夏金濤 吳婉琴 朱松松 江 豐

隨著生活水平的提高,肥胖現(xiàn)象呈逐年上升的趨勢。肥胖不僅影響個人形象,還會導(dǎo)致高血壓、糖尿病等心血管疾病的發(fā)生[1]。由于藥物減肥存在作用機(jī)制明確,見效快的特點(diǎn),近年來,在保健食品中非法添加西藥成分的情形頻頻發(fā)生[2-9]。針對這種現(xiàn)象,國家食品藥品監(jiān)督管理局和國家市場監(jiān)督管理總局先后發(fā)布了8個補(bǔ)充檢驗標(biāo)準(zhǔn),涉及39種減肥類非法添加物的檢測[10]。但這些檢驗標(biāo)準(zhǔn)僅能對靶向目標(biāo)物進(jìn)行分析,針對的物質(zhì)種類和數(shù)量明顯偏少,存在漏檢現(xiàn)象。一些不法商家利用這一漏洞,在暴利的驅(qū)使下,開始向減肥類食品基質(zhì)中添加補(bǔ)充檢驗標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)管以外、國家明令禁止的西藥成分的結(jié)構(gòu)衍生物[11-15]。由于這些新型結(jié)構(gòu)衍生物的毒理藥理學(xué)作用機(jī)制及服用劑量尚不明確,消費(fèi)者在不知情的情況下服用后將會對健康和生命安全造成嚴(yán)重的威脅。同時,這些新型結(jié)構(gòu)衍生物未經(jīng)批準(zhǔn)而非法應(yīng)用于食品中,給執(zhí)法部門的監(jiān)管帶來了巨大挑戰(zhàn)。

雙醋酚汀是一種臨床上常用的輕瀉劑類藥物,在腸道內(nèi)經(jīng)腸液堿解產(chǎn)生刺激性更強(qiáng)的酚汀,從而加速腸道的蠕動而發(fā)揮導(dǎo)瀉作用。近年來,雙醋酚汀作為減肥類非法添加物在食品中常被檢出[16]。為鑒別食品中非法摻雜雙醋酚汀等化合物的不當(dāng)行為,國家市場監(jiān)督管理總局已發(fā)布了BJS202209《食品中雙醋酚丁等19種化合物的測定》補(bǔ)充檢驗方法對其進(jìn)行檢測。由于在食品中添加新型化學(xué)物質(zhì)的隱蔽性強(qiáng),該法遠(yuǎn)不能滿足實際檢測的需要,如最近已有雙酚沙汀在果味型果凍中被檢出的報道[17]。研究擬通過高分辨質(zhì)譜對市售及網(wǎng)購的24批次明示或暗示具有減肥功效的食品進(jìn)行篩查,在2批次果凍中發(fā)現(xiàn)了一種未見能獲批作為食品添加劑的新型雙醋酚汀類衍生物,經(jīng)同位素質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖、核磁共振波譜圖解析及從頭合成策略比對分析研究,確證該新型非法添加物,以期為監(jiān)管部門及時做到快發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

薄層層析硅膠板:TLC Silica gel 60 F254,德國默克公司;

wilmad核磁管:5 mm,湖北熱安科技有限公司;

柱層析硅膠:37～48 μm,青島海洋化工廠;

微孔濾膜:0.45 μm,天津津騰實驗設(shè)備有限公司;

果味型果凍等:網(wǎng)購;

氘代氯仿CDCl3:D含量99.8%,美國CIL公司;

氘代二甲亞砜DMSO-d6:D含量99.8%,美國CIL公司;

乙腈:色譜純,德國默克公司;

甲酸:質(zhì)譜純,美國 Fisher Scientific 公司;

三苯甲基四(五氟苯基)硼酸鹽:純度98%,上海阿拉丁試劑有限公司;

5-氯靛紅(純度98%)、吡啶(純度99.5%)、苯酚(純度≥99.5%):上海麥克林生化科技有限公司;

6-氯靛紅:純度99.82%,上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司;

雙醋酚汀:純度98%,天津阿爾塔科技有限公司;

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超高效液相色譜儀:ExionLCTMAD型,上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司;

高分辨質(zhì)譜儀:Triple TOF TM 5600+型,上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司;

全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振波譜儀:AVANCE Ⅲ型,600 MHz,德國Bruker公司;

高效液相色譜儀:Waters e2695型,美國Waters公司;

套裝加熱型磁力攪拌器:MS-H280-Pro型,北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司;

勻質(zhì)機(jī):D-500型,北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:Hei-Vap Expert ML型,德國Heidolph公司;

超聲輔助萃取儀:S 180H型,德國Elma公司;

電子天平:ME 204型,精度0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司;

去離子水發(fā)生器:Milli-Q型,美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 高分辨質(zhì)譜分析

(1) 供試品溶液制備:稱取 1.0 g供試樣品,用剪刀剪碎于50 mL比色管中,加入30 mL乙腈,40 ℃超聲輔助萃取15 min,冷卻,用乙腈定容至50 mL,靜置5 min,取上清液過0.45 μm濾膜,備用。

(2) 色譜條件:流動相A為含0.1%甲酸—水溶液,B為乙腈;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣體積5 μL;柱溫40 ℃;色譜柱C18色譜柱(100 mm×2. 1 mm,1.7 μm);梯度洗脫程序:0～2 min,5% B;2～14 min,5%～95% B;14～17 min,95% B;17～20 min,5% B。

(3) 質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI源)正離子掃描模式采集數(shù)據(jù);離子源溫度550 ℃;電噴霧電壓5 500 V;霧化氣壓力和輔助氣壓力均為344.7 kPa;氣簾氣壓力241.3 kPa;去簇電壓60 V;碰撞能量35 V;碰撞能量范圍±15 V;掃描范圍:一級質(zhì)譜50～1 100 Da,二級質(zhì)譜50～1 100 Da。

1.2.2 NMR結(jié)構(gòu)分析

(1) 供試品制備:取約100 g樣品于1 000 mL塑料量杯中,用勻質(zhì)機(jī)攪碎,分3次用300 mL乙腈超聲輔助萃提10 min,抽濾。濾液濃縮富集后,經(jīng)柱層析色譜純化(V乙酸乙酯∶V石油醚為35∶65)得到分析物約25 mg,經(jīng)高效液相色譜分析純度≥99%。

(2) 核磁測試條件:鎖場溫度298 K;1H-NMR脈沖序列zg30;譜寬(SWH)9.6 kHz,觀察道中心頻率偏置(O1P)4.8 kHz;13C-NMR脈沖序列zgpg30,譜寬(SW)120 kHz,觀察道中心頻率偏置(O1P)60 kHz;HSQC和HMBC分別采用HSQCEDETGPSISP2.3和HMBCGPLPNDQF標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序,采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣均為t2×t1=2 048×256,累加次數(shù)32。

1.2.3 雙醋酚汀疑似結(jié)構(gòu)的從頭合成 參照圖1,根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行疑似結(jié)構(gòu)中間體I的合成。

圖1 雙醋酚汀類似物的從頭合成技術(shù)路線

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集在Analyst TF 1.8.1 Software上進(jìn)行;非靶向篩查在Library View上進(jìn)行;數(shù)據(jù)分析在PeakView?2.2上進(jìn)行;質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理在Origin 9.0上進(jìn)行;NMR數(shù)據(jù)通過Topspin 3.5 pl 7采集,譜圖處理在Mestrenova 14.0上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 減肥類保健食品中非法添加物篩查

應(yīng)用HRMS篩查條件,通過Triple TOF的IDA模式對24批次減肥類保健食品進(jìn)行篩查,結(jié)果在2批次果凍制品中發(fā)現(xiàn)了一種未見報道的新型雙醋酚汀類衍生物。測試條件下,該新型化合物的出峰時間為10.693 min(圖2)。對雙醋酚汀與其新型衍生物的同位素質(zhì)譜圖分析發(fā)現(xiàn),與雙醋酚汀的同位素質(zhì)譜圖(圖3)相比,新型衍生物質(zhì)荷比436.09峰面積與質(zhì)荷比438.08峰面積之比約為3∶1、質(zhì)荷比437.10峰面積與質(zhì)荷比439.09峰面積之比也約為3∶1,結(jié)合氯元素的天然同位素35Cl和37Cl豐度比為3∶1,推測未知非法添加物可能含有氯原子取代。對雙醋酚汀與其新型衍生物的二級質(zhì)譜圖(圖4)分析發(fā)現(xiàn),將新型衍生物母離子質(zhì)荷比436.09、子離子質(zhì)荷比300.04/258.03/230.03與雙醋酚汀母離子質(zhì)荷比402.13、子離子質(zhì)荷比266.08/224.07/196.07比對,新型衍生物比雙醋酚汀相對分子質(zhì)量多34,表明該新型衍生物疑似為雙醋酚汀的單氯取代物。但氯原子在雙醋酚汀上的取代位置經(jīng)質(zhì)譜不能明確分析得出,因此有必要借助核磁測試明晰化合物的結(jié)構(gòu)。

圖2 雙醋酚汀類似物的非靶向篩查總離子

圖3 雙醋酚汀及其類似物5-Cl雙醋酚汀的一級同位素質(zhì)譜圖

圖4 雙醋酚汀及其類似物5-Cl雙醋酚汀的二級質(zhì)譜圖

2.2 疑似物的核磁譜圖分析

取雙醋酚汀和供試樣品各約15 mg,用DMSO-d6溶解,上機(jī)檢測。結(jié)果表明,疑似物的1H NMR和13C NMR分別為1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ11.00(s,1H),7.41(d,J=2.1 Hz,1H),7.33(dd,J=8.3,2.2 Hz,1H),7.23～7.18(m,4H),7.15～7.09(m,4H),7.01(d,J=8.3 Hz,1H),2.25(s,6H);13C NMR(151 MHz,DMSO)δ178.0,169.6,150.2,140.8,139.0,135.2,129.6,129.2,126.8,126.4,122.5,112.2,62.0,21.3。經(jīng)與雙醋酚汀的1H NMR對比(圖5),從氫譜中可見δ11.00(s,1H)為活潑NH;從δ7.41(d,J=2.1 Hz,1H),7.33(dd,J=8.3,2.2 Hz,1H)與7.01(d,J=8.3 Hz,1H)的耦合裂分情況判斷這3個氫原子為同一自旋體系;δ2.25(s,6H)為乙酸酐上的甲基信號;通過將1H NMRδ7.23～7.18(m,4H),7.15～7.09(m,4H)信號和13C NMRδ129.2,122.5的信號強(qiáng)度與雙醋酚汀的13C NMR對比,可知疑似物的氯原子取代應(yīng)發(fā)生在吲哚啉骨架5號或6號位,其具體位置通過核磁手段還無法確定。由于疑似物的合成步驟并不繁瑣,因此通過從頭合成策略對參照物進(jìn)行制備,通過核磁氫譜比對來精準(zhǔn)確證化合物的結(jié)構(gòu)。

圖5 雙醋酚汀及其類似物5-Cl雙醋酚汀的1H NMR和13C NMR譜圖

2.3 疑似物的從頭合成

參照1.2.3方法對5-氯雙醋酚汀和6-氯雙醋酚汀進(jìn)行合成,得到5-氯雙醋酚汀0.80 g,核磁數(shù)據(jù)與2.2的一致;6-氯雙醋酚汀0.75 g,其核磁數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)為1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ11.02(s,1H),7.35(d,J=8.1 Hz,1H),7.24～7.16(m,4H),7.16～7.09(m,5H),7.01(d,J=2.0 Hz,1H),2.26(s,6H);13C NMR(151 MHz,DMSO-d6)δ178.3,169.6,150.1,143.3,139.1,133.4,132.1,129.5,128.0,122.5(重合),110.8,61.4,21.3。HRMS(ESI):理論計算值C24H19NO5Cl[M+H]+:436.094 6;實際測試值:436.095 8。經(jīng)與疑似物進(jìn)行核磁氫譜比對(圖6)發(fā)現(xiàn),5-氯雙醋酚汀與疑似物氫譜完全一致,而6-氯雙醋酚汀與疑似物氫譜差別明顯。因此,疑似物的精細(xì)結(jié)構(gòu)被確證為5-氯雙醋酚汀。

圖6 疑似物提取物與合成的5-氯雙醋酚汀、6-氯雙醋酚汀的1H NMR對比圖

2.4 疑似物的譜學(xué)特征和譜峰歸屬

結(jié)合核磁共振二維譜,將5-氯雙醋酚汀和雙醋酚汀的結(jié)構(gòu)式及原子編號列于圖7,波譜學(xué)數(shù)據(jù)特征及原子歸屬見表1。由表1的一維(1H NMR、13C NMR和DEPT135)、二維核磁數(shù)據(jù)(HSQC、HMBC)可知,5-氯雙醋酚汀和雙醋酚汀的氫譜和碳譜化學(xué)位移基本保持一致。由于5-氯雙醋酚汀5號位存在氯原子取代,基于氯原子的誘導(dǎo)吸電子和共軛給電子效應(yīng),碳原子的化學(xué)位移略向低場移動,符合客觀規(guī)律。

表1 雙醋酚汀和5-氯雙醋酚汀的核磁數(shù)據(jù)及歸屬?

圖7 雙醋酚汀和5-氯雙醋酚汀的結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)論

通過對雙醋酚汀的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析,利用Triple TOF系統(tǒng)的IDA模式,一針進(jìn)樣即可對化合物的同位素質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖進(jìn)行分析,確認(rèn)疑似物為單氯代雙醋酚汀。通過核磁共振波譜確證疑似物的單氯代發(fā)生在吲哚啉苯環(huán)骨架5或6號位上,縮小了精準(zhǔn)識別的范圍。進(jìn)一步通過從頭合成策略對疑似物的可能結(jié)構(gòu)進(jìn)行制備,最終憑借氫譜比對確證了疑似物為5-氯雙醋酚汀。試驗建立了食品中非法添加物精準(zhǔn)識別確證的鑒定方法,并在兩份樣本中檢測出國家標(biāo)準(zhǔn)中未納入的非法添加物5-氯雙醋酚汀,需要引起相關(guān)部門的關(guān)注和重視。