甲醛反應(yīng)率為“因變量”,選用“全因子”模型,分析所有因子的主效應(yīng)和交互效應(yīng)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及圖譜繪制軟件 儀器分析軟件:Agilent OpenLAB CDS-Acquisition(版本2.4.0.628);統(tǒng)計(jì)分析軟件:IBM SPSS Statistics 26;圖譜繪制軟件:Origin 2021。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相和柱溫 有研究[18-19]表明,流動(dòng)相的極性和柱溫會(huì)影響甲醛-2,4二硝基苯腙的保留時(shí)間和峰面積,增加流動(dòng)相中乙腈的比例、升高柱溫,苯腙的保留時(shí)間會(huì)提前。試驗(yàn)中,當(dāng)V水∶V乙腈為50∶50或52.5∶47.5,柱溫為20～40 ℃時(shí),苯腙較快出峰,保留時(shí)間為4～8 min,但是色譜峰普遍拖尾,影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確度,與Graceffa等[20]的試驗(yàn)結(jié)果一致。當(dāng)V水∶V乙腈為60∶40、柱溫為20～40 ℃時(shí),苯腙的出峰時(shí)間較晚,為11～14 min,影響檢驗(yàn)的時(shí)效性。因此,試驗(yàn)重點(diǎn)考慮了V水∶V乙腈為55∶45或57.5∶42.5的色譜條件(見表1)。由表1可知,當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí),苯腙的峰面積響應(yīng)值最高,但Eclipse Plus C18柱長(zhǎng)期在40 ℃使用容易老化。因此,試驗(yàn)重點(diǎn)研究了柱溫在35 ℃及以下,V水∶V乙腈為55∶45或57.5∶42.5的色譜條件。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,該色譜條件下,苯腙的峰面積差異不顯著(P=0.469>0.05),保留時(shí)間差異顯著(P=0.000<0.05),最終選擇出峰時(shí)間較快的色譜條件,即V水∶V乙腈為55∶45,柱溫35 ℃,此時(shí),苯腙色譜峰的保留時(shí)間為7.845 min。從樣品色譜圖(圖1)來看,甲醛-2,4二硝基苯腙與雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)了有效分離,分離度為1.9,此外,食品模擬液中含有少量的甲醛,需要在結(jié)果的計(jì)算中扣除。

A. 遷移試驗(yàn)后加標(biāo)的模擬液 B. 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液 C. 遷移試驗(yàn)后的模擬液 D. 模擬液

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng) 用DAD檢測(cè)器對(duì)甲醛-2,4二硝基苯腙標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行光譜掃描,在356 nm處有最大光吸收。紫外光譜掃描通常會(huì)有2 nm左右的偏移,且檢測(cè)波長(zhǎng)在354～360 nm并不會(huì)影響目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度[21-22],因此選擇355 nm作為甲醛-2,4二硝基苯腙的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 甲醛衍生條件優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間 研究了反應(yīng)溫度在25～85 ℃、反應(yīng)時(shí)間在0～60 min,甲醛與DNPH的反應(yīng)率,結(jié)果見圖2。溫度和時(shí)間在一定程度上能促進(jìn)甲醛的衍生化反應(yīng),但是過高的溫度和過長(zhǎng)的時(shí)間則不利于衍生化反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)溫度為25,35 ℃時(shí),甲醛與DNPH衍生形成甲醛-2,4二硝基苯腙的反應(yīng)率達(dá)不到90%。當(dāng)溫度升高至45 ℃及以上時(shí),甲醛的衍生化反應(yīng)率能達(dá)到100%,由于測(cè)量誤差,甲醛-2,4二硝基苯腙的反應(yīng)率在100%上下波動(dòng),但是差異并不顯著(P=0.400>0.05)。但是在85 ℃反應(yīng)40 min以后,甲醛的衍生化反應(yīng)率則迅速下降,并且在60 min時(shí)大幅降低至70%,同時(shí)可觀察到紅棕色的沉淀。在反應(yīng)剛開始時(shí),溫度對(duì)甲醛衍生化反應(yīng)率的影響較低,所有溫度組中甲醛的衍生化反應(yīng)率均低于71%,10 min后,25,35 ℃試驗(yàn)組甲醛的衍生化反應(yīng)率分別達(dá)到了76%和85%,其他試驗(yàn)組的衍生化反應(yīng)率則迅速升高至100%附近。40 min時(shí),除了25,35 ℃試驗(yàn)組甲醛的衍生化反應(yīng)率穩(wěn)定在86%和83%,其他試驗(yàn)組的衍生化反應(yīng)率則基本穩(wěn)定在100%。因此,優(yōu)化的反應(yīng)溫度為45 ℃,反應(yīng)時(shí)間為40 min。

圖2 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)甲醛反應(yīng)率的影響

2.2.2 DNPH溶液中冰乙酸含量和DNPH用量 研究了DNPH溶液中冰乙酸含量分別為1%,1.5%,2%,3%,4%,DNPH用量分別為甲醛物質(zhì)的量的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10倍時(shí),甲醛與DNPH的反應(yīng)率,采用全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì),每組重復(fù)試驗(yàn)3次,用統(tǒng)計(jì)分析軟件估算主效應(yīng)和交互效應(yīng),結(jié)果見表2。由表2可知,不僅物質(zhì)的量倍數(shù)和冰乙酸含量的主效應(yīng)顯著(P=0.000<0.05),物質(zhì)的量倍數(shù)和冰乙酸含量的交互效應(yīng)也顯著(P=0.002<0.05)。進(jìn)一步對(duì)物質(zhì)的量倍數(shù)和冰乙酸含量進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)分析,結(jié)果見圖3和圖4。圖3中,同一冰乙酸濃度,甲醛反應(yīng)率隨DNPH物質(zhì)的量的增加而增加[23],同一摩爾量,冰乙酸含量在1.5%和4.0%,即對(duì)應(yīng)的DNPH溶液酸度分別為pH 3.07,2.05時(shí),甲醛反應(yīng)率有最大值,與Rezende等[15]和Lin等[24]的試驗(yàn)結(jié)果一致。羰基化合物與質(zhì)子化肼的反應(yīng)涉及3種反應(yīng)機(jī)理[25]:① 羰基化合物與質(zhì)子化肼形成加合物,中性肼在親核反應(yīng)中攻擊羰基碳;② 質(zhì)子化肼直接攻擊羰基碳形成質(zhì)子化腙;③ 酸催化下肼攻擊羰基碳,C—N的形成與脫水進(jìn)程具有pH依賴性,而腙的形成則是這幾種反應(yīng)機(jī)理互相競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。當(dāng)冰乙酸含量為1.0%(pH 4.02)時(shí),pH值較高,羰基質(zhì)子化和脫水進(jìn)程受阻,表現(xiàn)為較低的反應(yīng)率。隨著冰乙酸含量的增加,pH值降低,反應(yīng)率增加。當(dāng)冰乙酸含量增加至2%(pH 2.75)時(shí),中性肼有進(jìn)一步質(zhì)子化的趨勢(shì),氮孤對(duì)電子的親核攻擊受阻,反應(yīng)率降低。此后,隨著冰乙酸含量的進(jìn)一步增加,質(zhì)子化肼直接攻擊羰基碳的反應(yīng)進(jìn)程占主導(dǎo)地位,反應(yīng)率也隨之逐漸上升。同樣的趨勢(shì)在圖4中也可以觀察到。由于DNPH的量過低,甲醛的反應(yīng)率不能達(dá)到100%,DNPH的量過高,形成的巨大色譜峰產(chǎn)生的峰拖尾會(huì)干擾目標(biāo)化合物的分析[26],因此,優(yōu)化的DNPH用量為甲醛物質(zhì)的量的4倍,冰乙酸含量為1.5%。

圖3 不同物質(zhì)的量的倍數(shù)在冰乙酸含量上的簡(jiǎn)單效應(yīng)

圖4 不同冰乙酸含量在物質(zhì)的量倍數(shù)上的簡(jiǎn)單效應(yīng)

表2 方差分析之DNPH的酸度和物質(zhì)的量的倍數(shù)對(duì)甲醛反應(yīng)率的影響?

2.3 方法參數(shù)的確認(rèn)

如圖5所示,甲醛-DNPH腙標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.008～70.560 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性方程為y=55.247 0x-3.849 4,相關(guān)系數(shù)為0.999 5,對(duì)應(yīng)的甲醛檢出限為0.066 mg/kg,定量限為0.22 mg/kg。在國(guó)標(biāo)甲醛檢測(cè)方法[12]中,乙酰丙酮分光光度法的檢出限為0.02 mg/dm2,變色酸分光光度法的檢出限為0.04 mg/dm2,按照1 kg為6 dm2的換算系數(shù),這兩種比色法的甲醛檢出限分別為0.12,0.24 mg/kg,可見,液相色譜法更為靈敏。

圖5 甲醛-2,4二硝基苯腙標(biāo)準(zhǔn)曲線

將甲醛的衍生化產(chǎn)物在常溫條件下放置4.5,9.0,13.5 h,濃度變化無顯著性差異(P=0.959>0.05),此檢測(cè)方法具有一定的穩(wěn)定性。

分別向水、3%冰乙酸的水溶液、4%冰乙酸的水溶液3種食品模擬液中加入2.0,20.0,40.1 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液,與DNPH溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng),試驗(yàn)重復(fù)6次,結(jié)果見表3。甲醛加標(biāo)的平均回收率在92.6%～104.1%,標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)在0.4%～3.3%,回收率和精密度試驗(yàn)的結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[27]的檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求。

表3 甲醛衍生化反應(yīng)的回收率與精密度

2.4 PLA吸管中甲醛遷移量

對(duì)市售的3種PLA吸管進(jìn)行遷移試驗(yàn),甲醛遷移的結(jié)果見表4。隨著遷移溫度的升高,甲醛遷移量逐漸增加[23],在100 ℃的高溫組中,甲醛遷移量遠(yuǎn)高于40 ℃的常溫組和5 ℃的低溫組,甲醛在酸性模擬液中的遷移量顯著高于在水中的(P=0.00<0.05),但是在兩種酸性模擬液中的遷移量沒有顯著差異(P=0.308>0.05)。經(jīng)檢測(cè),PLA吸管中的甲醛在100 ℃的酸性模擬液中遷移量最高,為1.839 mg/kg,遠(yuǎn)小于甲醛特定遷移量15 mg/kg的限量要求[8-9]。可見,試驗(yàn)的PLA吸管無論是用于低溫飲品、常溫飲品、熱飲或是水、酸性飲品,其甲醛遷移量并不是一個(gè)顯著的能引起安全問題的因素,但是,對(duì)PLA吸管客觀準(zhǔn)確的安全性評(píng)估仍取決于今后的產(chǎn)品市場(chǎng)抽檢。

表4 PLA吸管中甲醛的遷移情況?

3 結(jié)論

采用優(yōu)化的2,4-二硝基苯肼柱前衍生化法檢測(cè)聚乳酸吸管中甲醛遷移量,方法的檢出限為0.066 mg/kg,靈敏度優(yōu)于國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法。以3種市售的PLA吸管為試驗(yàn)樣品,設(shè)計(jì)了水、3%冰乙酸水溶液、4%冰乙酸水溶液3種食品模擬液,5,40,100 ℃ 3種遷移溫度,遷移時(shí)間為3 h的遷移試驗(yàn),研究了PLA吸管中甲醛在該遷移條件下的遷移行為,檢測(cè)結(jié)果表明,甲醛最大遷移率為1.839 mg/kg,符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的特定遷移率的限量要求。將來需要對(duì)市場(chǎng)上更多來源的PLA吸管進(jìn)行甲醛的遷移試驗(yàn),以準(zhǔn)確評(píng)估這種新型食品接觸材料的安全性。