文宇萍 劉金熙 金 清 崔虎山

檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)是異型發(fā)酵乳酸菌的一種,因其非病原性、對人體無害被列為GRAS (generally recognized as safe),主要存在于蔬菜、牛乳、水果、傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜、乳制品等食品中[1-2]。檸檬明串珠菌能通過代謝產(chǎn)生CO2、風(fēng)味化合物、特殊活性物質(zhì)、細(xì)菌素及其他抑菌成分,具有潛在的益生效果,可作為食品發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中從而改善其風(fēng)味、功能性、組織狀態(tài)與貯存期,或作為生產(chǎn)功能性物質(zhì)的細(xì)胞工廠,直接應(yīng)用于食品工業(yè)與醫(yī)藥保健等領(lǐng)域[2]。

乳酸脫氫酶(lactate hehydrogenase, LDH)是乳酸菌催化丙酮酸產(chǎn)生乳酸的關(guān)鍵酶,根據(jù)催化產(chǎn)物不同,可將其分為D-乳酸脫氫酶(D-LDH)與L-乳酸脫氫酶(L-LDH)兩種,并分別催化丙酮酸生成互為鏡像的D-乳酸與L-乳酸[3]。乳酸的合成構(gòu)型由D-/L-乳酸脫氫酶基因的表達(dá)水平?jīng)Q定,因此目前的研究重點(diǎn)主要集中在乳酸菌的乳酸脫氫酶的編碼基因上[4]。檸檬明串珠菌作為泡菜等發(fā)酵的優(yōu)勢菌種,被認(rèn)為只含D-LDH,在發(fā)酵過程中生成的乳酸以D-型為主[1,5-6],由于人體缺乏D-乳酸的特異性代謝酶,過量食用會導(dǎo)致D-乳酸堆積,從而引起酸中毒等代謝障礙,危害人體健康[7-8]。

D-乳酸作為多種手性化合物合成的前體,在提高聚乳酸材料熱穩(wěn)定性等方面具有重要作用,高光學(xué)純度的D-乳酸能夠提高聚乳酸材料的性能,具有良好的生物降解性,可在微生物的分解作用下完全降解為二氧化碳和水,因此D-乳酸對環(huán)境保護(hù)具有重要意義[9-13]。此外,LDH也是乳酸菌催化苯丙酮酸生成苯乳酸(phenyllactic acid, PLA)的關(guān)鍵酶,與催化丙酮酸情況類似,L-LDH催化苯丙酮酸生成L-苯乳酸,D-LDH則催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸[14]。與L-苯乳酸相比,D-苯乳酸具有更高的抗菌活性,在食品、飼料等領(lǐng)域作為一種新型的生物防腐劑具有較大潛力[15- 16]。綜上,D-乳酸、D-苯乳酸在制藥、化妝品、化學(xué)與食品工業(yè)等領(lǐng)域受到了廣泛青睞[17]。檸檬明串珠菌也可作為生產(chǎn)高純度D-乳酸、D-苯乳酸的優(yōu)良菌種,具有廣闊的應(yīng)用前景。

檸檬明串珠菌基因組測序的完成為當(dāng)下研究提供了豐富的信息資源[18-19],但其功能注釋大多為初步推測,因此在功能研究方面或是利用基因工程技術(shù)對該菌株進(jìn)行改造方面發(fā)展較為緩慢[20]。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),檸檬明串珠菌KM20通過丙酮酸還原途徑生成D-乳酸,且LCK_00389為D-乳酸合成的關(guān)鍵基因編碼酶;LCK_00027與LCK_00222基因同樣在丙酮酸代謝通路中編碼D-乳酸脫氫酶的合成并參與D-乳酸的生成;LCK_00027與LCK_00222擁有極為相近的轉(zhuǎn)錄本豐度TPM (transcripts per million)值,由于不同基因編碼LDH的性質(zhì)可能會有較大差異,因此有必要對兩種酶進(jìn)行特性研究。研究擬以檸檬明串珠菌KM20為研究對象,通過基因工程手段對D-乳酸生成相關(guān)基因進(jìn)行基因重組、克隆,并在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá),經(jīng)純化后測定酶活,并對酶的最適pH值、最適溫度、底物特異性、潛在抑制性和動力學(xué)常數(shù)等進(jìn)行分析,以期為提高發(fā)酵食品安全性、生產(chǎn)高光學(xué)純度乳酸與苯乳酸提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬明串珠菌KM20:延邊大學(xué)食品與生物科學(xué)系食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室;

TOP 10、EscherichiacoliBL21(DE3)、質(zhì)粒pET-21a(+)、質(zhì)粒pET-15b:德國Novagen公司;

DNA提取試劑盒:美國Omega公司;

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒,限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III、Nde I和Xho I:日本TaKaRa公司;

BCA試劑盒:美國Pierce Biotechnology公司;

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒:北京索來寶生物科技有限公司;

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、丙酮酸、D-/L-乳酸、還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、苯丙酮酸鈉:美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀:PTC-225型,美國MJ Research公司;

Ni2+-NTA柱:17531901型,瑞典GE Healthcare公司;

SDS-PAGE電泳儀:1658001型,美國Bio-Rad公司;

超聲波細(xì)胞破碎儀:UCS-650型,杭州米歐儀器有限公司;

多功能熒光酶標(biāo)儀:SP-max3500FL型,上海閃譜生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),以檸檬明串珠菌KM20基因組為模板 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010471.1),分別以LCK_00027-F (5′-GA CACGAATTCATGAAGATCATCATGTACAACAC-3′)、LCK_00027-R (5′-GTGTCAAGCTTTTAGCGCAGAAT TTCGTTTTCGG-3′)、LCK_00222-F (5′-GCAGCCAT ATGACCAAAATCCTGATGACCAGTGTGCGCAGTGAT-3′)與LCK_00222-R (5′-GGATCCTCGAGTTAA ATTTCATTAACTGCCTGATGACCGCTAAT-3′)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其分子量,切膠回收后將純化的LCK_00027基因產(chǎn)物插入至pET-28a(+)質(zhì)粒(5 369 bp)的EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)上,獲得重組質(zhì)粒pETldhD-1(6 346 bp);純化的LCK_00222基因產(chǎn)物插入至pET-15b質(zhì)粒(5 708 bp)的Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)上,獲得重組質(zhì)粒pETldhD-2(6 701 bp)。分別將重組質(zhì)粒pETldhD-1、pETldhD-2轉(zhuǎn)化至TOP 10感受態(tài)細(xì)胞中,并從含卡那霉素(30 μg/mL)與氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中篩選重組體。

1.3.2 重組菌的蛋白表達(dá)及純化 將篩選得到陽性克隆質(zhì)粒pETldhD-1、pETldhD-2分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,42 ℃熱激后分別涂布至含卡那霉素(30 μg/mL)與氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單克隆菌落至對應(yīng)的LB肉湯中,37 ℃培養(yǎng)至OD值為0.6時(shí),分別添加0.5 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG),并于20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h,4 000 r/min離心10 min,棄上清,收集菌體,加入PBS緩沖液重懸,用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體細(xì)胞,破碎時(shí)間為15 min (開5 s,關(guān)5 s)。將破碎后的菌液于4 ℃、12 000 r/min離心5 min,得到上清液為粗蛋白。根據(jù)重組蛋白為多聚組氨酸標(biāo)簽這一性質(zhì),選用Ni2+-NTA柱親和層析的方法進(jìn)行純化。首先通過洗雜液(30,50 mmol/L咪唑,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液;pH 7.4)進(jìn)行兩步洗雜,再用洗脫液(500 mmol/L咪唑,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液;pH 7.4)緩慢洗脫,收集洗脫液作為純酶液,4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白樣品的表達(dá)與純化水平。

1.3.3D-LDH-1和D-LDH-2酶活力測定 分別通過丙酮酸還原與D-乳酸氧化兩種反應(yīng)測定酶活性。丙酮酸還原反應(yīng):向0.3 mL底物溶液(0.5 mmol/L NADH,10 mmol/L丙酮酸,0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液;pH 8.0)中加入0.01 mL純酶液進(jìn)行反應(yīng);D-乳酸氧化反應(yīng):向0.3 mL底物溶液(5 mmol/L NAD+,75 mmol/LD-乳酸,0.1 mol/L甘氨酸—?dú)溲趸c緩沖液;pH 11.0)中加入0.01 mL純酶液進(jìn)行反應(yīng)。兩種反應(yīng)混合物均在指定溫度和時(shí)間下孵育,并于340 nm處測定吸光度。定義每分鐘氧化1 μmol NADH或每分鐘還原1 μmol NAD+所需酶量為一個(gè)酶活力單位(U);每毫克酶蛋白所含的酶活單位數(shù)(U/mg)為比活力。使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。

1.3.4 酶反應(yīng)產(chǎn)物測定 以D-乳酸為底物,在酶的作用下進(jìn)行充分氧化反應(yīng),將反應(yīng)后的酶解液稀釋,并經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾,進(jìn)行高效液相色譜檢測。檢測條件[21]:色譜柱為Hypersil GOLD Amino (250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫30 ℃;流動相為乙腈—0.02 mol/L磷酸二氫鉀(V乙腈∶V磷酸二氫鉀為30∶70);流速1.0 mL/min;進(jìn)樣體積20 μL;紫外檢測器;檢測波長210 nm。

1.3.5 pH和溫度對D-LDH-1和D-LDH-2酶活力的影響 分別測定不同pH值緩沖液 (100 mmol/L磷酸鹽緩,pH 6.0～7.0、100 mmol/L Tris-HCl緩沖液,pH 8.0～10.0、100 mmol/L甘氨酸—?dú)溲趸c緩沖液,pH 11.0～13.0)對D-LDH-1和D-LDH-2酶活性的影響,探索酶最適pH值。在最適pH條件下,于10～50 ℃范圍內(nèi)測定溫度對D-LDH-1和D-LDH-2酶活性的影響,探索酶的最適反應(yīng)溫度。

1.3.6D-LDH-1和D-LDH-2的底物特異性和酶抑制劑測定 以與丙酮酸結(jié)構(gòu)相似的乙酰丙酸、苯丙酮酸鈉、α-酮丁酸、草酰乙酸、2-酮戊二酸和與D-乳酸結(jié)構(gòu)相似的蘋果酸為底物,在最適溫度與最適pH條件下,測定D-LDH-1與D-LDH-2的底物特異性,并以丙酮酸與D-乳酸作為底物反應(yīng)時(shí)的酶活性定義為100%。

為確定抑制劑對酶活性的影響,將D-LDH-1和D-LDH-2分別與濃度為0.1,1.0 mmol/L的金屬離子 (Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Na+)、SDS與尿素孵育,以未添加抑制劑對照組中酶的丙酮酸還原活性為100%。

1.3.7D-LDH-1和D-LDH-2動力學(xué)參數(shù)測定 在0.5 mmol/L NADH下分別測定不同丙酮酸濃度(1,2,3,4,5 mmol/L)下的酶活性;在10 mmol/L丙酮酸下測定不同濃度NADH (0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mmol/L)的酶活性。在5 mmol/L NAD+下分別測定不同D-乳酸濃度(10,20,30,40,50 mmol/L)的酶活性;在50 mmol/L乳酸濃度下測定不同濃度NAD+(1,2,3,4,5 mmol/L)的酶活性,并采用Lineweaver-Burk作圖法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各試驗(yàn)重復(fù)3次,使用SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,通過Origin 2018軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將提純后得到的目的基因分別插入到相應(yīng)質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)上獲得重組質(zhì)粒,并分別對其進(jìn)行雙酶切鑒定。在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳驗(yàn)證,所得目的基因與基因測序結(jié)果一致,表明基因克隆成功,獲得重組載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和純化后進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),檢測結(jié)果(圖1)表明,E.coliBL21 (DE3)/pETldhD-1與E.coliBL21 (DE3)/pETldhD-2分別在40.0,38.5 kDa處有單一蛋白條帶,無雜蛋白,表明重組蛋白表達(dá)純化成功。

M. 蛋白Marker 1. E. coli BL21 (DE3)/pETldhD-1粗酶液 2. E. coli BL21 (DE3)/pETldhD-1純酶液 3. E. coli BL21 (DE3)/pETldhD-2粗酶液 4. E. coli BL21 (DE3)/pETldhD-2純酶液

2.2 D-LDH-1和D-LDH-2酶活力分析

由表1可知,D-LDH-1粗酶液對丙酮酸的比活力為0.95 U/mg,純化后比活力達(dá)2.18 U/mg,提高約2.29倍;D-LDH-2粗酶液對丙酮酸的比活力為8.97 U/mg,純化后比活力達(dá)153.10 U/mg,提高約17.07倍。兩種酶經(jīng)純化后,以L-乳酸為底物時(shí)顯示并無活力。雖然兩種酶的編碼基因來自同一菌株,但活性差異較大,可能是因?yàn)槠浜塑账?、氨基酸序列不同。D-LDH-1酶活力較低,但略高于腸膜明串珠菌NCDO的D-LDH比活力(0.6,0.9 U/mg)[22];D-LDH-2酶活力較高,且高于植物乳桿菌LY-78的(65.35,0.41 U/mg)[23],但仍低于腸膜明串珠菌ATCC8293的D-LDH比活力(4 450 U/mg)[24]。D-LDH-1的回收率為19.65%,符合多數(shù)情況下酶的回收率<100%的情況;D-LDH-2的回收率為162.25%,可能是因?yàn)榇置敢褐心澄镔|(zhì)抑制了該D-乳酸脫氫酶的活性。

表1 D-LDH-1和D-LDH-2純化前后的酶活力

2.3 酶反應(yīng)產(chǎn)物分析

由圖2可知,50 mg/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品在7.567 min時(shí)檢測到明顯峰值。兩種酶以D-乳酸為底物進(jìn)行氧化反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物均在丙酮酸保留時(shí)間處檢測到明顯峰值,證明兩種酶是將D-乳酸氧化為丙酮酸的D-LDH。而以L-乳酸為底物進(jìn)行反應(yīng)所得產(chǎn)物在丙酮酸保留時(shí)間處并未檢出峰值,與酶活力測定結(jié)果相符。

圖2 HPLC檢測D-LDH氧化反應(yīng)生成丙酮酸

2.4 pH和溫度對D-LDH-1和D-LDH-2酶活力的影響

由圖3可知,D-LDH-1和D-LDH-2還原丙酮酸時(shí)的最佳pH均為8.0;當(dāng)pH>10時(shí),酶活力大幅下降,D-LDH-1和D-LDH-2的相對酶活力分別為16.79%,21.87%。兩種酶還原丙酮酸時(shí)的最佳pH值符合乳酸菌最適生長的pH范圍,與多聚組氨酸標(biāo)簽純化系統(tǒng)的最適pH環(huán)境相近,利于簡化純化過程[25]。在乳酸氧化過程中,由于D-LDH-1酶活力過小,未進(jìn)一步進(jìn)行表征;而D-LDH-2在乳酸氧化時(shí)的最佳pH為12.0,當(dāng)pH為13時(shí),其酶活力仍能保持在66.68%。當(dāng)pH為8.0～13.0時(shí),D-LDH-2中均能被檢測到乳酸氧化的酶活性,表明該酶對堿性條件具有較強(qiáng)的抵抗力,與腸膜明串菌中D-LDH相似[24]。兩種酶對pH均較為敏感,相對酶活力變化顯著(P<0.05)。

圖3 pH對D-LDH-1和D-LDH-2酶活力的影響

由圖4可知,D-LDH-1和D-LDH-2在丙酮酸還原時(shí)的最適溫度均為40 ℃;當(dāng)溫度<20 ℃或>50 ℃時(shí),D-LDH-1的相對酶活力均<50%,與文獻(xiàn)[26-27]的結(jié)果相符;當(dāng)溫度為50 ℃時(shí),D-LDH-2的相對酶活力仍保持在76.38%,說明D-LDH-2比D-LDH-1更耐高溫。在乳酸氧化過程中,D-LDH-2的最適溫度為30 ℃,與Hofvendahl等[28]的結(jié)論接近。兩種酶對溫度均較為敏感,相對酶活力變化顯著(P<0.05)。

圖4 溫度對D-LDH-1和D-LDH-2酶活力的影響

2.5 D-LDH-1和D-LDH-2底物特異性和酶抑制劑分析

由表2可知,兩種酶對不同底物展現(xiàn)了相似的底物偏好,其底物催化偏好為丙酮酸>草酰乙酸>苯丙酮酸鈉>2-酮戊二酸。與腸膜明串珠菌ATCC8293和發(fā)酵乳桿菌JN248的D-LDH相比,檸檬明串珠菌的D-LDH-1和D-LDH-2底物范圍并不廣泛,但相對特異性更高[29-30]。

表2 D-LDH-1和D-LDH-2對不同底物的相對酶活力

由圖5可知,Ca2+、Cu2+和Na+對兩種酶活性均有促進(jìn)作用,濃度為1 mmol/L的Cu2+使D-LDH-1的相對酶活力達(dá)到150.05%,D-LDH-2的相對酶活力高達(dá)162.46%;Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、尿素和SDS對兩種酶的活性均有抑制作用,尤其是濃度為1 mmol/L的Zn2+和SDS對兩種酶的相對酶活力抑制率高達(dá)100%,與文獻(xiàn)[24,31]的結(jié)論相同。兩種酶對SDS均比較敏感,推測是SDS使兩種酶的構(gòu)象發(fā)生變化,顯著降低了其催化能力,與文獻(xiàn)[32]的報(bào)道相符。

圖5 抑制劑對D-LDH-1和D-LDH-2酶活力的影響

2.6 D-LDH-1和D-LDH-2動力學(xué)參數(shù)分析

由表3可知,D-LDH-1對丙酮酸和NADH的Km值分別為2.98,0.32 mmol/L;D-LDH-2對丙酮酸和NADH的Km值分別為6.11,0.32 mmol/L。D-LDH-2對D-乳酸和NAD+的Km值分別為44.30,4.32 mmol/L。兩種酶對D-乳酸和NAD+的Km值均大于丙酮酸和NADH的,表明兩種酶對丙酮酸和NADH的親和力均高于乳酸和NAD+,更利于D-乳酸或D-苯乳酸的生成。此外,兩種酶對丙酮酸的Kcat/Km值分別為6.0×102,2.2×104L/(mol·s);D-LDH-2對D-乳酸的Kcat/Km值為65.0 L/(mol·s)。D-LDH-2對丙酮酸的Kcat值比D-LDH-1的大,且催化效率(Kcat/Km)也更高,表明D-LDH-2更適合D-乳酸或D-苯乳酸的生成。

表3 D-LDH-1和D-LDH-2的動力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論

研究以檸檬明串珠菌KM20基因組為模板,通過對兩個(gè)編碼D-乳酸脫氫酶的基因構(gòu)建質(zhì)粒并克隆至表達(dá)載體,并在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)后,分別對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,檸檬明串珠菌的兩個(gè)D-乳酸脫氫酶比其他一些乳酸菌的D-乳酸脫氫酶具有較高的比活力;兩種酶均對堿性環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力;Ca2+、Cu2+和Na+對兩種酶活力均有促進(jìn)作用,Zn2+和SDS則對兩種酶活力高度抑制。后續(xù)可比較純酶與原始菌株的轉(zhuǎn)化效率,還可根據(jù)其酶學(xué)特性研究D-乳酸脫氫酶在發(fā)酵食品安全方面的應(yīng)用。