李貝貝 汪 薇 江 豐 王會(huì)霞 陳 鋰

草甘膦(glyphosate,Gly)是一種廣譜、滅生性、氨基酸類除草劑,對多年生雜草非常有效,是目前使用量最大的除草劑之一[1-2],被廣泛用于茶園、果園等。若不按照規(guī)范使用會(huì)造成草甘膦殘留,長期食用含草甘膦的茶葉會(huì)增加患非霍奇金淋巴瘤癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[3]。研究[4]表明,植物會(huì)代謝草甘膦產(chǎn)生氨甲基膦酸(amino methyl phosphoric acid, AMPA),作為草甘膦的代謝標(biāo)志物,AMPA對水生生物和哺乳動(dòng)物具有長期的毒性作用,且具有蓄積性。GB 2763—2021規(guī)定草甘膦在茶葉中的最大殘留限量為1 mg/kg,茶葉中的草甘膦不符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的情況時(shí)有發(fā)生[5],影響了中國茶葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

草甘膦為極性離子型農(nóng)藥,溶于水而不溶于有機(jī)溶劑[6],與茶葉中的有機(jī)物具有很強(qiáng)的結(jié)合能力,對其殘留量分析的難度較大[7]。常用的檢測方法有免疫法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、氣相色譜—氮磷檢測法、氣相/液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]和高效液相色譜—高分辨質(zhì)譜法[10-11]等。采用氣相/液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法檢測均需衍生化,操作復(fù)雜、時(shí)間長[1,12],且由于結(jié)構(gòu)中存在氨基和磷酸基團(tuán),草甘膦與AMPA在流動(dòng)相中容易形成內(nèi)鹽,導(dǎo)致在普通反相色譜柱中的保留能力差。親水作用色譜柱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)雖然可以改進(jìn)保留能力,但需要平衡的時(shí)間長,重復(fù)性也較差,且均需要使用大量的有機(jī)溶劑,易造成環(huán)境污染。綠色分析檢測技術(shù)是以無污染或少污染理念為核心內(nèi)容,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)食品檢驗(yàn)技術(shù)有機(jī)溶劑消耗大等的不足,可最大限度減少或消除分析過程中有害物的產(chǎn)生,將環(huán)境污染降到最低[13]。同時(shí),草甘膦與AMPA在水溶液中易形成離子化合物,因此可以利用離子交換柱分離草甘膦殘留,經(jīng)抑制器轉(zhuǎn)換成電導(dǎo)值高的離子型化合物[14-15],不需要衍生,對于這類親水性農(nóng)藥殘留的測定有特殊的優(yōu)勢[16]。離子色譜的流動(dòng)相多為NaOH、KOH水溶液,有機(jī)試劑使用量小,且抑制反應(yīng)產(chǎn)物為水[17-18],符合綠色分析化學(xué)要求[17-19]。

目前,離子色譜法主要應(yīng)用于食品中離子型化合物的檢測,如測定現(xiàn)煮咖啡中氯酸鹽[20]以及水果和蔬菜中高極性陰離子農(nóng)藥的多殘留等[16,21],且多以水質(zhì)等基質(zhì)干擾相對較小的樣品分析為主[22-24],主要是由于基質(zhì)復(fù)雜,干擾因素較多,以致在離子色譜檢測器端雜峰較多,檢出限難以得到保證[25],而茶葉的基質(zhì)效應(yīng)更是儀器分析的難點(diǎn)[26-27]。茶葉中大量的色素、氨基酸等物質(zhì)必然會(huì)嚴(yán)重干擾離子色譜測定草甘膦和AMPA的信號,限制離子色譜在茶葉分析中的應(yīng)用。將離子色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(ion chromatography tandem mass spectrometry, IC-MS/MS)可提高對于茶葉等復(fù)雜基質(zhì)分析的抗干擾能力和靈敏度,但還需要針對茶葉樣品基質(zhì)特征和草甘膦等的理化性質(zhì),優(yōu)化與IC-MS/MS分析配套的前處理方法,探究IC-MS/MS在茶葉中草甘膦及AMPA檢測的適用性。QuEChERS是一種基質(zhì)固相分散的快速樣品處理技術(shù),通過吸附劑與樣品中的雜質(zhì)相互作用,如各種糖類、有機(jī)酸、色素等,從而使基質(zhì)復(fù)雜的樣品能實(shí)現(xiàn)快速、高效和經(jīng)濟(jì)的分離提取,可針對茶葉基質(zhì)干擾嚴(yán)重的特點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化。

研究擬利用QuEChERS前處理技術(shù),結(jié)合IC-MS/MS法同時(shí)檢測茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸,通過優(yōu)化儀器參數(shù)、改進(jìn)前處理方法,建立無需衍生化的茶葉中草甘膦和AMPA檢測方法,以期提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草甘膦、氨甲基磷酸標(biāo)準(zhǔn)品:純度99.0%,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;

內(nèi)標(biāo)13C2,15N-草甘膦:純度97.1%,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;

氫氧化鈉:優(yōu)級純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

試驗(yàn)用水為超純水;

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、石墨化炭黑(GCB):美國Supelco公司;

茶葉:市售。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四極桿質(zhì)譜儀:TSQ Altis型,美國賽默飛世爾科技公司;

高壓離子色譜儀:Thermo ICS-5000型,配EGC淋洗液發(fā)生器、輔助泵、AS-AP 自動(dòng)進(jìn)樣器、ASRS300 2 mm陰離子抑制器、電導(dǎo)檢測器,美國賽默飛世爾科技公司;

離子色譜柱:IonPac AS11-HC型,4 μm×2 mm×250 mm,美國賽默飛世爾科技公司;

離心機(jī):Centrifuge 5810型,艾本德中國有限公司;

渦旋儀:IKA MS3 digital型,德國IKA公司;

電子天平:ME 204型,梅特勒—托利多儀器上海有限公司;

去離子水發(fā)生器:Milli-Q型,美國Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 前處理方法

(1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:分別取草甘膦、氨甲基膦酸和內(nèi)標(biāo)13C2,15N-草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品,用超純水溶解并配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用超純水梯度稀釋成質(zhì)量濃度為5,10,20,50,100,150,200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線。

(2) 樣品處理:將茶葉樣品粉碎過網(wǎng)篩,稱取5 g 樣品,加入同位素內(nèi)標(biāo)工作液,用20 mmol/L NaOH水溶液定容,渦旋1 min,超聲提取20 min,4 000 r/min 離心5 min。取2 mL 上清液加入凈化劑(150 mg PSA、15 mg C18、15 mg GCB),渦旋1 min,過0.22 μm水相濾膜,IC-MS/MS檢測。

1.3.2 離子色譜條件 采用AS11-HC-4 μm(2 mm×250 mm)離子色譜柱;淋洗液濃度為35 mmol/L NaOH 溶液,等度淋洗,流速為0.35 mL/min;AERS 2 mm抑制電導(dǎo)檢測器,抑制電流為70 mA,抑制器再生水流速1 mL/min。柱溫25 ℃,進(jìn)樣量600 μL;初始30 s后,通過六通閥將流量注入離子源[16]。

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子源為加熱ESI源,質(zhì)譜掃描方式為負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),噴霧電壓2 500 V,離子傳輸管溫度350 ℃,霧化器溫度450 ℃,其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM參數(shù)?

1.4 方法學(xué)考察

用峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸,得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)[28]。將陰性茶葉基質(zhì)提取液逐級稀釋獲得草甘膦和氨甲基膦酸的檢出限(LOD,S/N≥3)和定量限(LOQ,S/N≥10)。取茶葉樣品陰性基質(zhì),分別添加1,2,10倍LOQ的草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每個(gè)加標(biāo)水平平行6次,計(jì)算平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.5 數(shù)據(jù)采集和分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,分別通過Xcalibur、Tracefinder進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集和草甘膦及氨甲基膦酸的定性定量分析。應(yīng)用SAS 9.0、GraphPad Prism 5和Design-Expert 11軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

草甘膦和氨甲基膦酸在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜信號響應(yīng)值高于正離子模式,因此選擇負(fù)離子模式進(jìn)行分析。分別對兩種化合物及其穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件包括錐孔電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。草甘膦和氨甲基膦酸的質(zhì)譜特征碎片離子見圖1。

圖1 草甘膦和氨甲基膦酸的質(zhì)譜特征碎片離子

2.2 離子色譜條件優(yōu)化

比較兩種陰離子分析柱IonPac AS16-9 μm(4 mm×250 mm)和AS11-HC-4 μm(2 mm×250 mm)對草甘膦和氨甲基膦酸的分離效果。結(jié)果表明,草甘膦在兩種陰離子柱中均呈良好的峰型,氨甲基膦酸在IonPac AS16中峰展寬,有明顯的拖尾,在AS11-HC中具有較好的保留,峰型良好。從草甘膦和氨甲基膦酸的結(jié)構(gòu)來看,草甘膦中額外存在的羧酸基團(tuán)使其在離子色譜柱上的保留能力比氨甲基膦酸的大。因此,選擇陰離子柱AS11-HC-4 μm(2 mm×250 mm)。

圖2 草甘膦和氨甲基膦酸的總離子流圖和提取離子色譜圖

2.3 提取條件的選擇

草甘膦水溶性極強(qiáng),不溶于有機(jī)溶劑。目前用于草甘膦提取的溶劑主要有水、堿溶液、酸溶液等[1],SN/T 1923—2007等現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中多采用超純水作為提取溶劑。但由于離子色譜對樣品提取液的離子強(qiáng)度較為敏感,進(jìn)而影響后續(xù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度,因此需要探索適合IC-MS/MS茶葉中草甘膦和AMPA的提取方法。分別選擇超純水、NaOH水溶液(10,20,30 mmol/L)作為提取溶劑,同時(shí)比較振蕩提取和超聲波輔助提取兩種方式,考察不同提取溶劑和提取方式對草甘膦和AMPA提取效率的影響,結(jié)果見圖3。采用堿性溶液作為提取溶劑,有利于將被茶葉有機(jī)質(zhì)結(jié)合的草甘膦和AMPA變成離子形態(tài),提高回收率。隨著NaOH濃度的提高,草甘膦和AMPA的回收率隨之提高,當(dāng)采用20 mmol/L的NaOH溶液提取時(shí),二者的回收率達(dá)最大值,繼續(xù)增大NaOH濃度,草甘膦的回收率趨于平穩(wěn),AMPA的回收率有所降低。與振蕩提取相比,超聲輔助提取下茶葉中草甘膦和AMPA的回收率升高,可能與草甘膦為內(nèi)吸性農(nóng)藥有關(guān)[1]。因此,采用20 mmol/L的NaOH水溶液超聲輔助提取的方法。

圖3 提取條件對茶葉基質(zhì)中草甘膦和氨甲基磷酸回收率的影響

2.4 凈化方式的選擇

茶葉中豐富的色素、多糖、茶多酚等內(nèi)源性物質(zhì)對草甘膦和氨甲基磷酸IC-MS/MS檢測結(jié)果影響較大,茶葉基質(zhì)的有效凈化是排除假陽性結(jié)果的關(guān)鍵[9]。目前對于草甘膦、氨甲基膦酸凈化多使用固相萃取柱,SN/T 1923—2007等前處理均采用陽離子交換柱(CAX)凈化,使用CAX小柱時(shí)不能采用真空泵抽氣,必須采用常壓過柱方式,不得使小柱干涸,需要多次調(diào)節(jié)樣品提取液的pH值,且固相萃取柱價(jià)格較高[9]。試驗(yàn)采用吸附劑(PSA、C18和GCB)對茶葉提取液進(jìn)行凈化,在前期單因素分析基礎(chǔ)上[7],根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,以目標(biāo)物回收率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),對凈化劑用量進(jìn)行優(yōu)化,考察不同凈化劑對茶葉基質(zhì)凈化效果的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 吸附劑凈化對茶葉基質(zhì)中草甘膦和氨甲基磷酸回收率的影響

由圖4可知,PSA和GCB用量的等高線為橢圓形,交互作用顯著,C18用量與二者的交互作用均不明顯。PSA可有效去除樣品中的糖、有機(jī)酸、脂肪酸等極性化合物,而草甘膦和氨甲基膦酸也屬于強(qiáng)極性化合物,過多的PSA會(huì)對二者產(chǎn)生吸附;C18可吸附脂肪等非極性物質(zhì);GCB可吸附色素、甾醇等[7]。綜合樣品的凈化效果及目標(biāo)化合物的回收率,最終確定加入150 mg PSA、15 mg GCB和15 mg C18對茶葉基質(zhì)進(jìn)行凈化。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

采用茶葉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)(ME)[32],ME>0為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME<0為基質(zhì)抑制效應(yīng),0≤|ME|≤20%為基質(zhì)對待測物的信號干擾程度較低,|ME|≥50%為基質(zhì)效應(yīng)干擾強(qiáng)烈[26,32]。如圖5所示,未凈化時(shí)茶葉基質(zhì)中草甘膦和氨甲基膦酸表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng),尤其是氨甲基膦酸,可能是由于茶葉中氨基酸、色素或類似結(jié)構(gòu)的干擾所致[8]。凈化后基質(zhì)效應(yīng)顯著降低,說明凈化是必要且有效的,茶葉中草甘膦的ME<15%,基質(zhì)干擾較低,氨甲基膦酸的ME為24%～29%,存在中等程度的基質(zhì)效應(yīng),可采用矩陣匹配曲線來減少茶葉樣品中復(fù)雜成分對定量過程的不利影響。

圖5 草甘膦及氨甲基膦酸在4種茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)

2.6 方法學(xué)評價(jià)

2.6.1 線性范圍、檢出限與定量限 由表2可知,草甘膦和AMPA在5～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)均>0.998。草甘膦和AMPA的檢出限均為0.05 mg/kg,定量限為0.10 mg/kg。茶葉中草甘膦的最大殘留限量為1 mg/kg,試驗(yàn)方法靈敏度可以滿足GB 2763—2021的要求。

表2 草甘膦和氨甲基膦酸的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6.2 特異性 如圖6所示,茶葉基質(zhì)成分未對草甘膦及氨甲基膦酸檢測造成干擾,無雜峰干擾,方法的特異性良好。

圖6 方法的特異性

2.6.3 回收率與精密度 為考察試驗(yàn)方法在不同茶葉類型中的適用性,按制茶工藝選取空白綠茶、紅茶、白茶和普洱茶樣本,進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),方法的回收率及精密度見表3。由表3可知,草甘膦和氨甲基膦酸的平均加標(biāo)回收率分別為61.2%～104.9%,61.5%～83.2%,RSDs均<20%,符合GB/T 27404—2008 的要求。

表3 不同茶葉基質(zhì)中草甘膦和氨甲基膦酸的回收率和精密度

2.7 實(shí)際樣品分析

采用試驗(yàn)方法對市售綠茶(23份)、紅茶(3份)、白茶(2份)、普洱茶(2份)共30批次茶葉樣本進(jìn)行測定,其中1批次綠茶樣品中檢出草甘膦殘留,其含量為0.074 mg/kg。試驗(yàn)方法操作簡便易行,無需衍生化,可以用于實(shí)際樣品的檢測。

3 結(jié)論

研究建立一種離子色譜串聯(lián)質(zhì)譜(IC-MS/MS)測定茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的方法。該方法前處理簡單,樣品經(jīng)簡單水提取和稀釋后基于IC-MS/MS進(jìn)行分析,無需衍生化或預(yù)濃縮。針對茶葉基質(zhì)干擾問題,利用分散萃取凈化代替固相萃取小柱,優(yōu)化凈化劑配比,同時(shí)結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)及基質(zhì)標(biāo)曲對數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)后,將茶葉基質(zhì)效應(yīng)降低至可接受范圍,各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)令人滿意。試驗(yàn)方法有機(jī)溶劑使用量小,無需衍生,符合綠色化學(xué)的理念,結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確,可操作性強(qiáng),且方法學(xué)評價(jià)結(jié)果滿足茶葉中草甘膦及其代謝物的日常檢測要求,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)可利用毛細(xì)管離子色譜技術(shù)對試驗(yàn)方法進(jìn)行持續(xù)改進(jìn)。