宋 鵬 李理想 趙 彪 王澤樂 孫興鑫

側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)是一種可產(chǎn)芽孢的兼性厭氧細(xì)菌,具有廣譜抑菌活性[1],可產(chǎn)生抗菌肽、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、芽孢菌胺、肽類抗生素、聚酮化合物等物質(zhì)[2],在植物抗逆促生[3]、降解重金屬[4]、改善根際微生態(tài)環(huán)境[5]和抑制食源性致病菌[6]等方面效果顯著,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。MTT商品名為噻唑藍(lán),其作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈,可以形成藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜,使用二甲基亞砜溶解后,測(cè)定溶液吸光值可以間接反映活細(xì)胞數(shù)量。有研究[7-8]表明,在107～109CFU/mL細(xì)胞濃度范圍內(nèi),吸光值與活細(xì)胞數(shù)成正比。利用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性靈敏度高、成本低廉、操作簡(jiǎn)便,主要用于藥物對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的毒性測(cè)定及細(xì)胞活性的測(cè)定[9-10]。菌株傳統(tǒng)優(yōu)化方法主要為線性回歸分析和正交試驗(yàn),其回歸精度低,不連貫,而響應(yīng)面法可以彌補(bǔ)以上不足[11-12],具有周期短、精度高的優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于食品、生物、化工等領(lǐng)域。

目前,微生物培養(yǎng)以活菌數(shù)為測(cè)定指標(biāo)的研究多采用比濁法,利用分光光度計(jì)測(cè)定菌液吸光值,然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出[13]。這種方法雖然快速簡(jiǎn)便,但是無法區(qū)分細(xì)菌是否存活,結(jié)論有一定的誤差。而利用MTT比色法測(cè)定微生物活菌數(shù)并進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化的研究尚未見報(bào)道。研究擬以側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)為研究對(duì)象,建立MTT比色法測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期為微生物活菌制劑發(fā)酵工藝優(yōu)化及規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

側(cè)孢短芽孢桿菌HA-2:CGMCC NO. 24130,河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院特色生物資源開發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室;

瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨、硝酸銨、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、噻唑藍(lán)、二甲基亞砜、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵母粉,10 g/L NaCl,初始pH 7.0;按2%接種量接種至裝有30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中,9層紗布封口,搖床轉(zhuǎn)速160 r/min,30 ℃培養(yǎng)18 h;

MTT溶液:配制pH 7.2、0.2 mol/mL的PBS緩沖液,121 ℃滅菌15 min待用;稱取0.5 g MTT用PBS緩沖液定容至100 mL,121 ℃滅菌15 min,現(xiàn)配現(xiàn)用,-4 ℃避光保存。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀:Infinite E Plex型,瑞士Tecan公司;

高速冷凍離心機(jī):5810R型,德國Eppendorf公司;

高壓滅菌鍋:SX-700型,日本TOMY公司;

潔凈工作臺(tái):SW-CJ-1BU型,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;

恒溫培養(yǎng)振蕩器:ZWYR-D2403型,上海智城分析儀器制造有限公司;

生化培養(yǎng)箱:TPH-160S型,寧波萊福科技有限公司;

pH計(jì):PP60型,德國Sartorius公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MTT比色法及與平板計(jì)數(shù)法線性關(guān)系的確定

將5 mL側(cè)孢短芽孢桿菌菌液加入35 mL生理鹽水中,4 ℃、3 500 r/min離心10 min,去除上清液。重復(fù)此清洗過程一次后,將離心所得菌泥復(fù)溶于5 mL生理鹽水中,制成菌懸液。取100 μL菌懸液于96孔板中,每個(gè)樣品重復(fù)6次,每孔加入20 μL MTT溶液靜置培養(yǎng)5 h,吸棄上清液,每孔加入150 μL二甲基亞砜,低速振蕩10 min,測(cè)定570 nm處菌液的吸光值[14]。

分別制備菌數(shù)為1×106,5×106,1×107,5×107,1×108,5×108,1×109CFU/mL的側(cè)孢短芽孢桿菌菌懸液10 mL于試管中。每支試管搖勻后平均分為A和B兩管。A管采用MTT比色法測(cè)定菌液的吸光值,將其作為線性擬合方程中的自變量,B管稀釋后涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂平板,統(tǒng)計(jì)活菌數(shù),將其作為線性擬合方程中的因變量,進(jìn)而建立MTT比色法與平板計(jì)數(shù)法的相關(guān)回歸方程。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 從基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件出發(fā),利用MTT比色法測(cè)定各單因素試驗(yàn)發(fā)酵液吸光值[15]。分別考察碳源(葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖)、氮源(硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨)和無機(jī)鹽(氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鉀)對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的影響。在最佳碳源、氮源及無機(jī)鹽的基礎(chǔ)上,分別研究碳源添加量(0～18.0 g/L)、氮源添加量(0～16.0 g/L)和無機(jī)鹽添加量(0～0.33 g/L),確定最佳培養(yǎng)基成分及其添加量。分別考察初始pH(3.5～10.5)、發(fā)酵溫度(24～39 ℃)、接種量(1.0%～8.0%)和磷酸二氫鉀添加量(0.5～7.5 g/L)對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的影響,確定最佳發(fā)酵條件。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化

(1) Plackett-Burman試驗(yàn):選取影響側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的7因素為自變量,發(fā)酵液中活菌數(shù)為響應(yīng)值,選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)。各因素選取高(+1)和低(-1)兩個(gè)水平,篩選顯著影響因子。

(2) 最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn):通過Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果中多個(gè)顯著影響因子的系數(shù)值確定步長(zhǎng)及方向,其因素系數(shù)值為正值選取高水平,負(fù)值選取低水平,以活菌數(shù)結(jié)果的最大值作為Box-Behnken試驗(yàn)起始中心點(diǎn)。以Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著因子作為自變量,發(fā)酵液中側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)多因素多水平的響應(yīng)面試驗(yàn),建立多元二次回歸數(shù)學(xué)方程擬合自變量與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,獲得側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的最佳發(fā)酵參數(shù)。

1.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過響應(yīng)面試驗(yàn)獲得的理論最佳發(fā)酵條件培養(yǎng)18 h進(jìn)行驗(yàn)證,得到的側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)平均值與理論最大值進(jìn)行比較,驗(yàn)證模型的可靠性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析和方差分析,采用Design-Expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT比色法與平板計(jì)數(shù)法的線性關(guān)系

由圖1可知,側(cè)孢短芽孢桿菌菌懸液濃度與活菌數(shù)的線性回歸擬合方程為y=3.113 5x-0.128 8,相關(guān)系數(shù)為0.999 7,說明MTT比色法與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果具有非常顯著和強(qiáng)的線性相關(guān)性,能夠準(zhǔn)確、快速反映側(cè)孢短芽孢桿菌的活菌數(shù),同時(shí)表明MTT比色法具有較好的實(shí)用性和可行性,可用于后續(xù)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的測(cè)定,與高瓊[16]的研究結(jié)果相似。

圖1 MTT比色法與平板計(jì)數(shù)法的線性關(guān)系

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 碳源 由圖2可知,以麥芽糖為碳源時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)顯著高于其他碳源的(P<0.05)。當(dāng)麥芽糖添加量為0～10.0 g/L時(shí),活菌數(shù)隨麥芽糖添加量的增加逐步增加,當(dāng)麥芽糖添加量為10.0～18.0 g/L時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)逐漸下降,可能與麥芽糖呈微弱酸性有關(guān),過多的麥芽糖會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液pH降低,不利于微生物生長(zhǎng)。這與吳麗媛[17]的結(jié)果一致,因此選擇麥芽糖最佳添加量為10.0 g/L。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 氮源 由圖3可知,蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨和硝酸銨可以促進(jìn)側(cè)孢短芽孢桿菌快速繁殖。以蛋白胨為氮源時(shí),活菌數(shù)達(dá)最大值3.72×108CFU/mL。隨著蛋白胨添加量的升高,側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)緩慢上升,當(dāng)添加量為8.0～10.0 g/L時(shí)活菌數(shù)最大,但無顯著性差異,隨后活菌數(shù)開始下降,與陳丹霞等[18]的結(jié)果相似。這可能是蛋白胨為微生物提供氮源、碳源、維生素、生長(zhǎng)因子等營養(yǎng)物質(zhì),可以促進(jìn)側(cè)孢短芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖。綜上,選擇8.0 g/L為最佳蛋白胨添加量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 無機(jī)鹽 由圖4可知,氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂和氯化鎂可促進(jìn)側(cè)孢短芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖,其中氯化鈣的促進(jìn)作用最為顯著,較氯化鎂提升了76.88%(P<0.05)。隨著氯化鈣添加量的增加,側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)顯著增加。當(dāng)氯化鈣添加量為0.17 g/L時(shí),其對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的促進(jìn)效果最佳,與李茂琳等[19]的研究結(jié)果一致。其原因可能與Ca2+的存在改變側(cè)孢短芽孢桿菌的細(xì)胞膜通透性,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)交換、酸堿度和滲透壓有關(guān)。因此,選擇0.17 g/L氯化鈣為最佳無機(jī)鹽添加量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.4 發(fā)酵溫度 由圖5可知,當(dāng)發(fā)酵溫度為24～34 ℃時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)逐漸上升,與側(cè)孢短芽孢桿菌在低溫條件下菌株生長(zhǎng)受到抑制有關(guān)。當(dāng)發(fā)酵溫度為34～39 ℃時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)逐漸下降,可能是由于側(cè)孢短芽孢桿菌胞內(nèi)熱敏性酶活性降低,導(dǎo)致代謝受阻。范海延等[20]發(fā)現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)溫度為30～35 ℃。因此,選擇最佳發(fā)酵溫度為34.5 ℃。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.5 接種量 由圖6可知,當(dāng)接種量為1.0%～6.0%時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)隨接種量的提高而增加,當(dāng)接種量為6.0%時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)最大可達(dá)3.73×108CFU/mL。當(dāng)接種量>6.0%時(shí),發(fā)酵液中初始菌體密度偏高,營養(yǎng)消耗過快,活菌數(shù)隨接種量的增加而減少,與楊旭等[21]的研究結(jié)果一致。因此,選擇6.0%為最佳接種量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.6 初始pH 由圖7可知,升高初始pH可促進(jìn)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)增加,當(dāng)pH為7.5時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)最大。而在偏堿性(pH 9.5～10.5)和偏酸性(pH 3.5～4.5)條件下,側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的生長(zhǎng)繁殖均受到抑制。劉蒲臨等[22]發(fā)現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌的最佳pH為6.0～8.0。因此,選擇最佳發(fā)酵初始pH為7.5。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.7 磷酸二氫鉀 由圖8可知,當(dāng)磷酸二氫鉀添加量為0～3.5 g/L時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)逐漸增加;當(dāng)添加量為3.5 g/L時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)達(dá)最大值(2.27×108CFU/mL),較優(yōu)化前提高了12.38%(P<0.05)。當(dāng)添加量>3.5 g/L時(shí),側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)減少。磷酸二氫鉀作為緩沖物質(zhì),在微生物發(fā)酵過程中對(duì)發(fā)酵液pH起緩沖作用,利于側(cè)孢短芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖,與卜雯麗等[23]的結(jié)果相同,其最佳添加量不同可能與不同菌株因其自身特性對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件具有一定的選擇性有關(guān)。因此,選擇3.5 g/L為磷酸二氫鉀最佳添加量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 Plackett-Burman試驗(yàn) 根據(jù)微生物生長(zhǎng)所需營養(yǎng)成分的基本特點(diǎn),結(jié)合前期單因素試驗(yàn),分別選取麥芽糖、蛋白胨、氯化鈣、磷酸二氫鉀添加量及發(fā)酵條件中發(fā)酵溫度、接種量和初始pH作為試驗(yàn)因素。各因素設(shè)2個(gè)水平見表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知,X1、X3、X6和X7是構(gòu)建模型的主要影響因素(P<0.05),因此選擇X1、X3、X6和X7進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)顯著性分析?

2.3.2 爬坡試驗(yàn) 為了逼近X1、X3、X6和X7的最大響應(yīng)區(qū)域,根據(jù)表3設(shè)計(jì)爬坡試驗(yàn)方案,試驗(yàn)結(jié)果見表4所示。在試驗(yàn)3條件下,側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)最高為8.13×108CFU/mL,因此選擇試驗(yàn)3條件作為試驗(yàn)中心點(diǎn)。

表4 爬坡試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 Box-Behnken試驗(yàn) 為確定X1、X3、X6和X7的交互作用,進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平見表5,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design-Expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸過程數(shù)據(jù)分析,建立二次響應(yīng)面回歸模型,得到二次多項(xiàng)式回歸方程:

(1)

表7 響應(yīng)面結(jié)果的方差分析?

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

由圖9可知,氯化鈣與磷酸二氫鉀之間交互作用較其他交互作用最弱。當(dāng)麥芽糖分別與氯化鈣、初始pH及磷酸二氫鉀交互作用,隨著氯化鈣添加量、初始pH及磷酸二氫鉀添加量的變化,麥芽糖的最佳添加量為9 g/L左右,氯化鈣添加量、初始pH及磷酸二氫鉀添加量分別為0.11～0.16,7.3～7.7,3.2～3.9 g/L;當(dāng)氯化鈣與初始pH交互作用時(shí),氯化鈣添加量與初始pH對(duì)活菌數(shù)影響成反比;當(dāng)初始pH與磷酸二氫鉀交互作用時(shí),活菌數(shù)極值點(diǎn)出現(xiàn)在初始pH為7.3～7.8,磷酸二氫鉀添加量為3.5 g/L或磷酸二氫鉀添加量為3.2～3.9 g/L,初始pH為7.5的范圍內(nèi)。由表7中F值可知,各因素對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的影響強(qiáng)弱為X1>X3>X7>X6,兩因素間除X3X7外,均對(duì)活菌數(shù)的影響顯著,兩因素間的正負(fù)效應(yīng)大小依次為X3X6、X1X6、X1X3、X6X7、X1X7、X3X7。

圖9 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

使用Design-Expert 10軟件分析得到各顯著因子的最佳組合為麥芽糖添加量8.75 g/L、氯化鈣添加量0.17 g/L、初始pH 7.07、磷酸二氫鉀添加量3.73 g/L,此條件下模型預(yù)測(cè)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)最高為8.25×108CFU/mL。在此基礎(chǔ)上重復(fù)3次試驗(yàn),測(cè)得側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)為(8.12×108±0.64) CFU/mL,為預(yù)測(cè)值的98.42%,表明該模型能夠很好地預(yù)測(cè)實(shí)際活菌數(shù)。

3 結(jié)論

以側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)為研究對(duì)象,通過MTT比色法與平板計(jì)數(shù)法測(cè)定建立了相關(guān)回歸方程。結(jié)果表明,側(cè)孢短芽孢桿菌菌懸液濃度與活菌數(shù)之間具有良好線性關(guān)系(R2>0.999),可用于側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的測(cè)定。側(cè)孢短芽孢桿菌培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件的最佳組合為麥芽糖添加量8.75 g/L、氯化鈣添加量0.17 g/L、初始pH 7.07、磷酸二氫鉀添加量3.73 g/L,優(yōu)化后發(fā)酵液中活菌數(shù)為8.12×108CFU/mL,較優(yōu)化前提高了3.02倍。后續(xù)將對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)抗菌肽、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等方面開展研究。